专利名称：用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备的利记博彩app
技术领域：
本发明属纳米复合亲和膜的制备领域，特别是涉及用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备。
背景技术：
近年来，随着生命科学、生物技术、药学以及医疗技术的日益发展，人们对生物大分子的分离、提取和精制的要求也越来越高。亲和色谱是实验室和工业中常用的一种生物大分子分离纯化技术。它是根据生物大分子与特定的固载化配基之间的亲和力，即特异性的可逆结合和解离而使生物大分子得到分离。它具有操作条件温和、无污染、无相变等特点，膜分离过程设备简单、易于放大、成本低、分离速度快、可连续操作，在许多方面都得到了应用。
壳聚糖(cs)是天然聚合物，分子中含有极强的反应性基团氨基与羟基，具有优良的
耐溶剂性和耐碱性等优点。将其复合于各种材质的多孔膜上，能制成不同孔径的复合超滤膜。目前，壳聚糖聚合物大多用于制备渗透汽化(或叫渗透蒸发)复合膜，而用壳聚糖与合成高分子尼龙进行混纺，制作超滤复合膜尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲
和膜的制备，该方法操作简单，耗时较少，吸附量大；制备出的纳米亲和膜快速、简便、廉价、高效，可高效纯化巯基蛋白酶，适用于规模化生产。
本发明的用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备，包括
(1) 将体积比为9~12: 1的六氟异丙醇(1,1,1, 3, 3， 3-hexafluoroisopropano1)和甲酸混合液作为溶剂体系，混掺入反应容器内，温度为40 60'C，水浴振荡反应20~45min;
(2) 将尼龙6和壳聚糖粉末在搅拌条件下缓慢加入上述反应容器内，继续搅拌2~3 h至完全溶胀，其中尼龙6颗粒的质量浓度是5 8wt15/。，壳聚糖质量浓度为0 2wty。；
G)将上述反应容器置于水浴振荡器内，在回流冷凝下，缓慢加热至40~60 'C，振荡15h 30h至完全溶解，得尼龙6/壳聚糖纺丝液；
(4) 用注射器抽取尼龙6/壳聚糖纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调节纺丝参数进行电纺，静电压为10 18kv;接收屏采用铝箔接地接收，针头与接收屏的距离为10 20cm，得尼龙6/壳聚糖超细纳米纤维膜；
(5) 将收集到的膜依次利用烘箱、真空干燥器干燥；
4(6) 将干燥后的尼龙6/壳聚糖纳米纤维膜切成直径为47mm的圆形膜片，放入50 6(TC，浓度为10~15 wt。/。的NaOH溶液中活化20-30min;
(7) 活化后的尼龙6/壳聚糖纳米纤维膜，用热水洗数次后，放入到染料溶液中反应；
(8) 加入NaCl溶液处理，使染料吸附到尼龙6/壳聚糖纳米纤维膜上；
(9) 调节水浴温度，加入Na2C03进行固色反应；
(10) 冷却，依次用热水、甲醇、NaCl、尿素、双蒸水充分洗涤后，或保存于Tris-HCl缓冲液，得到以染料为配基的尼龙6/壳聚糖纳米纤维亲和膜。
所述步骤(1)六氟异丙醇(HIFP)的质量浓度为99%~100%,含水量小于0.1%。所述步骤(4)中的注射器规格为5ml，针头内径约为0.4 0.7mm;喷出流速为0.5 2ml/h。
所述步骤(5)中的系列千燥方法是先将纺出的膜室温下干燥12h，然后放入烘箱中9(TC干燥4 6h，最后放入真空干燥器中60 70'C干燥24h。
所述步骤(6)染料为染料CibacronBlueF3GA，浓度为5~15mg/ml。所述步骤(7)NaCl溶液处理是用20 30wt。/。的NaCl溶液在40 80'C水浴振荡处理20~45
min。
所述步骤(8)Na2C03固色反应是用25 30wt。/。Na2CO3在60 9(TC水浴振荡反应3~6 h。所述步骤(9)中的洗涤是用4(TC-5(TC热水、含量为99.5~100%的甲醇、2M NaCl、6M尿素洗涤，洗涤程度是所洗后的洗涤液为无色。
所制备的亲和膜应用于巯基蛋白酶的分离纯化应用。
本方法以尼龙6为主要纺丝材料，并掺入富含亲水性功能基团-OH、 -NH2的壳聚糖，通过调整溶剂及相关纺丝条件参数，成功的实现了混纺；利用所获得的纳米复合材料为原料，以染料为配基，制备出的纳米亲和膜快速、简便、廉价、高效，可高效纯化巯基蛋白酶，适用于规模化生产。
静电纺丝法是一种制备超细纤维的重要方法，它与传统的方法有着明显的不同，通过静电力作为牵引力，将聚合物溶液或熔体带上几千至几万伏高压静电，带电的聚合物液滴在电场力的作用下被拉伸。当电场力足够大时，聚合物液滴可克服表面张力形成喷射细流，细流在喷射过程中溶剂蒸发或固化，最终落在接收装置上，形成了类似无纺布状的纤维毡。用静电纺丝法制得的纤维比传统纺丝方法细得多，直径一般在数十纳米到数百纳米，最小直径可至1 nm。
静电纺丝方法可以把50多种不同的聚合物，例如聚酯、聚氨酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯醇、聚苯胺、聚丙烯腈等纺制成直径范围从小于几个纳米到超过Inm的超细纤维，所得到的静电纺丝纤维收集在负极板上沉积成非织造布。静电纺丝制备的尼龙6纳米纤维一方面可以制备高性能的锦纶纳米纤维，改善尼龙纤维的服用性能；另一方面将某些具有生物活性的天然高分子聚合物混掺如尼龙聚合物中混纺成的纤维能够兼具两者的优点，既有尼龙的韧性、耐磨性，又赋予了复合膜新的生物特性，在很多方面有着广泛应用。
膜基质材料在亲和膜的制备中具有重要的作用，因为它不但决定着所键合的间隔臂和配基种类，而且还直接决定着分离的效果。纤维素是自然界中含量最多的天然高分子，也是最早用于亲和分离的介质之一，由于纤维素分子含有大量的-OH,从而赋予纤维素良好的亲水性、生物相容性和可反应性，而且纤维素膜价格低廉，用于亲和分离时成本低，适合工业化应用。近年来，将纤维素运用于生化分离中越来越引起人们的广泛注意。有益效果
(1) 本发明的方法操作简单，耗时较少，吸附量大；
(2) 本发明所使用的原材料廉价易得，来源方便，本身含有丰富的可反应功能基团，无需改性处理，省时省力，减少了制备成本；便于大规模提取纯化；
(3) 本方发明制备出的纳米亲和膜快速、简便、廉价、高效，可高效纯化巯基蛋白酶，适用于规模化生产。
图1是静电纺丝制备的尼龙6/壳聚糖纳米纤维和经过处理得到的亲和膜扫描电镜照片A
为未经任何处理的尼龙6/壳聚糖纳米纤维；B为亲和膜；
图2是反应浓度的变化对木瓜蛋白酶吸附的影响曲线；
图3是对木瓜蛋白酶的动态吸附测试曲线。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备，包括(1)将体积比为9~12: 1的六氟异丙醇(1,1,1, 3， 3, 3-hexafluoroisopropano1)和甲酸混合液作为溶剂体系，混掺入反应容器内，温度为40°C，水浴振荡反应20 45min，其中六氟异丙醇的质量浓度〉99%;
(2) 将尼龙6和壳聚糖粉末在搅拌条件下缓慢加入上述反应容器内，继续搅拌2 3 h至完全溶胀，其中尼龙6的质量浓度是5 wt%，壳聚糖质量浓度为2 wt%;
(3) 将上述反应容器置于水浴振荡器内，在回流冷凝下，缓慢加热至40 'C，振荡15h 30h至完全溶解，得尼龙6/壳聚糖纺丝液；
(4) 用注射器抽取尼龙6/壳聚糖纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调节纺丝参数进行电纺，静电压为10 18kv;接收屏采用铝箔接地接收，针头与接收屏的距离为10 20cm，得尼龙6/壳聚糖超细纳米纤维膜；
(5) 先将纺出的膜室温下干燥12h，然后放入烘箱中90'C干燥4~6h，最后放入真空干燥器中60 70'C干燥24h;
(6) 将干燥后的尼龙6/壳聚糖纳米纤维膜切成直径为47mm的圆形膜片，放入50 60'C，浓度为10~15%的NaOH溶液中活化20-30 min;
(7) 活化后的尼龙6/壳聚糖纳米纤维膜，用热水洗数次后，放入到浓度为5~15mg/ml的染料Cibacron Blue F3GA溶液中反应；
(8) 用20 30wtM的NaCl溶液在4(TC水浴振荡处理20~45 min，使染料吸附到尼龙6/壳聚糖纳米纤维膜上；
(9) 调节水浴温度，用25 wt%Na2C03在90。C水浴振荡反应3~6 h;
(10) 冷却，依次用用5(TC热水、含量为99.5~100%的甲醇、2M NaCl、 6M尿素洗涤，双蒸水充分洗涤后，洗涤程度是所洗后的洗涤液为无色或保存于Tris-HCl缓冲液，得到以染料Cibacron Blue F3GA为配基的尼龙6/壳聚糖纳米纤维亲和膜。
实施例2
称取6组各O.lg纤维素亲和膜，加入的缓冲液和浓度分别为0、 0.5、 1.0、 1.5、2.0mg/ml的酶液中，37'C水浴振荡3h，测定吸附前后在280nm处的吸光度；算出吸附量最大的那个木瓜蛋白酶的浓度，用作下面实验。相同条件下用未经任何处理的纤维素膜作平行对比实验，测出非特异性吸附量，与亲和膜吸附量作对比。发现最适给酶量为2.0mg/ml。图2是亲和膜和未经处理过的尼龙6/壳聚糖纳米纤维对不同浓度木瓜蛋白酶的吸附曲线。
实施例3
将20张亲和膜叠成膜堆，装入膜桥。在室温下，首先以缓冲液平衡膜堆，然后将以缓冲液配成的木瓜粉溶液以适当的流速上样，接着以缓冲液冲洗膜堆，以除去膜上未被吸附的蛋白，直至流出液的吸光度A28Q值接近0，最后，用适当的洗脱液洗脱被吸附的木瓜蛋白酶，分管收集组分，每管组分体积为4ml，测定每个组分的吸光度A加值，以A28Q为纵坐标，体积为横坐标，得到木瓜蛋白酶的吸附洗脱曲线。图3是对木瓜蛋白酶的动态吸附测试曲线。
权利要求
1.用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备，包括(1)将体积比为9～12∶1的六氟异丙醇HFIP和甲酸混合液作为溶剂体系，混掺入反应容器内，温度为40～60℃，水浴振荡反应20～45min；(2)将尼龙6和壳聚糖粉末在搅拌条件下缓慢加入上述反应容器内，继续搅拌2～3h至完全溶胀，其中尼龙6颗粒质量浓度为5～8wt％，壳聚糖的质量浓度为0～2wt％；(3)将上述反应容器置于水浴振荡器内，在回流冷凝下，缓慢加热至40～60℃，振荡15h～30h至完全溶解，得尼龙6/壳聚糖纺丝液；(4)用注射器抽取尼龙6/壳聚糖纺丝液，固定在静电纺丝装置上，调节纺丝参数进行电纺，静电压为10～18kv；接收屏采用铝箔接地接收，针头与接收屏的距离为10～20cm，得尼龙6/壳聚糖超细纳米纤维膜，然后干燥；(5)将干燥后的尼龙6/壳聚糖纳米纤维膜切成圆形膜片，放入50～60℃，浓度为10～15wt％的NaOH溶液中活化20-30min；(6)将上述纤维膜，用热水洗数次后，放入到染料溶液中反应；(7)用20～30wt％的NaCl溶液在40℃～80℃水浴振荡处理20～45min，使染料吸附到尼龙6/壳聚糖纳米纤维膜上；(8)调节水浴温度，用25～30wt％Na2CO3在60℃～90℃水浴振荡反应3～6h；(9)冷却，洗涤，或保存于Tris-HCl缓冲液，得到以染料为配基的尼龙6/壳聚糖纳米纤维亲和膜。
2. 根据权利要求1所述的用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备，其特征在于所述步骤(1)六氟异丙醇HIFP的质量浓度为99%~100%,含水量小于0.1%。
3. 根据权利要求1所述的用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备，其特征在于所述步骤(4)中的注射器规格为5ml，针头内径约为0.4^0.7mm;喷出流速为0,5 2 ml/h。
4. 根据权利要求1所述的用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备，其特征在于所述步骤(4)中的干燥方法是先将纺出的膜室温下干燥12h，然后放入烘箱中9(TC干燥4 6h，最后放入真空干燥器中60 70'C千燥24h。
5. 根据权利要求1所述的用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备，其特征在于所述步骤(5)圆形膜片的直径为47mm。
6. 根据权利要求1所述的用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备，其特征在于所述步骤(6)染料为染料CibacronBlueF3GA,浓度为5~15 mg/ml。
7. 根据权利要求1所述的用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备，其特征在于所述步骤(9)中的洗涤是用40 50。C热水、含量为99.5~100%的甲醇、2~3 MNaCl、3 6M尿素洗漆，洗涤程度是所洗后的洗涤液为无色。
8. 根据权利要求1所述的用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备，其特征在于所述的纳米复合亲和膜应用于巯基蛋白酶的分离纯化。
全文摘要
本发明涉及用于快速高效分离纯化巯基蛋白酶的纳米复合亲和膜的制备，包括(1)将六氟异丙醇HFIP和甲酸混合液作为溶剂体系，混掺入反应容器内；(2)将尼龙6和壳聚糖粉末反应容器内；(3)置于水浴振荡器内，得尼龙6/壳聚糖纺丝液；(4)用纺丝液，进行电纺，得纳米纤维膜，干燥；(5)切成圆形膜片，活化；(6)洗数次后，放入到染料溶液中反应；(7)加入NaCl溶液处理；(8)加入Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>进行固色反应；(9)冷却，洗涤。本发明的制备方法操作简单，耗时较少，吸附量大；制备出的纳米亲和膜快速、简便、廉价、高效，可高效纯化巯基蛋白酶，适用于规模化生产。
文档编号B01D71/00GK101564656SQ20091005243
公开日2009年10月28日 申请日期2009年6月3日 优先权日2009年6月3日
发明者刘军芳, 张海涛, 曹旻君, 朱利民, 聂华丽 申请人:东华大学