微流控器件的利记博彩app

专利名称：微流控器件的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及微流控器件，以及使用该器件的系统和方法。本发明特别适合于聚合 酶链式反应(PCR)应用，且将便于参照此应用描述本发明。然而，将会理解，本发明中所述 的器件，系统，和方法也适合于其他应用。
背景技术：
人类基因组计划的完成引发了用于并行基因组分析的高通量平台的快速发展。现 在，有两种DNA微阵列被广泛用作高度并行的基因组分析平台用于全基因体表达谱分析 的微阵列，和用于单核苷酸多态性(SNP)检测及基因分型的微阵列。由于非标准化的数据 分析和解释方法，微阵列结果的验证还需要一定的步骤。定量逆转录PCR(qRT-PCR)常常被 用作验证基因表达谱研究的替代方法。而且，与实时PCR技术相比，微阵列技术的灵敏度和 特异性都低，并且因为使用微阵列技术时包含多个步骤，该技术所得结果存在差异性。在进 行SNP检测和基因分型时，PCR过程被用于在用熔解曲线技术或与寡核苷酸探针杂交分析 样品前对样品进行扩增。对于基因表达谱分析，理想的方法是将实时PCR的定量及敏感能 力与微阵列的高通量能力整合成单一平台，用于高度平行的基因组分析。对于多个基因目 标的并行分析，除了微阵列技术外，已经有一些整合了 PCR和微阵列技术的平台被开发出 来。这些平台多数是将固相PCR与微阵列平台相结合而成。但是，研究表明固相PCR的效 率低于液相PCR。已经有大量的努力用于开发用于快速的，高通量的，能分析大量的基因的，以PCR 为基础的生物芯片(biochips)。这些生物芯片(chips)通常包含多个小井，每个小井都可 以存留一种溶液。到目前为止已开发出的器件存在的问题包括使用人工的方法将PCR样 品加入PCR芯片的各个反应井之内的冗长沉闷；使用液体分配机械手将溶液加入小井内的 可观费用；或在一个凝胶点阵里面与核甘引物的固定有关的问题。而且，理想的高通量PCR 芯片应该是可以廉价生产的，是用完即可丢弃的，而且能在大的反应阵列范围内维持均勻 的温度。此外，迫切需要一个简单又廉价的加载样品和密封反应井的方法以减少使用芯片 的花费。高通量PCR芯片有两种类型的配置。第一种类型包含微型小室阵列或矩阵。这种 配置使用微流体的流道网络来将液态的样品在一次移液操作中加入到小室阵列中。典型 的，每个小室连接着用于加入样品的进口流道和用于气体排出的出口流道。然而，要使用机 械阀隔离和密封这些小室是复杂的，因为只有将每个微型小室的进口和出口流道都密封起 来才能避免PCR混合液在热循环的过程中蒸发掉，并防止PCR引物对之间的交叉污染。此 外，这种配置中进出口的流道占据了空间，限制了芯片上的小室的密度。第二种高通量PCR 芯片包含微型化的井板。这种配置可以实现高密度的微小井，同时在小井顶部上盖上薄的 盖子或密封剂就可以隔离和密封这些微小井。然而，样品加载和其他液体处理操作则需要 使用高精度的机械手，这样做昂贵并需要熟练的操作员。最近报导了一种包含三个小井的用完即丢的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料的芯片(Xiang, Q. ；Xu, B. ；Fu, R. ；Li, D. Biomed Microdevices 2005，7，273-279)。该芯片被用于 PCR，其中PCR混合液是用手工加入到小井里的(小井容积0. 9微升)，在这些小井上随后盖 上了矿物油以防止混合液蒸发。另一种已经被开发的用于PCR 的器件(Chaudhari，Α. M. ；ffoudenberg, Τ. M.； Albin, M. ；Goodson, K.E.Journal of Microelectromechanical Systems 1998,7, 345-355)使用微细加工的18个容器的阵列，其中采用PCR兼容的亚克力基胶带用玻璃盖密 封微型小室。Leamon等人报告了一种新颖的PicoTiterPlate 平台。在这个平台内有300，000 个反应体积为39. 5pL的容器，可同时用于固相的非对称的PCR(Leamon, J. H. ；Lee, W. L. ；Tartaro, K. R. ；Lanza, J. R. ；Sarkis, G. J. ；deffinter, A. D. ；Berka, J. ；Lobman, K. L. Electrophoresis 2003，24，3769-3777)。有少数研究者使用了微流体的液体分配方法在芯片上进行PCR。其中Mathies 等人(Lagally, E. ；Simpson, P. C. ；Mathies, R. A. Sensors and Actuators B 2000,63, 138-146)展示了可以在芯片上进行多重PCR。该方法使用机械阀阵列来加载样品和密封 小井，对PCR混合液进行微流体分配。Quake等人使用微流体技术将2微升的PCR混合液 分配到一个PDMS芯片上的400个独立的反应室中，该技术使用了 2，860个集成的液压阀 和气压泵(Liu, J. =Hansen, C. ；Quake, S. R. Anal Chem 2003，75，4718-4723)。在美国专利 20030138829中也描述了同样的技术。因此需要一种替代技术，使得允许许多密集隔开的反应容器在不需要昂贵的材料 和设备的情况下被快速的填充和密封。

发明内容
本发明提供了一种包含多个小井的微流控器件，每个小井可以被相当充分的充入 液体，不需要昂贵的单个加入样品，也不需要单独的隔离和密封各个小井来防止交叉污染 和样品蒸发。在一方面中，本发明提供了一种用于将液体分配到多个小井里的器件，该器件包 含a)具有多个小井的基底；b)盖子，覆盖在基底上，以在小井上方界定小井通向的顶隙；c)至少一个入口，用于使液体流入到顶隙中，将液体分配到各小井中；以及d)至少一个出口，用于与顶隙进行流体连通，以从顶隙中移除多余的液体，和/或 用于与顶隙流体连通，以在顶隙中施加减低的气压。在另一方面中，本发明提供了一个用于将液体分配到多个小井里的系统，包含a)如上所述的器件；b)装有将要分配的液体的储液器，该储液器经由阀门装置连接到上述的至少一个 入口，所述阀门装置用于控制液体从储液器到顶隙的流动。c)将减低的气压施加给上述的至少一个出口的装置。在另一方面中，本发明提供了一个使用上述器件或系统的方法，包含施以减低的 气压给所述或每个出口，使得液体通过所述或每个入口抽入顶隙中，用于分配到小井中。
在另一方面中，本发明提供了一个使用本发明所述的系统的方法，包含如下步 骤a)施以减低的气压到至少一个出口以使得器件的顶隙和小井中的压力低于储液 器的出口处的液体的压力；b)打开阀门装置，使得储液器中的液体离开储液器进入器件的顶隙和小井中。c)断开减低器件的顶隙和小井中的气压的装置与器件的顶隙和小井的流体连通。实现发明的最好方式本发明的器件，系统(装置)和方法提供了将液体分配入多个小井中，以及隔离和 密封这些小井的手段。本发明特别适合应用于免疫分析，基于细胞的分析和聚合酶链式反 应(PCR)，但并不局限于这些应用。在本文中，术语“小井”在本领域中有标准的含义。一般而言，一个小井可以是一 个用以留存液体的凹坑。该凹坑可以由去除部分固态物质而形成(比如在固体上腐蚀或雕 刻出来的凹坑)。该凹坑可以由模塑一种可固化的液体以产生占据该凹坑的固态物体而形 成(比如使用预先制好的模子以获得互补形状)。小井的形状可以由两个或以上的面来界 定。举例来说这些形状包括圆锥形，金字塔形，棱柱形以及由此截除而来的各种变化。在所 有情况下界定小井的形状都具有开口，以使得液体以及/或者气体可以通过所述开口进入 和/或离开小井。小井的开口可以是矩形(包括正方形)或圆形。优选地，如果合适的话， 开口尺寸大于小井的底表面的尺寸。优选的是小并形成为平顶方金字塔形，其中较大的方 形面作为小井的开口。本发明的器件，系统和方法适合应用于低，中，和高密度的小井。典 型的低密度应用在一个芯片上使用少于10个的反应小井。典型的中密度应用在一个芯片 上使用约10个和约100个之间的反应小井。典型的高密度的应用在一个芯片上使用多于 100个的反应小井。本发明的器件，系统和方法适宜使用的小井的容积介于0. IpL到3mL。 多个小井适宜均勻地分布在一定空间内，形成网格状或其他规则的阵列。尽管设计时本发明的器件可以单次或多次使用，但它们特别适合于单次使用。本 发明的器件适宜由相对便宜的材料制成，并且基本上不会与其将接触的物质起反应。那些 可以聚合的，交联的，和/或可以在存在相补充的形状，模子或模具的情况下固化的材料特 别适合于制作本发明的基底构件。这样的材料举例来说包括氨基甲酸乙酯，乳胶，乙烯树脂 和硅树脂。在一些应用中，比如基于荧光检测的分析中，适宜使用那些低自发荧光的塑料材 料以减少那些可能会与从小井内的混合液中发出的荧光相干扰的荧光噪声。本发明预期的 是本文描述的器件，系统和方法可以被用于可能使用基于荧光检测方法的分析(或准备用 于分析)。这种分析的例子是核酸材料的实时定量PCR扩增。在这种分析的一种实施方式 中，从光源来的光(此光可能已被带通滤波片过滤，以提供窄波长范围内的光)进入到器件 的小井中，而小井内有一种或几种对该波长范围敏感的物质。这(些)物质可能发出与该 敏感波长范围不一样的波长范围的荧光。此发射光(此光可能已被带通滤波片过滤，以提 供波长范围内的光)由探测器装置检测。该探测器装置可以在器件内或器件外。因此本发 明的器件比较适宜是做成可以让光进入到器件的小井内。更加适宜的是，本发明的器件被 制成可以让光进入和可以让光离开器件内的小井。在优选的实施方式中，该器件提供了让 光进入小井的手段和让光离开小井的手段。这种手段的例子是大致对某些波长的光透明的 盖子。这种手段的特定例子是玻璃盖片，且该玻璃较适宜具有较低的自发荧光。基于荧光检测的分析的例子是使用波长范围为465nm到495nm的光源(此光已经经过带通滤波片)， 并使用可以检测波长范围为515nm到555nm的发射光(此光已经经过带通滤波片)的探测 器装置。在本发明的那些其中该器件的顶隙被某种物质(例如一种已经固化的液态预聚合 物)密封了的实施方式中，该密封物较适宜也允许光进入和离开那些小井。一些可能适合 用于本发明的器件和系统的塑料的例子有聚丙烯(PP)，聚碳酸酯(PC)，聚甲基丙烯酸甲酯 (PMMA)和一些硅树脂材料。特别适宜的用于本发明的器件，系统和方法的塑料是聚二甲基 硅氧烷(PDMS)。适合于制造本发明的部件，尤其是基底构件的互补模子，较适宜使用微细加 工技术来制造。这种技术的例子是微放电加工(EDM)。可以用于制造互补模子的材料的例 子是不锈钢。本器件本身可以由多种材料所构成。在这个方面，一种材料的特性可以被赋予用 来形成本器件的某些部件的该材料。使得一种材料适合用于某部件的特性的例子包括柔 性，表面功能性，亲水性/疏水性，铸造的简易性以及材料成本。尽管一些材料可能被选择 来提供适合的与某物资反应的表面功能性，但所有的部件适宜于基本不和与其接触的化学 品/反应混合液发生反应。比较适宜的，用以构成本发明中的器件和系统的材料将是与所 选择的应用的条件相兼容的。例如，PCR技术要求在热源/散热器和每个反应小井之间进行 有效的热传导。因此在这种应用中的材料应当适宜于能有效的传热以及耐受热循环且不会 产生大的变形或熔化。某种材料的特性可以通过选择厚度等方式进行改变。在这些方面， PDMS代表了一种适合又适宜的材料。适宜的用以形成器件中刚性部件的材料包括金属，玻 璃和陶瓷。玻璃是用于本发明中的器件，系统和方法的特别适宜的刚性部件。更加适宜的 是，当本发明的器件包含两种或以上的材料时，其部件被用粘合材料联接起来。用于粘合 这些部件的材料比较适宜在液态下被使用以均勻的粘合两个部件的表面，且随后转变为固 态。一个使用此种粘合剂的方法的例子是旋转涂布。当器件是由玻璃和PDMS所制成时，其 部件可以用液态的PDMS预聚合物来粘合。在这点上，预聚合物的固化在两个部件之间形成 了半永久的粘合。在本发明的基底构件的适宜的实施方式中，基底构件包含刚性的玻璃层， 其通过固化的PDMS粘合至通过互补模子成型的PDMS层，其中PDMS层包含多个小井。本发明中的器件包含盖子，通常呈片状，覆盖在基底上并在小井开口上部界定顶 隙。此盖子比较适宜于用基本刚性的材料来制造。此盖子比较适宜是由平板玻璃制成的板 的形式。所界定的顶隙可以具有规则的形状。可以界定此顶隙的边界的规则形状的例子包 括矩形棱柱(包括正方形棱柱)和圆柱(圆柱的平的表面覆盖在那些小井上)。一个比较 适宜的规则形状的例子是矩形棱柱。此顶隙也可以具有不规则的形状。例如顶隙可能具有 一个梯形棱柱的形状，比如当盖板的内表面与通过连接基底构件上的由那些小井的开口所 形成的表面并不平行时界定的形状。不规则形状的另一个例子是一种复合的形状，一个这 样的例子是由半球形(该半球形在几何形状上可以对应于小于相同曲率的相应球体的表 面的一半-比如浅半球的情况)和圆柱形结合并使此复合形状的最深处盖在多个小井的大 致中心上。当希望靠近入口和/或出口定向顶隙的较深部分时，用以界定顶隙的不规则形 状可能也特别适宜于在本发明的一些实施方式中。在本发明的一些较适宜的实施方式中，顶隙不仅盖住该器件的所有小井而且完全 盖住器件中小井间的空间。顶隙较适宜于由一个连续的没有分割的空间区域构成。在一些 较适宜的实施方式中，直接位于顶隙在任何两个小井正上方的那部分之间的空间区域不被
7本器件的任何固态部件所分割。比较适宜的，任何两个小井开口之间的最短的流体连通的 距离大致等于该两个小井的开口之间的空间的最短距离。所界定的顶隙比较适宜于这样的 比例(特别是容积足够小)，即应用本发明的方法造成储液器中的相当大比例的液体移入 小井，而不存在从顶隙中的伴随而来的排出或抽出造成的液体的大量浪费。另一方面，所界 定的顶隙比较适宜于这样的比例(特别是容积足够大)，即应用本发明的方法造成从储液 器中流出液体基本上不受限制。本发明的器件的另一个比较适宜的特征是顶隙不宜太小以 至于当相当大比例的液体从储液器流出进入顶隙随后又从顶隙排出时，那些小井基本上未 被充满。在本发明的比较适宜的其中盖子是板状的一些实施方式中，顶隙的尺寸是这样的， 即小井开口和小井底部之间的距离与小井开口和盖板之间的距离大致相同。本发明部分地基于下述发现而预见的，即液体和/或气体向盖在多个小井上的顶 隙的移入易于受到与顶隙和小井流体相连的入口和出口的设计的影响。本发明所涵盖的此 设计方面包括比较适宜于是流道形式的入口的方向，形状和大小。在一些实施方式中，本器 件包含大致圆柱形的流道。在另一些更加适宜的实施方式中，本发明的器件的流道具有矩 形棱柱的形状(包括方形棱柱)。本发明的流道的形状可以是不规则的。例如，流道的末端 可能被修圆，或扩展，以减少所谓“边缘效应”。由此这些流道可以包含复合的形状。例如， 矩形棱柱和漏斗形可以结合起来形成流道的形状。比较适宜的是，当顶隙的边界被一个具 有角的形状(比如一个矩形棱柱)所大致界定的时候，这些流道设置为靠近任何两个或以 上的角。在本发明的一些较适宜的实施方式中，顶隙的边界被一个矩形(包括方形)棱柱 形状大致界定。在那些实施方式中，入口和出口流道每个都放置为接近于由矩形棱柱的三 个面相交产生的角。不希望受理论的限制，在实现本发明的一个方法的时候，这样的安排被 认为是便于在基本用液体充满小井后完全清空顶隙。本发明中的入口和出口可以用适当的方式设置，以提供让液体进入多个小井以 及，适当的时候，将液体移除出顶隙的手段。在一个实施方式中，入口和出口可以以流道形 式形成于基底或者盖子构件内。入口和出口也可能被置于垫片中，在一些实施方式中垫片 位于基底和盖子构件之间。入口可以由盖子构件内的一个洞形成。本发明中的每一个入口 或出口可以是独立地弯曲的，有角度的或者大致是直的。在一些实施方式中，入口和出口大 致是直的。适当的时候，入口和出口比较适宜于与界定与入口和出口相连的顶隙的边界的 形状的边沿垂直。比较适宜的，入口和出口被安排成相邻的入口和出口大致上互相垂直。不 希望受理论的限制，据信在实现本发明的一个方法的时候，这样的安排促进了，在液体中的 主要部分被排出顶隙之前，小井大致是充满的。比较适宜的，用于入口流道的入口的截面积 大于用于出口流道的出口的截面积。不希望受理论的限制，这样的安排可以允许在进行本 发明的方法期间在顶隙抽空之前，小井大致是充满的。在本发明的一些特别适宜的实施方 式中，器件包含了单个入口流道和三个出口流道。在这样的实施方式中，入口流道具有矩形 棱柱的形状，出口流道具有复合的形状——由矩形棱柱和漏斗形复合而成，其中出口流道 在该流道靠近顶隙的末端处的开口中变宽。本发明中的器件包括至少一个入口，在使用时，所述至少一个入口可以被连到储 存着将要分配的液体的储液器。该储液器将通常通过阀门构件连接到入口，该阀门控制着 液体和/或气体从储液器到器件的流通。储液器也将通常具有一个开口，通过此开口，储液 器可以被充入液体，且当液体通过打开的阀门从储液器中移入到器件中时，气体，比如空气或者惰性气体比如氮气可以通过此开口。阀门的操作可以是手动控制，例如用塞子，或是自 动控制，例如用电动控制的螺线管。比较适宜的，储液器的出口连接至阀门，该阀门提供控 制液体和/或气体从储液器到器件的流动的手段。这种控制液体和/或气体从储液器到器 件的流动的手段也使得在任何液体从储液器流到小井之前，顶隙和小井中的压力可以被减 低到一定的压力。一个较适宜的储液器的例子是这样的容器该容器在顶部大致敞开并且 有连到阀门的底部开口。该阀门的操作完全或部分地控制了包含在储液器中的液体和/或 气体从储液器流出的速度。储液器和器件比较适宜于互相连接起来。可以提供此连接的材 料是一段管子。比较适宜的，此管子使得所有从储液器出来的液体都进入器件的入口流道。 比较适宜的，管子的外部尺寸等于或者小于入口流道的内部尺寸。当连接储液器和器件的 装置是一段管子的时候，比较适宜的控制液体和/或气体从储液器流入器件的装置是“夹 管阀”。本发明的系统和设备也提供了用于使小井承受低于在储液器出口处的液体的压 力的装置。这种装置的例子是能将流体从一处转移到另一处的泵。这种泵可以通过移动液 体(例如吸水器)，机械装置(例如隔膜)或其它适合由本领域技术人员熟知的手段而起作 用。比较适宜的用于使小井承受低于在储液器出口处的液体的压力的压力的装置的例子是 无油叶片式真空泵。本发明中的系统期望的是与器件中的顶隙和小井流体连通的泵。比较 适宜的，使小井承受低于在储液器出口处的液体的压力的压力的装置能够在本发明的器件 的小井内提供小于20kPa的，更适宜的是小于15kPa的并且最适宜的是在约0. 2到1. OkPa 之间的压力。比较适宜的，本系统还提供了用于隔开本发明的器件与此泵的流体连通的装 置。这种装置的例子是阀门。这种阀门的操作允许能够维持泵和器件的顶隙之间的压力差。本发明中的系统比较适宜于包含可以将该器件置于其中的外罩，腔体或容器。因 此此外罩的尺寸将比器件大。这种外罩可以与储液器连接，并与使小井承受低于在储液器 出口处的液体的压力的压力的装置相连接。这种外罩比较适宜于是气密的或者至少是能 气密的。本发明中的系统和设备期望的是阀门提供操作地密封和开封此容器的装置的例 子。在这个方面，储液器以及用来减低容器内压力的装置可以被集成到容器的设计中，以至 于部件之间可以互相的流体隔离。这样的容器比较适宜是能够打开以移走器件，以及关闭 以密封容器。这样的容器可能包含用于支撑器件的支撑装置。比较适宜的，此支撑装置将 器件从容器的最底部升高，这样当执行本发明的方法的时候液体可以被从器件的顶隙清空 到容器中而不会反流。适合于构造这样的容器的材料包括金属，玻璃，陶瓷和塑料。特别适 宜构造此容器的材料是玻璃以及大致透明的塑料。一个这样的材料的例子是聚(丙烯酸树 脂)，或其衍生物。如果适合的话，此容器也可以包含由其他材料制成的密封件。该密封件 比较适宜于由弹性的固态材料制成，例如诸如橡胶之类的聚合物。在本发明的适宜的实施 方式中，该系统包含能耐受约0. 2kPa的内部压力和约101. 3kPa的外部压力而基本上不变 形的容器。本发明中的方法部分地基于下述发现而预见，即液体从储液器进入多个小井的分 配可以藉由在储液器出口处和小井中施加不同的压力以导致有一个总的力施加在液态上 影响其流动来完成。这种区分比较适宜于允许这些小井大致充满而不在小井中留下残余的 “气泡”。当储液器的出口连着节制液体和/或气体流出储液器的装置，比如阀门的时候，比 较适宜的是此装置开始是关闭的，这样顶隙和小井内的压力可以被减低到低于储液器出口处的压力而且不会有液体流出储液器。由此该器件的小井内的压力可以被减低以至于当节 制液体和/或气体流出储液器的装置打开的时候，小井会大致充满液体而不会残留部分的 气体留在小井中。比较适宜的，当小井正在被充满的时候，对小井继续施以低于在储液器 出口处的液体的压力的压力。在这个方面，当液体正在从储液器流入器件的顶隙和小井中 的时候，用以减低器件的顶隙和小井中的压力的装置可以继续在起作用。减低压力的装置 还可以在所有液体离开储液器后也继续起作用。特别是当小井容积小的时候以及/或者当 液体比较粘稠的时候，将液体充入小井中的传统方法会导致在小井中残留气体。这通常是 个不期望的特点。本发明规定该器件的那些小井大致充满从储液器分配来的液体。此处表 达的“大致充满”可以是指所有小井都被大致充到其容积，或者绝大部分的小井被充满，或 者两个意思都有。有一点是可以理解的施加于空间上不同的小井中的液体和/或气体上 的力是不同的。因此一个或以上的小井可以充入不同于其他一个或以上的小井的水平。当 在比较适宜的实施方式中，本发明的方法规定所有的小井都充入到同一水平，在另一些实 施方式中一个或多个小井可以不充到其他的一个或多个小井的相同的水平。本发明中的方 法也更适宜使得分配液体到多个小井不会导致在充入液体之前预先载入器件的小井中的 任何物质在器件内大量传入该器件的其他小井。本发明的器件，系统和方法特别适合于应 用于在器件的多个小井中预先载入了多种不同的物质。在那样的情况下，通常更期望一个 小井中的物质不会传到任何其他小井中。不希望局限于理论，可以理解的是，那些影响物质 是否发生从一个小井传到其他小井中的因素包括液体流入和流出顶隙的速度；小井内的 物质可混合/可溶解到液体内的程度；以及溶解于液体中的物质的特性。在一些实施方式 中，本发明中的方法比较适宜于规定液体流入和流出顶隙的速度足够快以至于该物质向该 液体中的扩散是可忽略的。比较适宜的，本发明中的方法规定在一个步骤中液体移入顶隙 和小井，并在紧接的步骤中顶隙中的液体被气体所替代。在本发明中的方法的比较适宜的 实施方式中，储液器中的液体的量足够大致上充满器件的顶隙和小井。在那些实施方式中， 储液器中的液体在减低的压力作用下被吸入到器件中。紧接着，已经被吸干了液体的储液 器提供从储液器流入器件的顶隙中的气体的源，由此替换顶隙中的液体。在比较适宜的实 施方式中，顶隙装有液体的时间很短以至于大致上没有预先载入的物质从一个小井转移到 其他小井。尽管本发明可以规定储液器装有液体的体积大于那些小井的总容积，但也可以 设想储液器中装有的液体的量等于，或者少于那些小井的总容积。此外，也可以设想在执行 本发明中的方法的时候，储液器里那些被分配入小井中的液体可以不让被完全抽干，而是 在小井被初步充入之后让顶隙可以保持充满液体一段时间。如果预先可能载入的物质不容 易大量地扩散或溶解到该液体中，或者当希望顶隙中的液体用密封剂来替换的话，这种方 法可能是合适的。比较适宜的，本发明的中的方法使得那些小井在一个短时间内充满液体。比较适 宜的，在液体到达顶隙后，那些小井在1. 0秒，更加适宜的在0. 5秒以及最适宜的在0. 3秒 之内被基本充满。可以理解，液体在储液器出口处的压力取决于一些因素。这些因素的例子包括储 液器中液体的重量；储液器的形状；以及储液器入口处的气压。比较适宜的液体在储液器 出口处的压力是接近于或者大于101. 3kPa。一个影响本发明的器件内的压力的因素的例子 是真空作用在器件上的程度。这个真空可能作用这样一段时间以至于压力小于20kPa，更加
10适宜的是小于15kPa，最适宜的是介于0. 2到1. OkPa之间。尽管本发明中的器件，系统和方法是特别适合于与水具有相同粘度的液体，本发 明也可用于那些具有较低或者较高粘度的液体。对于具有较低或较高粘度的液体，应用到 本发明的器件和系统上的方法可能在储液器出口和顶隙之间使用不同的压力差。例如，对 于粘度低于水的液体，器件内的压力高于15kPa可能是合适的。例如，对于粘度高于水的液 体，器件内的压力低于0. 2kPa可能是合适的。本发明也准备用于那一部分具有与水相似的 粘度但表面张力有变的液体。一种这样的液体的例子是溶入了表面活性剂的水。这样的液 体在与气体接触时可能易于起泡沫。因此，本发明中规定储液器出口处的液体的压力和器 件内部的压力之间的压力差是某个值以至于这种泡沫不阻止液体在被清空出顶隙之前大 致上充入小井。本发明的器件，系统和方法特别适合于PCR的应用。因此，此处的用法，参 照大致充入小井中的液体中的术语“液体”可以用于描述大致是水溶液，乳液，或类似物，包 含一种或多种以下成分DNA，RNA, cDNA，酶，荧光染料，dNTP, PCR混合液。本发明中的方法还可以进一步包含对器件内的小井之间的流体连通进行密封的 步骤。比较适宜的，这个步骤在器件的小井大致充满后执行。液态的密封剂可以被充入顶 隙中。此液态密封剂可能含有某种物质使得它可以固化成固体(比如预聚合物)，或者它可 以保持为液态(比如油)。在比较适宜的实施方式中，密封剂可以含有PDMS预聚合物。可 以理解适合于将密封剂导入顶隙的装置是很多的。一个这种这种是注射器，使用正压将液 态密封剂打入顶隙中。在这样的实施方式中，比较适宜的，在施加正压之前，顶隙中的压力 与液态密封剂的压力大致相同。最适宜的，密封之前顶隙中的压力在95到105kPa的范围 内，最好是接近101. 3kPa。另一个适合将密封剂送入顶隙的手段是通过将密封剂层叠在将 要送入小井中的液体上部，这样一旦所有要送入小井中的液体离开了储液器，在减压装置 的作用下密封剂从储液器流出并充入顶隙。这样的效果可以通过仔细调节此减压装置来达 成。例如，一旦一部分密封剂离开了储液器并充满了顶隙，此减压装置可以断开与顶隙的流 体连通，这样就不再施加力于顶隙内的密封剂上。比较适宜的，本发明中的器件的盖子在执行了本发明的方法后可以从基底构件上 移开。一个移走盖子的原因是为了将样品从器件的一个或多个小井中取出来。在本发明的 一些实施方式中，当顶隙已被充满了固化的聚合物时，可能需要穿透此聚合物密封层以从 小井中移出样品。在这样的实施方式中，一根注射针可能是适合于穿透聚合物密封层的物 件。此注射针可以连接注射器以将溶液从小井抽出。
具体实施例方式本发明现在将参照附图和一些例子来描述。应该可以理解的是以下描述的特异性 不应取代本发明的之前的描述的一般性。参照附图


书图1是本发明的器件的透视图的图示。如图所示，此器件包含一个盖子，三个出口 和一个入口，以及100个大致上等比例的、形成网格状的阵列小井。
图2是本发明的器件的侧面剖视图的图示，其中由覆盖基底的盖板界定顶隙。图3是本发明的系统的侧面剖视图的图示。图4是依据此发明的方法的四个步骤(步骤A到步骤D)的图示。图5是样品加载、小井隔离和密封过程的顶视图像序列。图1是本发明的器件101的一个实施方式的图示。特别的，基底构件2包含多个 排成阵列状的小井4，一个入口流道6和三个出口流道8。每一个流道通向基底构件2在阵 列角部由小井的阵列所占据的的树脂，而且每一个流道都垂直于阵列的通过它每个流道进 入阵列树脂的一个边沿。在一些本发明的器件的实施方式中，入口流道6和/或出口流道8 的高度可以小于在小井之上的空间的高度。比较适宜的，入口流道6的截面积大于各出口 流道8的截面积。这样的关系可以在图1中看的更清楚。此外，从图1可见，每个流道的流 体轴线相对于在器件的相对边上进或者出流道的方向相偏离。不希望受限于理论，据信这 样的安排在实现本发明的方法时促进了在排空顶隙之前大致充满小井。图1也展示了较适 宜的在基底构件2上的小井4的排列。图2是本发明的器件的较适宜的实施方式的侧面剖视图的图示。虽然入口流道6 和出口流道8在这个图示里看起来是直接相对的，在实际的器件中这些流道是如图1所示 那样偏离的。此图示是用来展示此实施方式中的构件的层状结构。特别的，图2显示了复 合的基底构件，由模塑的聚合物构件16和玻璃片18所构成。如此形成的复合构件比构件 16本身更有刚性。在预先制造好的聚合物芯片中的一个或多个小井4的内部可以载有化学 的和/或生物的材料。此模塑的聚合物构件16和小井4随后被压上盖板1，因此界定了一 个顶隙。入口流道6允许液体从器件外部的空间进入到顶隙和小井中。出口流道8可以受 到一个真空源(未显示)的作用而将液体抽入顶隙24并允许多余的液体从顶隙中移走。图3是本发明的系统的图示。其中，储液器30包含入口 32，出口 34和装载的液体 36被连到阀门38。一段管子40在入口 6处将阀门连到器件101。器件101被放在外罩46 里，该外罩能允许在里面形成大致的真空。此外罩连到阀门48，该阀门允许控制真空泵50 和外罩46之间的流体连通。在使用时，真空泵50在外罩46内建立减压区域。这转化为吸 力，当阀门38打开时，该吸力将液体36通过管子40和入口 6吸入到器件101中，并充入小 井4。减压也能将多余的液体抽出顶隙24。图4展示了本发明的方法的一个实施方式。在步骤A，具有多个小井4和顶隙24 的器件101被放在外罩46内。此器件连到装有液体36的储液器。储液器在顶端有开口 (入口)32，并且有连到关闭着的能节制液体和/或气体从储液器流出的阀门38的开口(出 口)34。外罩46连到出口阀48，该出口阀用于节制由真空68改变的腔体内压力。当阀门 48处于打开位置，并且阀门38处于关闭位置时，外罩内的压力被减低到接近0. 2到1. OkPa 之间。在步骤B，节制液体流出储液器的阀门38被打开了，允许液体从储液器移出以充入到 小井4和顶隙24中。在步骤C，一旦储液器中的液体被抽干，气体开始通过开口 32流经储 液器，经过打开的阀门，由此进入器件的顶隙。在小井里的液体36基本上不会受到气体向 顶隙的流动的影响。之前占满顶隙的液体被清出到了腔体66中。在步骤D，当阀门48处于 关闭位置，第一个储液器被移走并替换为装有适合作为密封剂的比如PDMS预聚合物的材 料85的第二个储液器84。在正压力的作用下，密封剂被从第二个储液器推入顶隙24。器 件随后可以从腔体里移出来放置于一定的条件下一段时间，足以使得密封剂固化为大致固态的材料。在这种方式下，在器件的热循环期间，防止小井4里的液体免受诸如交叉污染和
蒸发等有害影响。图5展示了样品加载，小井隔离和密封过程的顶视的图像序列。图像帧1-3展示 了步骤B的过程，图像帧4-6展示了步骤C的过程，图像帧7-9展示了步骤D的过程。每图 像一帧的具体描述如下帧1 在PCR样品载入之前将芯片放在真空腔里。有一些小井预先 加载有干在小井的内表面上的蓝色的染料。帧2-3 受到在顶隙和小井里建立的真空的驱 动，样品液以高速注入顶隙并分开以在打开夹管阀后的几分之一秒的时间里充满顶隙和小 井。帧4-5 空气紧随着样品液将顶隙里多余的液体通过出口流道排出，使得在几分之一秒 的时间里所有的小井互相隔离。此后，真空关闭。帧6:干了的染料的再悬浮使得一部分小 井呈现蓝色，在小井阵列中显出了三个蓝色的字母，“NTU”，而其他的小井保持无色。这显示 井之间没有可见的交叉污染。帧7-9:密封剂(PDMS预聚合物)被从管子注入顶隙并密封 所有小井。例子例 1用于PCR的器件的构成具有最大表面尺寸5x5cm，并且具有每个尺寸为0. 5x0. 5x0. 5mm的的100个小井的 器件的例子如下制备。通过将10份的PDMS Sylgard有机硅橡胶184和一份的Sylgard固 化剂 184(Dow Corning Corporation Midland，MI，USA)放在烧杯里用磁力搅拌器以 150rpm 的速度搅拌1小时以混合均勻而制备成液体预聚合物(2mL)。此PDMS预聚合物被加到具有 与小井和流道相反的形状的金属模子的表面，并将液态预聚合物置于真空下20分钟以去 除气体。随后，另一个有平的表面的金属块被放在PDMS预聚合物的上面并且整个的装配被 加热到80°C持续2个小时。具有小纳米小井和微流道的PDMS复制层被小心地从模子上取 下来，接着用液态PDMS的2 μ m厚旋转涂布层作为粘合剂层，将该聚合物粘合到0. Imm厚的 酸洗过的硼硅玻璃基板(Herenz Medizinalbedarf, Hamburg, Germany)上。这个包含粘合 剂层的装配，在80°C下固化2个小时，以永久的将PDMS层和玻璃基板粘合到一起。一些小井用包含用于多个基因的PCR分析的核酸引物对的引物液人工加载。随 后器件被加热到80°C持续10分钟，以蒸干小井中预先加载的引物液中的大量水分。引 物组也可以用冻干法工艺或者在室温下弄干。最后，0. Imm厚的酸洗过的硼硅玻璃基板 (HerenzMedizinalbedarf, Hamburg, Germany)被放至Ij小井上面，并用液态 PDMS 与此 PDMS 芯片相粘合，以界定顶隙并形成封闭的微流道。例 2交叉污染前面已经演示了在将小井大致充满的过程中，预先加载到小井中的化学物质之间 的交叉污染是忽略不计的。在这个方面，包含100个同容积的小井的器件的一些预定数量 的小井内被预先加载了包含蓝色染料的溶液。溶剂随后从器件的小井中蒸发掉。依据本发 明的方法在真空的作用下，在顶隙被适当的清空之前，小井和顶隙被充满了液体，其为用于 蓝色染料的适合的溶液。据观察基本上所有的蓝色染料还保持在那些预先加载染料的小井 内。为了进一步的验证这个交叉污染可忽略的发现，另一个器件的一些选定的小井被预先加载了一种溶液，包含用FAM荧光团标记的纯化的20mer长的寡核苷酸(引物) (5，-(6FAM)-TCG TGC GTG GAT TGG CTT TG)。溶液随后被蒸发。按照本发明的方法，小井 中被充入了一种PCR混合液，包含 IOmM Tris-HCl (pH 8.4)，50mM KCl, 0. 1% Triton X-100， dATP, dCTP, dTTP 禾口 dGTP 各 0. 2mM, 3mM MgC12，0. 2U/μ L 的 Taq DNA 聚合酶(Promega， Madison, USA)以及0. Olng/ μ L的在pGEM_3Z媒介中作为模板复制的SARS DNA。使用荧光 显微镜装置，据观察不仅没有可见的已标记的寡核苷酸从预先加载的小井中移动到没有与 预先加载的小井中，而且已标记的寡核苷酸的扩散速度也慢。此外，在室温下过了 279秒， 已标记的寡核苷酸还没有扩散到小井内的溶液的全部体积。例 3实时PCR方法本发明的器件，系统和方法已经被应用于实时PCR领域。本发明中的一个包含100 个小井的器件其中的二十二个小井被预先加载了含有引物对的溶液，而让其他78个小井 保持为空。溶液随后被蒸发留下干的引物对。正向引物和反向引物的序列分别是5’ -ATG AATTAC CM GTC MT GGT TAC—3，(24mer)禾口 5，-CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA—3，(2 Imer)。 使用本发明的方法，器件中所有的小井被充入了包含预定浓度的DNA模板的PCR混合液。此 PCR 混合液包含了 IOmM Tris-HCKpH 8. 4), 50mM KCl, 0. 1% Triton X-100，每种各 0. 2mM 的 dATP，dCTP, dTTP 和 dGTP，3mM MgCl2，0. 2U/ μ L 的 Taq DNA 聚合酶(Promega，Madison, USA)，1· 5 μ g/μ L BSA，2X SYBR Green I (Cambrex Biosciences,Maine, USA)以及0. Olng/ μ L在pGEM-3Z媒介中作为模板复制的SARS DNA的BNI-I片段(189bp)。此PCR混合液溶 解了于的引物对，形成正向引物和反向引物的最终浓度都达到0.3 μ M。器件的顶隙随后被 充满液态的PDMS，随后又去除小井间的流体连通。随后用一个连接至该器件的热电加热器/制冷器(TEC)给器件进行热循环。 RTD(电阻式温度检测器)被装在TEC上检查其温度并作反馈控制。使用了如下的热循环 方案在95°C下初始变性60秒，接着进行40个循环的95°C下变性15秒，60°C退火15秒以 及72°C延伸15秒。此实时PCR设备的光学部分被设计成可检测SYBR Green I ( 一种DNA 插入染料)的荧光，并且SYBR Green I染料的荧光在每一个PCR循环的延伸步骤被检测。 SYBRGreen I 荧光团被的蓝光 LED 阵列(Marl International Ltd, Cumbria, UK)所激发。 该蓝光LED阵列安装在与PCR器件所在平面成45°角度，以防止此激发光对检测单元光 路的干扰。从蓝光LED阵列来的激发光(强度峰值在480nM)和芯片发出的光分别经过了 465-495nM 和 515-555nM 的带通滤波器(Chroma Technologies Corp, Brattleboro, USA) 的过滤。整个芯片的荧光影像被制冷型C⑶相机(DTA，Pisa，Italy)所捕获。用于从PDMS 器件里的22个小井中扩增3xl07个拷贝的模板的阈值循环数(Ct)被确定为11个循环。在 22个小井中扩增的3xl07个拷贝的模板DNA的Ct值在整个芯片范围内保持一致。本说明书所参照的任何先前的出版物(或从中派生的信息)，或任何已知的事物， 不被，也不应该被当作承认或允许或任何形式的暗示为先前的出版物(或从中派生的信 息)或已知的事物形成在本说明书涉及的的领域中的公知常识的一部分。在整个说明书以及随后的权利要求中，除非上下文有其他要求，词语“包含”，以及 其变化，应该理解为暗示了包括指定的整体或步骤或一组整体或步骤但并不排除任何其他 的整体或步骤或其他组整体或步骤。
权利要求
一种用于将液体分配到多个小井中的器件，此器件包含a)具有多个小井的基底；b)盖子，覆盖在基底上，以在所述小井上方界定所述小井通向的顶隙；c)至少一个入口，用于让液体进入顶隙，以分配液体到所述小井中；以及d)至少一个出口，用于与顶隙连通，以从顶隙中移除多余的液体，和/或用于与顶隙连通，以在顶隙中施加减低的压力。
2.按照权利要求1所述的器件，其中该器件如此配置，使得向所述或每个出口施加减 低的压力用来从顶隙中抽出多余液体。
3.按照权利要求1或2所述的器件，其中所述基底包含多个元件。
4.按照权利要求3所述的器件，其中所述基底由聚合材料和大致刚性的材料构成。
5.按照权利要求4所述的器件，其中该聚合材料是聚二甲基硅氧烷。
6.按照权利要求4所述的器件，其中中该大致刚性的材料为玻璃。
7.按照权利要求1到6中的任一项所述的器件，其中所述盖子是由大致刚性的材料所 构成。
8.按照权利要求7所述的器件，其中所述盖子包含玻璃板。
9.按照权利要求1到8中的任一项所述的器件，其中所述入口或每个入口位于基底上。
10.按照权利要求1到8中的任一项所述的器件，其中所述入口或每个入口位于盖子上。
11.按照权利要求1到10中的任一项所述的器件，其中所述出口或每个出口位于基底上。
12.按照权利要求1到11中的任一项所述的器件，其中在将盖板放上基底之前，该器件 的一个或多个小井被预先加载有一种或多种物质。
13.按照权利要求12所述的器件，其中该物质是化学化合物或生物复合物。
14.按照权利要求12或13所述的器件，其中该物质包含核酸引物对。
15.按照权利要求1到14中的任一项所述的器件，其中该器件构造成允许光进入所述 小井。
16.按照权利要求15所述的器件，其中该器件构造成允许光离开所述小井。
17.按照权利要求16所述的器件，其中该器件构造成允许波长范围为465nm到495纳 米的光进入小井，并且也构造成允许波长范围为515nm到555纳米的光离开小井。
18.按照权利要求1到17中的任一项所述的器件，用于聚合酶链式反应(PCR)，其中两 个或更多的小井被预先加载有不同的核酸引物对，并且其中将要分配的液体中含有核酸， 如DNA模板。
19.一种用于将液体分配到多个小井里的系统，包含a)按照权利要求1到18中的任一项所述的器件；b)装有将要分配的液体的储液器，该储液器经由阀门装置连接到所述入口或每个入 口，所述阀门装置用于控制液体从储液器流入上述顶隙。c)施加减低的压力给器件的所述出口或每个出口的装置。
20.按照权利要求19所述的系统，还包含能够被密封的用于该器件的外罩。
21.按照权利要求19或20所述的系统，其中所述储液器具有基本上通向大气的入口。2
22.按照权利要求19到21中的任一项所述的系统，其中用于施加减低的压力的装置包含泵。
23.按照权利要求19到22中的任一项所述的系统，进一步包含在小井被储液器中的液 体大致充满并且多余的液体已经通过所述出口或每个出口被移除之后将第二种液体注入 器件的顶隙的装置。
24.按照权利要求23所述的器件，其中该第二种液体用来密封各个小井中的液体。
25.按照权利要求24所述的器件，其中密封剂是液态聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其前体。
26.使用按照权利要求1到18中的任一项所述的器件或者权利要求19到25中的任一 项所述的系统的方法，包含施加减低的压力到所述出口或每个出口，使得液体通过所述入 口或每个入口被吸入顶隙以分配到小井中。
27.一种使用按照权利要求19到25中的任一项所述的系统的方法，包含以下步骤a)施以减低的气压到所述出口或每个出口，以使得器件的顶隙和小井中的压力低于储 液器的出口处的液体的压力；b)打开所述阀门装置，以使得储液器中的液体离开储液器并进入器件的顶隙和小井中；c)断开减低器件的顶隙和小井中的压力的装置与器件的顶隙和小井的流体连通。
28.按照权利要求27所述的方法，进一步包含b)步骤之后的步骤，其中多余的液体在 减低压力的装置的影响下被从顶隙中抽出。
29.按照权利要求27所述的方法，进一步包含b)步骤之后的步骤，其中气体在减低压 力的装置的影响下被允许从储液器流入器件的顶隙中。
30.按照权利要求27到29中的任一项所述的方法，进一步包含以下步骤d)将器件的入口连接到装有液态密封剂的储液器；以及e)向液态密封剂施加压力，以使得它从储液器流入器件的顶隙中。
31.按照权利要求1的器件，大致如在上文中参照任何一个例子和/或附图描述的那样。
32.按照权利要求19的系统，大致如在上文中参照任何一个例子和/或附图描述的那样。
33.按照权利要求26或者权利要求27的方法，大致如在上文中参照任何一个例子和/ 或附图描述的那样。
全文摘要
本发明提供了一种包含多个小井的微流控器件，每个小井可以被相当充分的充入液体，不需要昂贵的单个加入样品，也不需要单独的隔离和密封各个小井来防止交叉污染和样品蒸发。
文档编号B01L3/00GK101896275SQ200880120680
公开日2010年11月24日 申请日期2008年12月4日 优先权日2007年12月17日
发明者刘浩兵, 许锦文, 龚海庆 申请人:龚海庆