专利名称：一种混合模式扩张吸附床介质及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种混合模式扩张床吸附介质及其制备方法，以巯基苯并咪唑 和砜基为配基，属于层析分离中扩张床吸附分离蛋白质技术。
背景技术：
抗体是一种重要的生物技术产品，广泛用于免疫治疗、疾病预防和医学诊
断。近年来针对抗体的分离技术取得了一定的进展，但是还需要不断的补充和
6第 兀香°
常规的离子交换层析和疏水相互作用层析能够结合抗体，但是特异性和选
择性较差，分离步骤多，影响抗体的活性收率。Protein A亲和层析介质能够选 择性吸附抗体，但是介质价格昂贵，且配基易被料液中蛋白酶降解，重复使用 次数低，操作成本极高，限制其大规模应用。混合模式层析(Mixed-mode chromatography)是近年来发展的一种新型生化分离技术，结合两种以及两种以 上的配基一蛋白质相互作用模式，可以显著提高吸附容量和吸附选择性，其中 耐盐性亲硫层析是一个重要方向。自1985年Porath (Porath et al. i^5S /e"e^， 1985,185:306)等首次应用亲硫层析(thiophilicchromatography)从血清中分离 出抗体以来，亲硫层析在蛋白质纯化方面，特别是抗体纯化方面有了诸多应用。 亲硫配基中砜基的硫是个缺电子区，可作为电子受体，而临近的硫醚中的硫则 为电子富集区，作为电子供体。该特殊结构可以对抗体分子保守区的一些电子 供体-受体位点产生特异性作用，提高抗体吸附的选择性。然而，传统亲硫层析 必须在一定浓度的硫酸铵或硫酸钠下才能进行有效吸附抗体，不利于抗体分离， 限制其规模化应用，寻找新型的、耐盐的亲硫性混合模式配基是发展趋势。
扩张床吸附(Expanded Bed Adsorption, EBA)技术形成于20世纪90年代，是
一种集固液分离、浓縮和初期纯化于一个操作单元之中的新型蛋白质分离纯化 技术。EBA能直接从细胞液、细胞匀浆液或者组织提取液中捕获目标产物，减 少了操作单元数，縮短了处理时间，节约了生产成本，是近十几年来出现的一
个新的单元操作。因此，本发明以纤维素/无机增重剂复合微球为扩张床吸附基 质，经二乙烯基砜活化后引入的砜基和偶联后的巯基苯并咪唑作为其主要功能 配基，形成了一种新型亲硫性混合模式扩张吸附床介质，可用于大规模扩张床 吸附分离抗体，成为一种高效集成化的新型抗体分离工艺，相关研究未见文献 报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种以巯基苯并咪唑和砜基为配基的混合模式扩张床 吸附介质及其制备方法。
以巯基苯并咪唑和砜基为配基的混合模式扩张床吸附介质介质的组成中 基质为纤维素/无机增重剂复合微球，配基为二乙烯基砜活化后引入的砜基和偶 联后的巯基苯并咪唑，结构组成为<formula>formula see original document page 4</formula>
所述的纤维素/无机增重剂复合微球的骨架为纤维素，增重剂为钛白粉、不 锈钢粉、镍粉或碳化钨粉，增重剂占湿球的质量百分比含量为16% 61%;纤维
素/无机增重剂复合微球的粒径为50 250,。配基为2-巯基-l-R-苯并咪唑，R 为0-2个碳原子的短链垸烃。配基密度为28 58 iLimol/ml介质。
混合模式扩张床吸附介质的制备方法首先将纤维素粘胶和无机增重剂充 分混合，无机增重剂在混合物中的质量百分含量为16% 61%，加入5倍纤维素 粘胶质量的泵油，控制转速500 800rpm，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤， 筛选50 250pm粒径的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；其次将纤维素/ 无机增重剂复合微球、二乙烯基砜、0.1 0.5M pH12的碳酸钠缓冲液和二甲基 亚砜混合，二乙烯基砜添加的体积量为纤维素/无机增重剂复合微球体积的 18% 36%， 25"C下180rpm摇床中活化4小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活 化基质；然后将活化基质、3倍双键摩尔量的巯基乙基吡啶和含25mg/ml过硫酸 铵的0.2 0.7M氢氧化钠溶液混合，6(TC下180rpm摇床中偶联8h;最后将微球 加入到含有1% &02和1%甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗漆，得到以 巯基苯并咪唑和砜基为配基的混合模式扩张床吸附介质。反应过程示意图为<formula>formula see original document page 5</formula>
本发明充分结合了疏水相互作用、电荷诱导作用和亲硫作用等多种配基一 蛋白质相互作用原理，形成特殊的混合模式吸附，具有吸附容量大、选择性高 等优点。同时，新型混合模式计配基偶联到纤维素/无机增重剂复合扩张床基质 上，形成了新型的扩张床吸附介质，可以用于抗体等蛋白质的规模化、高效分 离纯化。
图1混合模式介质吸附卵黄抗体的静态吸附等温线(不同pH);
图2混合模式介质吸附卵黄抗体的静态吸附等温线(不同盐浓度，pH=7)。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步的描述 实施例1
将50g纤维素粘胶和40g碳化钩粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合， 加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗 涤3 5次，筛选50 250(im粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质; 将10ml抽干的复合微球、3.6 ml 二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液 和1.5ml 二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25'C下180rpm摇床中活化4小时，抽滤 除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基苯并咪唑 和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60"C下180rpm摇床中偶 联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml 含有1% &02和1%甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电 荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为 58pmol/ml。 实施例2
将50g纤维素粘胶和40g碳化钨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合， 加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗 涤3 5次，筛选50 250|Lim粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质;将10ml抽干的复合微球、0.9ml 二乙烯基砜、9ml 0.5MpH12的碳酸钠缓冲液和 1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25。C下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除 去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基苯并咪唑和 10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.7M氢氧化钠溶液，6(TC下180rpm摇床中偶联 反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含 有1% &02和1%甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷 诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为28|amol/ml。 实施例3
将50g纤维素粘胶和80g碳化鸨粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合， 加入310g泵油，800rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗 涤3 5次，筛选50 250)Lim粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质； 将10ml抽干的复合微球、1.8ml二乙烯基砜、9ml0.1MpH12的碳酸钠缓冲液和 1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25'C下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除 去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基苯并咪唑和 10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.2M氢氧化钠溶液，6(TC下180rpm摇床中偶联 反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含 有1% 11202和1%甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷 诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为2.40g/ml，配基密度为41|imol/ml。 实施例4
将50g纤维素粘胶和60g碳化舆粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合， 加入300g泵油，800rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗 涤3 5次，筛选50 250)Lim粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质; 将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液 和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25'C下180rpm摇床中活化4小时，抽滤 除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基苯并咪唑 和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，6(TC下180rpm摇床中偶 联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml 含有1% 11202和1%甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电 荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为2.11g/ml，配基密度为 56|imol/ml。 实施例5
将50g纤维素粘胶和12g镍粉在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤3 5次，筛选50 250pm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质;将10ml 抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml0.25MpH12的碳酸钠缓冲液和1.5ml 二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25'C下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除去混合 液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基苯并咪唑和10ml含 有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，6(TC下180rpm摇床中偶联反应8 小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含有1% H202 和1%甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷诱导型亲硫扩 张床吸附介质，介质湿真密度为1.42g/ml，配基密度为57^imol/ml。 实施例6
将50g纤维素粘胶和20g不锈钢粉在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合， 加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗 涤3 5次，筛选50 250pm粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质; 将10ml抽干的复合微球、3.6ml 二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液 和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25。C下180rpm摇床中活化4小时，抽滤 除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基苯并咪唑 和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，6(TC下180rpm摇床中偶 联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml 含有1% }1202和1%甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电 荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.71g/ml，配基密度为 54(imol/ml。 实施例7
将50g纤维素粘胶和15g钛白粉在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合，加 入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗涤 3 5次，筛选50 250^im粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；将 10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9 ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液和 1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25。C下180rpm摇床中活化4小时，抽滤除 去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基苯并咪唑和 10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，6(TC下180rpm摇床中偶联 反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到100ml含 有1% 11202和1%甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏水性电荷 诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.39g/ml，配基密度为58pmol/ml。实施例8
将50g纤维素粘胶和40g碳化钩粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合， 加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗 漆3 5次，筛选50 250^im粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质; 将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25MpH12的碳酸钠缓冲液 和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25"下180rpm摇床中活化4小时，抽滤 除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基-l-甲基-苯 并咪唑和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，60'C下180rpm摇 床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到 100ml含有1% &02和1%甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏 水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为 51|jmol/ml。 实施例9
将50g纤维素粘胶和40g碳化钩粉末在500ml圆底烧瓶中300rpm搅拌混合， 加入300g泵油，700rpm转速，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，去离子水洗 涤3 5次，筛选50 250|_im粒径大小的纤维素/无机增重剂复合微球作为基质； 将10ml抽干的复合微球、3.6ml二乙烯基砜、9ml 0.25M pH12的碳酸钠缓冲液 和1.5ml二甲基亚砜加入到锥形瓶中，25'C下180rpm摇床中活化4小时，抽滤 除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。加入3倍双键摩尔量的2-巯基-l-乙基-苯 并咪唑和10ml含有25mg/ml过硫酸铵的0.5M氢氧化钠溶液，6(TC下180rpm摇 床中偶联反应8小时，抽滤除去混合液，用去离子水洗涤，抽干。介质加入到 100ml含有lX &02和1%甘油的溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到疏 水性电荷诱导型亲硫扩张床吸附介质，介质湿真密度为1.81g/ml，配基密度为 49|xmol/ml。 实施例10
混合模式介质(配基密度为58pmol/ml)吸附卵黄抗体的静态吸附实验，首 先将介质用pH5的柠檬酸缓冲液进行平衡；抽滤后分别准确称取0.4g介质于 25ml带塞锥形瓶中，加入8ml不同卵黄抗体(IgY)浓度的缓冲溶液；将锥形 瓶置于水浴摇床中，25'C下180rpm振荡8h;平衡后取出上清液测定IgY的浓度； 根据物料横算求得吸附蛋白的量和溶液剩余浓度，绘制静态吸附等温线，并根 据Langmuir方程拟合得到介质的饱和吸附量为167.3mg/ml。采用同样方法，测 定了 pH4和pH8时的静态吸附等温线，介质对IgY在pH4和8下的静态饱和吸附容量分别为101.9和114.9mg/ml。结果表明，介质对抗体的吸附容量高，且对 pH变化十分敏感，体现出典型的混合模式吸附特点。 实施例11
混合模式介质(配基密度为58pmol/ml)吸附卵黄抗体的静态吸附实验，首 先配置含有0.2M硫酸铵的品pH5柠檬酸缓冲液；将介质用缓冲液进行平衡；抽 滤后分别准确称取0.4g介质于25ml带塞锥形瓶中，加入8ml不同不同卵黄抗 体(IgY)浓度的缓冲溶液；将锥形瓶置于水浴摇床中，25。C下180rpm振荡8h; 平衡后取出上清液测定IgY的浓度；根据物料横算求得吸附蛋白的量和溶液剩 余浓度，绘制静态吸附等温线，并根据Langmuir方程拟合得到介质的饱和吸附 量为144.5mg/ml。采用同样方法，测定含有0.6M硫酸铵的pH7的柠檬酸缓冲 液中IgY的静态吸附等温线，IgY的静态饱和吸附容量为171.4mg/ml。结果表 明，介质对抗体的吸附容量高，且对盐浓度变化不敏感，体现出典型的混合模 式吸附特点。
权利要求
1. 一种混合模式扩张床吸附介质，其特征在于介质的组成中基质为纤维素/无机增重剂复合微球，配基为二乙烯基砜活化后引入的砜基和偶联后的巯基苯并咪唑，结构组成为id="icf0001" file="S2008100618140C00011.gif" wi="78" he="78" top= "57" left = "67" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>
2. 根据权利要求1所述的一种混合模式扩张床吸附介质，其特征在于所述 纤维素/无机增重剂复合微球的骨架为纤维素，增重剂为钛白粉、不锈钢粉、镍 粉或碳化钨粉，增重剂占湿球的质量百分比含量为16% 61%;纤维素/无机增 重剂复合微球的粒径为50 250|am。
3. 根据权利要求1所述的一种混合模式扩张床吸附介质，其特征在于配基 为2-巯基-l-R-苯并咪唑，R为0-2个碳原子的短链烷烃。
4. 根据权利要求1所述的一种混合模式扩张床吸附介质，其特征在于配基 密度为28 58 |umol/ml介质。
5. —种如权利要求1所述的一种混合模式扩张床吸附介质的制备方法，其特征在于首先将纤维素粘胶和无机增重剂充分混合，无机增重剂在混合物中的质量百分含量为16% 61%，加入5倍纤维素粘胶质量的泵油，控制转速500 800rpm，反相悬浮热再生制成球，沸水洗涤，筛选50 250nm粒径的纤维素/ 无机增重剂复合微球作为基质；其次将纤维素/无机增重剂复合微球、二乙烯基 砜、0.1 0.5M pH12的碳酸钠缓冲液和二甲基亚砜混合，二乙烯基砜添加的体 积量为纤维素/无机增重剂复合微球体积的18% 36%，25°CT 180rpm摇床中活 化4小时，抽滤，用去离子水洗涤得到活化基质；然后将活化基质、3倍双键摩 尔量的巯基乙基吡啶和含25mg/ml过硫酸铵的0.2 0.7M氢氧化钠溶液混合， 6(TC下180rpm摇床中偶联8h;最后将微球加入到含有1% &02和1%甘油的 溶液中浸泡2小时，去离子水洗涤，得到以巯基苯并咪唑和砜基为配基的混合 模式扩张床吸附介质。
全文摘要
本发明公开了一种混合模式扩张吸附床介质及其制备方法。介质组成中基质为纤维素/无机增重剂复合微球，配基为砜基和巯基苯并咪唑。采用反相悬浮热再生法，得到纤维素/无机增重剂复合微球作为基质；混合二乙烯基砜、碳酸钠缓冲液和二甲基亚砜进行活化；混合抽干的活化基质、巯基苯并咪唑和含有过硫酸铵的氢氧化钠进行偶联，以巯基苯并咪唑和砜基为配基的混合模式扩张床吸附介质。本发明所研制的新型扩张床吸附介质，结合了疏水相互作用、电荷诱导作用和亲硫作用等多种配基—蛋白质相互作用机理，形成混合模式吸附，具有吸附容量大、选择性高等优点，可以用于抗体等生物活性物质的高效分离纯化。
文档编号B01J20/22GK101279243SQ20081006181
公开日2008年10月8日 申请日期2008年5月14日 优先权日2008年5月14日
发明者夏海锋, 姚善泾, 林东强, 王立平 申请人:浙江大学