专利名称：用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质及其制备方法，属于用 于分离纯化免疫球蛋白的色谱介质技术。
背景技术：
近些年来，抗体被广泛地应用于医学诊断和疾病治疗中。2006年FDA批准的20余 种抗体类药物全球销售额超过170亿美元04w历o^/mo/丄a6， 24(8): 8 (2006))。抗体药物制 备通常采用沉淀、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、亲和色谱等方法完成，其过程成 本约占生产成本的30%~40%。以目前广泛应用的亲和蛋白A色谱为例，尽管蛋白A与抗 体的Fc片段间专一性的识别使经由蛋白A色谱分离得到的抗体具有较高的纯度，但其高 昂的价格、脆弱的结构及牵强人意的偶联方法和洗脱条件严重影响其产业化的进程 9: 211 (2000); /C/wwatogr A 1122: 144 (2006))。近来，受到以追求产物高 收率为目标的高密度细胞培养技术发展的影响，抗体纯化成本有更加增大的趋势。
针对以上问题，Biosepra公司公布了以含巯基的杂环化合物为配基的拟亲和色谱介质 用于抗体的分离(US Patent 5719269A1)。该介质通过与免疫球蛋白间的选择性作用吸附目 标蛋白。在电导率低于100mS/cm的范围内，该色谱介质的动态吸附量与电导率无关并维 持在30mg/mL作用，显示出很好的耐盐特性，更加适应高密度细胞培养液的处理(细胞 培养液的电导率在13-16 mS/cm)。同时色谱介质因采用了价格较蛋白A便宜的化学配基 而更加稳定，使用周期长。Upfront Chromatography A/S报道了以含有羧基的芳香或杂环化 合物为配基的色谱介质(US Patent 6498236B1)，其对抗体的吸附效率达到80-100%(吸附效 率定义为吸附前后液相中蛋白浓度差与吸附前液相中蛋白浓度之比)。但这种较高的吸附 效率通常出现在低盐和少量亲水性有机溶剂存在的条件下。GE Healthcare于2007年5月' 公开了一种分离抗体的多模式配基色谱介质，通过电子受体-供体间相互作用实现免疫球 蛋白的吸附(USPatent2007112178Al)。该色谱介质由带有碳、硫或氧原子的芳香或杂环芳 香化合物构成，如3-氨基-4-丙磺酰基-2-羧基噻吩等。在牛血清白蛋白存在条件下，单克 隆抗体在色谱介质上的动态吸附量可达40 mg/mL。随着抗体药物在近年来的兴起，作为 抗体制备关键技术的抗体色谱也受到了日益广泛地关注。目前抗体色谱虽初步实现了在较 宽离子强度范围内目标产物的高容量吸附，但昂贵的配基价格、相对苛刻的洗脱条件等仍 然制约着抗体色谱的推广和应用。因此，寻找并开发廉价、稳定及洗脱条件相对温和的配 基是当前抗体色谱发展中急待解决的问题，其对抗体药物的产业化所要求的大规模制备技 术的实现具有重要的经济和技术价值。
发明内容
本发明的目的在于开发一种用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质及制备方 法。所述的分离纯化色谱介质具有吸附量大的特点，其制备方法过程简单，价格低廉。
本发明是通过下述技术方案加以实现的， 一种用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色 谱介质，其特征在于，该色谱介质是在平均粒径为30-300 ym的琼脂糖凝胶颗粒的介质 表面偶联烯丙基的间隔臂，在间隔臂的末端偶联咪唑和苯的双环化合物D为介质的配基。 色谱介质的结构表达形式如下
其中R3、 R4、 R5、 R6、 R7中的一个基团必为氨基或甲基氨，其余的基团及R1、 R2 为氢原子和含有1-4个碳原子的短链垸烃一种。
上述的咪唑和苯的双环化合物D选自2-(咪唑-l-基)苯胺、4-(咪唑-l-基)苯胺、3-(咪 唑-l-基)苯胺、4-咪唑-l-基-2-甲基-苯胺、4-咪唑-l-基-苯甲胺、2-咪唑-l-基-苯甲胺和3-甲基_4-(咪唑-1-基)苯胺。
上述用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质的制备方法，其特征在于包括以下 过程
1.介质的烯丙基化反应
将平均粒径为30-300 pm的琼脂糖凝胶颗粒的介质，加入二甲基亚砜中形成介质的悬 浮液，二甲基亚砜的体积用量为介质体积量的0.05-2倍，继而向介质悬浮液中加入体积用
其中，咪唑和苯的双环化合物D结构式如I式所示:
量为介质体积量的0.05-1倍、浓度为0.5-6 mol/L氢氧化钠溶液，混合均匀，制得混合悬 浮液，再向混合悬浮液中加入体积用量为介质体积量的0.02-1倍的烯丙基溴后，置于4-50 。C的恒温水浴中活化3-36小时，之后用去离子水冲洗介质至无游离烯丙基溴，制得含烯 丙基的色谱介质。
2. 介质的活化反应
将烯丙基色谱介质加入到二甲基亚砜和水的体积比为0. 1-4的混合溶液中，二甲基亚 砜和水的混合溶液的体积用量为烯丙基色谱介质体积量的1-8倍，再向二甲基亚砜和水及 烯丙基色谱介质的悬浮液中按每毫升烯丙基色谱介质加入0. 05-2g N-溴代琥珀酰亚胺后， 将该悬浮液置于15-5(TC水浴中反应0. 3-5小时，反应后以去离子水冲洗介质制得活化色 谱介质；
3. 活化色谱介质的配基偶联
按每克活化色谱介质用双环化合物D为0. 05-2 mmol标准计，再将活化色谱介质悬浮 于含有双环化合物D的二甲基亚砜的反应液中，反应液的体积用量为活化色谱介质体积量 的0.2-5倍，反应液的pH值为9.0-13.0，再将该悬浮有活化色谱介质的反应液置于 25-60° C恒温水浴中，经3-36小时进行偶联反应，偶联反应后的偶联配基介质以去离子 水、体积浓度25%乙醇-水溶液和0.5mol/L的氯化钠溶液进行交替冲洗，得到用于免疫 球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质。
上述的介质烯丙基化过程，采用的二甲基亚砜的体积用量为介质体积量的0.1-0.7 倍，氢氧化钠溶液的浓度为1-5 mol/L，体积用量为介质体积量的0.2-0.8倍，烯丙基溴 的体积用量为介质体积量的0.05-0.5倍；上述的介质活化反应过程，采用的混合溶液中 二甲基亚砜和水的体积比为0.3_1.2，该混合溶液体积用量为烯丙基色谱介质体积量的 3-6倍，混合溶液中N-溴代琥珀酰亚胺按每毫升烯丙基色谱介质用量为0. l-lg比例加入； 上述的介质偶联配基过程，偶联悬浮反应液中双环化合物D的用量按每克活化色谱介质用 量为0.3-1.0 mmol加入，偶联悬浮反应液二甲基亚砜体积用量为活化色谱介质体积量的 l-3倍；反应液的pH值10. 0-13. 0，反应时间为15-30小对。
本发明提供了的用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质，该色谱介质具有如下 显著的特点:色谱介质在离子强度从0.02mol/L到2mol/L的范围内对抗体均有较强的吸附， 表现出优良的耐盐吸附特性，显示出该配基为非盐依赖性配基；因此，原料液可无需预处 理，直接经色谱分离而获得目标产物，简化了操作步骤；作为主要杂蛋白的牛血清白蛋白 在色谱介质上的吸附量随着离子强度的增加显著下降，采用高离子强度缓冲液可洗脱白蛋 白，提高目标产物的纯度；色谱介质在特定离子强度下(如含有0.5 mol/LNaCl的20mmol/L 磷酸盐缓冲液，pH8.0)选择性地吸附免疫球蛋白的同时，避免了杂蛋白的共吸附和共洗脱， 从而获得纯度在90%以上的目标产品；配基的解离常数pif。几近中性，从而可根据目标蛋
白和杂蛋白等电点的差异，选择合适的洗脱pH，获得高纯度的产品；该制备方法过程简 单，价格低廉。
图1为以本发明实施例1所制备的琼脂糖凝胶色谱介质在20mmol/L磷酸盐缓冲溶液 (pH 8.0)中不同氯化钠浓度下抗体和牛血清白蛋白的动态吸附量比较图。图中深色柱代表 抗体的动态吸附量；浅色柱代表牛血清白蛋白的动态吸附量。
图2为本发明实施例1所制备的琼脂糖凝胶色谱介质在含0.5 mol/L氯化钠的20 mol/L 磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中分离抗体与白蛋白混合溶液的色谱图。图中1为含50%乙二醇的 20mmol/L NaAc-HAc缓冲液(pH 5.0)的洗脱峰；2为20mmol/L NaAc-HAc缓冲液(pH 4.0) 的洗脱峰；3为0.1mol/LHCl的洗脱峰。
图3为本发明实施例1所制备的琼脂糖凝胶色谱介质在含0.13 mol/L氯化钠的20 mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)中分离抗体与白蛋白混合溶液的色谱图。图中1为含1.0mol/L NaCl的20 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)的洗脱峰；2为含50%乙二醇的20mmol/L NaAc-HAc缓冲液(pH 5.0)的洗脱峰；3为20mmol/LNaAc-HAc缓冲液(pH 4.0)的洗脱峰； 4为0.1mol/LHCl的洗脱峰。
图4为本发明实施例1所制备的琼脂糖凝胶色谱介质从成牛血清中分离抗体的色谱 图。其中l为20mmol/L NaAc-HAc缓冲液(pH5.5)的洗脱峰；2为20mmol/L NaAc-HAc 缓冲液(pH5.0)的洗脱峰；3为20mmol/L NaAc-HAc缓冲液(pH4.5)的洗脱峰;4为20mmol/L NaAc-HAc缓冲液(pH4.0)的洗脱峰；5为0.1 mol/L盐酸的洗脱峰。
具体实施例方式
下面的实例将对本发明的方法予以进一步的说明。 实施例1
称取1.0g经砂滤漏斗冲洗抽干、平均粒径为90 nm的琼脂糖凝胶介质Sepharose CL-6B 置于50mL锥形瓶中后，依次加入0.2mL 二甲基亚砜，0.5mL 4mol/L氢氧化钠溶液和0.3mL 烯丙基溴；混合均匀后，凝胶悬浮液置于水浴摇床在25"C下反应24小时，得到带有烯丙 基的Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶介质。烯丙基色谱介质以去离子水冲洗除去游离的烯丙 基溴。烯丙基色谱介质的烯丙基修饰密度为200 pmol/mL。
称取1.0 g烯丙基色谱介质置于4mL体积比为1:3的二甲基亚砜和水的混合溶液中； 然后，加入0.6gN-溴代琥珀酰亚胺，经充分混匀并置于水浴摇床在25'C下反应1小时； 反应后的介质经去离子水冲洗和抽干处理后，置于1.2mL 二甲基亚砜溶液中，溶液中4(咪 唑-l-基)苯胺的含量为0.8 mmol;用2mol/L的氢氧化钠将溶液pH调节至12，置于50°C
水浴摇床中反应24小时。得到的琼脂糖凝胶介质用去离子水、体积浓度25%乙醇-水溶液 和0.5mol/L氯化钠溶液交替冲洗干净，即可得到用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱 介质，色谱介质中4 (咪唑-l-基)苯胺偶联密度为90pmol/mL。 实施例2
称取1.0g经砂滤漏斗冲洗抽干、平均粒径为90 nm的琼脂糖凝胶介质Sepharose CL-6B 置于50mL锥形瓶中后，依次加入0.2mL二甲基亚砜，0.5mL4mol/L氢氧化钠溶液和0.3mL 烯丙基溴；混合均匀后，凝胶悬浮液置于水浴摇床在25r下反应24小时，得到含烯丙基 的Sepharose CL-6B琼脂糖凝胶介质。烯丙基色谱介质以去离子水冲洗除去游离的烯丙基 溴。烯丙基色谱介质的烯丙基修饰密度为200 mol/mL。
称取1.0g烯丙基色谱介质置于4mL体积比为1:3的二甲基亚砜和水的混合溶液中； 然后，加入0.5gN-溴代琥珀酰亚胺，经充分混匀并置于水浴摇床在25'C下反应1小时； 反应后的介质经去离子水冲洗和抽干处理后，置于1.2mL二甲基亚砜溶液中，溶液中3-(咪 唑-l-基)苯胺的含量为0.5 mmol;用2mol/L的氢氧化钠将溶液pH调节至10，置于37°C 水浴摇床中反应24小时。得到的琼脂糖凝胶介质用去离子水、体积浓度25%乙醇-水溶液 和0.5mol/L氯化钠溶液交替冲洗干净，即可得到用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱 介质，色谱介质中3-(咪唑-l-基)苯胺偶联密度为32 u mol/mL。 实施例3
实施例l中N-溴代琥珀酰亚胺加入量1.2 g，溶液中4-(咪唑-l-基)苯胺的含量提高 到1.6 mmol;其他条件不变的情况下,可得到用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介 质中4-咪唑-l-基)苯胺偶联密度为123umol/mL。 实施例4
实施例2中N-溴代琥珀酰亚胺加入量1.8g，溶液中3-(咪唑-l-基)苯胺的含量提高到 1.5 mmol;其他条件不变的情况下,可得到用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质中 3-(咪唑-l-基)苯胺偶联密度为73 P mol/mL。 实施例5
取1.0 mL实施例1制备的色谱介质装填于TricornTM5/50色谱柱中，分别用含有不同 浓度氯化钠(0、 0.2、 0.5、 lmol/L)的20mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)平衡后，以迎头分 析模式上样考察免疫球蛋白和牛血清白蛋白的动态吸附量(在10%穿透点下计算的动态 吸附量)。结果显示，免疫球蛋白的动态吸附量介于36-55mg/mL柱体积(如图1所示)； 而牛血清白蛋白的动态吸附量分别为53.4、 27.2、 7.4、 3.8mg/mL柱体积，随离子强度的 增加吸附量显著下降。 实施例6
配制免疫球蛋白浓度为1 mg/mL、牛血清白蛋白浓度为4 mg/mL的蛋白质混合溶液
10mL。色谱柱经含0.5 mol/L氯化钠的20 mmol/L磷酸缓冲液(pH8.0)平衡后，以迎头 分析模式进样直至穿透；色谱柱依次用平衡缓冲液和含50%乙二醇20mmol/L的 NaAc-HAc缓冲液(pH5.0)洗脱，免疫球蛋白收率为80%,经聚丙烯酰胺电泳分析，该产品 的纯度为98% (如图2所示)。 实施例7
分别称取10 mg免疫球蛋白和40 mg牛血清白蛋白溶于10 mL含0.13mol/L氯化钠的 磷酸缓冲液(pH7.4)中；色谱柱用经含0.13mol/L氯化钠的磷酸缓冲液(pH7.4)平衡后， 连续进样直至穿透；然后，依次采用样品缓冲液和含lmol/L氯化钠的磷酸缓冲液(pH7.4) 冲洗色谱柱，洗脱吸附于色谱柱上的白蛋白；最后，经含50%乙二醇的20mmol/L的 NaAc-HAc缓冲液(pH5.0)洗脱，免疫球蛋白收率为70%,经聚丙烯酰胺电泳分析，该产品 的纯度为95% (如图3所示)。 实施例8
原料液为标准成牛血清，其中免疫球蛋白含量约为2.15% (电泳分析)。用含有氯化 钠的磷酸缓冲液分别调节成牛血清的离子强度至40-50mS/cm和溶液的pH值至8.0;用0.22 ^m的滤膜过滤后，取20mL此原料液进样，流出液中的主要成分是白蛋白和一些杂蛋白， 这说明所发明的色谱介质能够选择性吸附免疫球蛋白G;在pH4.5条件下洗脱，经聚丙烯 酰胺电泳分析，该产品的纯度为80%，没有检测到白蛋白被洗脱，表明所发明的色谱介质: 能够有效地排斥白蛋白的共吸附。
权利要求
1.一种用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质，其特征在于，该色谱介质是在平均粒径为30-300μm的琼脂糖凝胶颗粒的介质表面偶联烯丙基的间隔臂，在间隔臂的末端偶联咪唑和苯的双环化合物D为介质的配基，色谱介质的结构表达形式如下id="icf0001" file="S2007100595765C00011.gif" wi="45" he="33" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中，咪唑和苯的双环化合物D结构式如I式所示id="icf0002" file="S2007100595765C00012.gif" wi="48" he="34" top="5" left = "5" img-content="drawing" img-format="tif" orientation="portrait" inline="no"/>其中R3、R4、R5、R6、R7中的一个基团必为氨基或甲基氨，其余的基团及R1、R2为氢原子和含有1-4个碳原子的短链烷烃一种。
2. 按权利要求l所述的用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质，其特征在于， 咪唑和苯的双环化合物D选自2-(咪唑-l-基)苯胺、4-(咪唑-1-基)苯胺、3-(咪唑-1-基) 苯胺、4-咪唑-1-基-2-甲基-苯胺、4-咪唑-1-基-苯甲胺、2-咪唑-1-基-苯甲胺和3-甲基 -4-(咪唑-1-基)苯胺。
3. —种制备权利要求1所述的用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质的方法， 其特征在于包括以下过程1).介质的烯丙基化反应将平均粒径为30-300 pm的琼脂糖凝胶颗粒的介质，加入二甲基亚砜中形成介质的悬 浮液，二甲基亚砜的体积用量为介质体积量的0.05-2倍，继而向介质悬浮液中加入体积用 量为介质体积量的0.05-1倍、浓度为0.5-6 mol/L氢氧化钠溶液，混合均匀，制得混合悬 浮液，再向混合悬浮液中加入体积用量为介质体积量的0.02-1倍的烯丙基溴后，置于4-50 。C的恒温水浴中活化3-36小时，之后用去离子水冲洗介质至无游离烯丙基溴，制得含烯丙基的色谱介质；2) .介质的活化反应将烯丙基色谱介质加入到二甲基亚砜和水的体积比为0. 1-4的混合溶液中，二甲基亚 砜和水的混合溶液的体积用量为烯丙基色谱介质体积量的1-8倍，再向二甲基亚砜和水及 烯丙基色谱介质的悬浮液中按每毫升烯丙基色谱介质加入0. 05-2g N-溴代琥珀酰亚胺后， 将该悬浮液置于15-50"C水浴中反应0. 3-5小时，反应后以去离子水冲洗介质制得活化色 谱介质；3) .活化介质的配基偶联按每克活化色谱介质用双环化合物D为0. 05-2 mmol标准计，再将活化色谱介质悬浮 于含有双环化合物D的二甲基亚砜的反应液中，反应液的体积用量为活化色谱介质体积量 的0.2-5倍，反应液的pH值为9.0-13.0，再将该悬浮有活化色谱介质的反应液置于 25-60° C恒温水浴中，经3-36小时进行偶联反应，偶联反应后的偶联配基介质以去离子 水、体积浓度25%乙醇-水溶液和0.5mol/L的氯化钠溶液进行交替冲洗，得到用于免疫 球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质。
4.按权利要求3所述的用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱介质的制备方法， 其特征在于，介质烯丙基化过程，采用的二甲基亚砜的体积用量为介质体积量的0.1-0.7 倍，氢氧化钠溶液的浓度为1-5 mol/L，体积用量为介质体积量的0.2-0.8倍，烯丙基溴 的体积用量为介质体积量的0.05-0.5倍；上述的介质活化反应过程，采用的混合溶液中 二甲基亚砜和水的体积比为0.3_1.2，该混合溶液体积用量为烯丙基色谱介质体积量的 3-6倍，混合溶液中N-溴代琥珀酰亚胺按每毫升烯丙基色谱介质用量为0. 1-lg比例加入; 上述的介质偶联配基过程，偶联悬浮反应液中双环化合物D的用量按每克活化色谱介质用 量为0.3-1.0 mmol加入，偶联悬浮反应液二甲基亚砜体积用量为活化色谱介质体积量的 1-3倍；反应液的pH值10. 0-13. 0，反应时间为15-30小时。
全文摘要
本发明涉及一种用于免疫球蛋白类蛋白质分离纯化的色谱及其制备方法，属于用于分离纯化免疫球蛋白的色谱介质的制备技术。该色谱介质为间隔臂末端偶联含有咪唑基团和苯环的双环化合物分子作为色谱介质配基。其制备方法为采用烯丙基色谱介质与N-溴代琥珀酰亚胺的溴化醇化反应获得活化色谱介质，该活化介质在二甲基亚砜溶液中与双环化合物中的氨基反应完成配基的偶联。该色谱介质在离子强度0.02-2.0mol/L的范围内对抗体均有较高的动态吸附量，直接用于料液中抗体的回收；同时介质具有更温和的洗脱条件；可用于从血清、腹水、细胞培养上清液或其它含有抗体的料液中纯化抗体。该色谱介质在抗体制备过程中具有广阔的应用前景。
文档编号B01J20/281GK101185881SQ20071005957
公开日2008年5月28日 申请日期2007年9月12日 优先权日2007年9月12日
发明者史清洪, 彦 孙, 姝 白, 征 程, 董晓燕 申请人:天津大学