专利名称：一种复合型生物表面活性剂和它的生产方法
技术领域：
本发明涉及枯草芽孢杆菌产生的一种新的复合型生物表面活性剂和对该生物表面活性剂合适的提取方法。
背景技术：
生物表面活性剂因其具有无毒害或低毒害性以及可生物降解性而逐渐被人们重视，并正在工业应用中逐步取代“传统表面活性剂”。然而，生物表面活性剂成本昂贵性和在工业应用中种类的有限性等问题成为它在工业中广泛被采用的瓶颈。在固体垃圾堆肥领域，生物表面活性剂可以改善堆肥微环境，从而促进微生物对有机垃圾的分解，提高堆肥中垃圾的处理效率。垃圾堆肥是一个复杂的反应体系，多种生物表面活性剂共同作用于堆肥系统中将更有利于改善堆肥微环境。但是，如果将多种能够产生生物表面活性剂的微生物同时接种于堆肥环境中，微生物之间可能因为相互的拮抗作用而不能同时很好地生长并同时产生多种生物表面活性剂。因此，有效地使尽可能少的微生物种类在同一堆肥环境体系中产生多种生物表面活性剂成为解决这一问题的一个出路。最为理想的状态就是一种微生物能够产生多种不同类型的、功能各异的生物表面活性剂。
以往的文献资料中提到的枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂主要为3种脂肽类物质，即surfactins，iturins和fengycins。这3种脂肽类生物表面活性剂都可以通过酸沉降的方法得到，这也说明了这3种脂肽类生物表面活性剂在极度酸性条件下将失去它们的生物表面活性剂的一些性质。因此，使枯草芽孢杆菌能够产生一种在极度酸性条件也同样具有表面活性的生物表面活性剂将使得这种微生物在工业中得到更为广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足，提供一种在极酸条件下也具有活性的复合型生物表面活性剂和它的生产方法。
为解决上述问题，本发明采用以下技术方案一种复合型生物表面活性剂，由枯草芽孢杆菌产生，包括以下质量百分含量的成分脂类(包括纯脂类及脂类和其他物质的结合物，如脂肽，脂蛋白或糖脂等)98.1±0.2％，蛋白质19.1±0.2％，醣类0.7±0.1％；该复合型生物表面活性剂临界胶束浓度分别为5.0～5.4g/L和1.33～1.39g/L，此时它们分别将蒸馏水的表面张力值从78mN/m下降到38.4～38.9 mN/m和40.3～40.7mN/m。
一种生产上述复合型生物表面活性剂的方法，包括以下步骤1.将枯草芽孢杆菌于30～37℃下活化24h后，接种于富集培养液中，在温度30～37℃，转速200～250rpm条件下培养24h，将富集后的菌种按体积分数2～5％接种于好氧发酵培养液中进行好氧发酵培养，培养条件为温度30～37℃，转速150～200rpm，通气速率1.0～1.2vvm，通入的空气过0.45μm滤膜进行过滤除菌，发明中通过测定好氧发酵培养液表面张力值的变化确定复合型生物表面活性剂的产生以及好氧发酵培养时间。
2.取上述好氧发酵培养后的发酵液高速离心除菌，离心力为11000～12000×g，时间15～20min；用HCl溶液调节上清液pH1.5～2.0，然后在0～4℃下静置过夜，静置液再高速离心，离心力10000～12000×g，时间15～20min；取离心后的上清液于锥形瓶中加入乙酸乙酯，然后放在培养箱中以最大转速旋转振荡5～6min，倒于分液漏斗中静置分层，下层液再次加入与上次同样体积的乙酸乙酯，按上述方法继续萃取，重复3次，收集上层液。
3.将上述收集的上层液于40～45℃下真空旋转蒸干，再冷冻干燥，即可得到本发明复合型生物表面活性剂。
所述步骤1中富集培养液成分为 NaCl 4.0～5.0g，蛋白胨4.0～5.0g，牛肉粉2.5～3.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2；所述发酵培养液组成为葡萄糖40～45g，NH4NO36.8～7.3g，K2HPO4·3H2O 13.8～14.3g，NaH2PO4·H2O 1.95～2.05g，MgSO4·7H2O0.5～0.6g，MnSO4·H2O 0.036～0.04g，酵母膏0.5～0.6g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2；好氧发酵培养时间最好为24h；所述步骤2中V上清液∶V乙酸乙酯＝9∶4～10∶3。
本发明的优点本发明使枯草芽孢杆菌产生了一种新的复合型生物表面活性剂，丰富了枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂的种类，使得枯草芽孢杆菌在工业中特别是环境污染的治理方面得到更为广泛的应用成为一种可能。在环境污染治理中的固体垃圾的堆肥方面，生物表面活性剂的加入将有利于改善堆肥微环境，促进微生物与有机物的接触密度和强度，提高微生物降解有机物的速度和彻底性。不同生物表面活性剂在堆肥系统中起到的作用各有千秋。有研究发现，将多种生物表面活性剂同时加入堆肥系统中时，将显著提高微生物对有机物的降解速率。但是，各种微生物在同一体系中生存和繁殖时可能会因为彼此之间的拮抗作用而对工业处理效果产生负面影响。因此，如果能够让尽可能少种类的微生物产生足够多种类的生物表面活性剂，就会减少和避免这种拮抗作用带来的负面影响。以往的文献资料中提到的枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂主要为3种脂肽类物质，即surfactins，iturins和fengycins。本发明发现枯草芽孢杆菌在适当情况下可以产生一种新的生物乳化剂，增加了它产生的生物表面活性剂的种类，使得枯草芽孢杆菌在工业中特别是环境污染治理的堆肥方面得到更为广泛的应用成为一种可能。
另外，该生物表面活性剂的提取过程是采用乙酸乙酯在pH1.5～2.0的水溶液体系中将它萃取出来。此时枯草芽孢杆菌可能产生的脂肽类生物表面活性剂都被沉降。这在一定程度上体现了该复合型生物表面活性剂在抗酸性能方面优于那些被沉降的生物表面活性剂的特点。
图1实施例1中发酵液表面张力值随时间的变化情况；图2实施例1中发酵液pH、菌体吸光度和接收液菌体吸光度随时间的变化情况；图3实施例1中所得生物表面活性剂的临界胶束浓度；图4实施例2中所得生物表面活性剂的临界胶束浓度。
具体实施例方式
实施例1生产复合型生物表面活性剂本发明中用到的菌种为枯草芽孢杆菌(编号CCTCC Bacillus subtilis AB93108)，该菌种购自中国典型培养物保藏中心，并每1～2月在斜面培养基上接种一次，菌种在4℃条件下保藏。取冷藏的菌种于30℃下活化24h，然后在无菌操作台中用接种环从斜面培养基中挑取一环菌种接种于种子培养液中，种子培养液事先于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min。将接种后的种子培养液放在恒温培养箱中于30℃，200rpm条件下培养。种子培养液的组成为NaCl 5.0g，蛋白胨5.0g，牛肉粉3.0g，蒸馏水1000mL，并用1M NaOH调节pH7.0。
将培养24h的种子培养液按体积分数2％的接种量接种于发酵培养液中，发酵液组成为葡萄糖40g，NH4NO36.8g，K2HPO4·3H2O 13.8g，NaH2PO4·H2O 1.95g，MgSO4·7H2O 0.5g，MnSO4·H2O 0.036g，酵母膏0.5g，蒸馏水1000mL，并用1M NaOH调节pH7.0。发酵培养液事先也于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min，每个500mL的锥形瓶装250mL接种后的发酵培养液，放置在恒温培养箱中，于温度30℃，转速200rpm，通气速率1.0vvm的条件下进行培养，通入的空气过0.45μm的滤膜进行灭菌。发酵过程中产生的泡沫通过出气管道流入500mL接收瓶中，接收瓶中事先装有10mL用1N HCl调节pH2.0的蒸馏水。
每12h取发酵液20mL，于5600×g下离心15min，用自动界面张力仪测定上清液的表面张力值(如图1)，发酵液培养24h时表面张力由最初的61.3mN/m下降到39.2mN/m，发酵液的表面张力值达到最低，意味着此时发酵液中生物表面活性剂的产量最大。离心后残留于离心管中的菌体用无菌水稀释，用紫外分光光度计在600nm波长下测定菌体吸光度(如图2)，根据一定条件下菌体浓度与菌体吸光度成线性关系，可见发酵液培养24h时枯草芽孢杆菌达到对数生长期后期，此时菌体浓度最大。结合图1和图2我们可以得到该种生物表面活性剂的产生是生长相关型的。接收瓶中的菌体生长情况可通过取5.0mL菌液用上述测定发酵液菌体吸光度同样的方法得到(如图2)，菌体浓度随着流入接收瓶中的泡沫的量增多而增加。直接取30mL发酵液测定其pH(如图2)，可以发现枯草芽孢杆菌在该种发酵培养液中的最佳生长环境为中性微偏酸性，发酵液培养24h菌体浓度达到最大时对应的pH为6.83。
取培养24h的发酵液于12000×g下离心15min除去菌体，用6N HCl调节上清液pH2.0后放于4℃下静置过夜。静置液于12000×g下离心15min，将枯草芽孢杆菌可能产生的脂肽类生物表面活性剂(包括surfactins，iturins和fengycins等)去除。取离心后的上清液450mL于1000mL锥形瓶中，加入200mL乙酸乙酯，然后放在培养箱中以最大转速旋转振荡5min，然后倒于1000mL分液漏斗中静置分层，下层液再次加入与前一次相同体积的乙酸乙酯，按上述方法继续萃取，重复3次，上层液收集密封存放。将收集的有机萃取相于40℃下真空旋转蒸干，再冷冻干燥。干燥后得到的复合型生物表面活性剂为红棕色粘稠状物质。
实施例2生产复合型生物表面活性剂如实施例1，取4℃条件下冷藏的菌种于37℃下活化24h，然后在无菌操作台中用接种环从斜面培养基中挑取一环菌种接种于种子培养液中，种子培养液事先于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min。将接种后的种子培养液放在恒温培养箱中于37℃，250rpm条件下培养。种子培养液的组成为NaCl 4.0g，蛋白胨4.0g，牛肉粉2.5g，蒸馏水1000mL，并用1MNaOH调节pH7.2。
将培养24h的种子培养液按体积分数5％的接种量接种于发酵培养液中，发酵液组成为葡萄糖45g，NH4NO37.3g，K2HPO4·3H2O 14.3g，NaH2PO4·H2O 2.05g，MgSO4·7H2O 0.6g，MnSO4·H2O 0.04g，酵母膏0.6g，蒸馏水1000mL，并用1M NaOH调节pH7.2。发酵培养液事先也于高压蒸汽锅中在115℃下灭菌30min，每个500mL的锥形瓶装250mL接种后的发酵培养液，放置在恒温培养箱中，于温度37℃，转速150rpm，通气速率1.2vvm的条件下进行培养，通入的空气过0.45μm的滤膜进行灭菌。发酵过程中产生的泡沫通过出气管道流入500mL接收瓶中，接收瓶中事先装有10mL用1N HCl调节pH1.5的蒸馏水。
每12h取发酵液20mL，于5600×g下离心15min，用自动界面张力仪测定上清液的表面张力值，与实施例1类似，发酵液培养24h时表面张力同样值达到最低，由最初的61.3mN/m下降到39.5mN/m，意味着此时发酵液中生物表面活性剂的产量最大。离心后残留于离心管中的菌体用无菌水稀释，用紫外分光光度计在600nm波长下测定菌体吸光度，同样地发现发酵液培养24h时枯草芽孢杆菌达到对数生长期后期，此时菌体浓度最大。这里再次证明该种生物表面活性剂的产生是生长相关型的。直接取30mL发酵液测定其pH，可以发现枯草芽孢杆菌在该种发酵培养液中的最佳生长环境与实施例1类似，为中性微偏酸性，发酵液培养24h菌体浓度达到最大时对应的pH为6.81。
取培养24h的发酵液于11000×g下离心20min除去菌体，用6N HCl调节上清液pH1.5后放于0℃下静置过夜。静置液于10000×g下离心20min，将枯草芽孢杆菌可能产生的脂肽类生物表面活性剂(包括surfactins，iturins和fengycins等)去除。取离心后的上清液500mL于1000mL锥形瓶中，加入150mL乙酸乙酯，然后放在培养箱中以最大转速旋转振荡6min，然后倒于1000mL分液漏斗中静置分层，分离的下层液再次加入与前一次相同体积的乙酸乙酯，按上述方法继续萃取，重复3次，上层液收集密封存放。将收集的有机萃取相于45℃下真空旋转蒸干，再冷冻干燥，得到红棕色粘稠状的复合型生物表面活性剂物质。
实施例3实施例1和2所制备的生物表面活性剂的组成和性质1.脂类(lipids)含量取0.15g生物表面活性剂，用6.0mL氯仿/甲醇(V∶V＝2∶1)混合溶液溶解提取脂类物质，然后于7332×g下离心10min，收集上清液，离心管中的残留物继续按上述方法提取，重复3次。将收集的有机萃取相于46℃下真空旋转蒸发，称重，测得生物表面活性剂中的脂类质量百分含量为98.1±0.2％。因为本方法利用的是脂类物质在有机物中的可溶性，因此测得的脂类含量为纯脂类及它和其他物质所形成的结合物(如脂肽，脂蛋白或糖脂类物质等)的总质量百分含量。
2.蛋白质含量生物表面活性剂中蛋白质的含量采用考马斯亮蓝法测定，采用牛血清蛋白作为标准样，光的吸收波长选定为595nm。实验中测定生物表面活性剂中蛋白质的质量百分含量为19.1±0.2％。
3.醣类含量生物表面活性剂中醣类含量通过苯酚-硫酸法测得，采用葡萄糖作为标准样，光的吸收波长选定为490nm。实验中测定生物表面活性剂中醣类质量百分含量为0.7±0.1％。
4.临界胶束浓度及表面张力值如图3，4所示，该复合型生物表面活性剂临界胶束浓度分别为4.2～5.0g/L和1.25～1.39g/L，此时它们分别将蒸馏水的表面张力值从78mN/m下降到38.4～39.8mN/m和40.3～40.8mN/m。
权利要求
1.一种复合型生物表面活性剂，其特征在于该复合型生物表面活性剂由枯草芽孢杆菌产生，其包括的组成成分质量百分含量分别为脂类98.1±0.2％，蛋白质19.1±0.2％，醣类0.7±0.1％；所述复合型生物表面活性剂临界胶束浓度分别为4.2～5.0g/L和1.25～1.39g/L，它们分别将蒸馏水的表面张力值从78mN/m下降到38.4～39.8mN/m和40.3～40.8mN/m。
2.一种生产权利要求1所述复合型生物表面活性剂的方法，其特征在于将枯草芽孢杆菌接种于富集培养液中，将富集后的菌种接种于好氧发酵培养液中进行发酵培养，通过测定好氧发酵培养液表面张力值的变化确定复合型生物表面活性剂的产生以及好氧发酵培养时间，取好氧发酵培养液高速离心除去菌体，然后用酸沉降的方法将枯草芽孢杆菌可能产生的脂肽类生物表面活性剂沉淀下来，并通过高速离心分离除去，将离心后的上清液通过乙酸乙酯萃取的方法得到本发明复合型生物表面活性剂。
3.根据权利要求2所述生产复合型生物表面活性剂的方法，其特征在于包括以下步骤A、将枯草芽孢杆菌于30～37℃下活化24h后，接种于富集培养液中，在温度30～37℃，转速200～250rpm条件下培养24h，然后将富集后的菌种按体积分数2～5％接种于好氧发酵培养液中进行好氧发酵培养，培养条件为温度30～37℃，转速150～200rpm，通气速率1.0～1.2vvm，通入的空气过0.45μm滤膜进行过滤除菌，发明中通过测定好氧发酵培养液表面张力值的变化确定复合型生物表面活性剂的产生以及好氧发酵培养时间；B、取上述好氧发酵培养后的发酵液高速离心除菌，离心力为11000～12000×g，时间15～20min，用HCl溶液调节上清液pH1.5～2.0，然后在0～4℃下静置过夜，静置液再高速离心，离心力10000～12000×g，时间15～20min，取离心后的上清液于锥形瓶中加入乙酸乙酯，然后放在培养箱中以最大转速旋转振荡5～6min，倒于分液漏斗中静置分层，下层液收集后再次加入与上次同样体积的乙酸乙酯，按上述方法继续萃取，重复3次，收集上层液；C、将上述收集的上层液于40～45℃下真空旋转蒸干，再冷冻干燥，即可得到本发明复合型生物表面活性剂。
4.根据权利要求2或3所述的生产复合型生物表面活性剂的方法，其特征在于所述富集培养基成分为NaCl 4.0～5.0g，蛋白胨4.0～5.0g，牛肉粉2.5～3.0g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。
5.根据权利要求2或3所述的生产复合型生物表面活性剂的方法，其特征在于所述发酵培养液组成为葡萄糖40～45g，NH4NO36.8～7.3g，K2HPO4·3H2O 13.8～14.3g，NaH2PO4·H2O 1.95～2.05g，MgSO4·7H2O 0.5～0.6g，MnSO4·H2O 0.036～0.04g，酵母膏0.5～0.6g，蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2。
6.根据权利要求2或3所述的生产复合型生物表面活性剂的方法，其特征在于所述好氧发酵培养时间最好为24h。
7.根据权利要求2或3所述的生产复合型生物表面活性剂的方法，其特征在于所述V上清液∶V乙酸乙酯＝9∶4～10∶3。
全文摘要
本发明提供了一种复合型生物表面活性剂和它的生产方法，该复合型生物表面活性剂由枯草芽孢杆菌产生，其包括的组成成分质量百分含量分别为脂类98.1±0.2％，蛋白质19.1±0.2％，醣类0.7±0.1％；所述复合型生物表面活性剂临界胶束浓度分别为4.2～5.0g/L和1.25～1.39g/L，它们分别将蒸馏水的表面张力值从78mN/m下降到38.4～39.8mN/m和40.3～40.8mN/m；本发明的优点是丰富了枯草芽孢杆菌产生的生物表面活性剂的种类，使得枯草芽孢杆菌在工业中特别是环境污染的治理方面得到更为广泛的应用成为一种可能。
文档编号B01F17/30GK101086006SQ20071003521
公开日2007年12月12日 申请日期2007年6月26日 优先权日2007年6月26日
发明者刘智峰, 曾光明, 陈耀宁, 傅海燕, 钟华, 刘小兰 申请人:湖南大学