专利名称：：一种固定钛离子亲和色谱材料及其制备和应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及磷酸肽的分离和富集，具体地说是一种固定钛离子亲和色谱材料及其制备和在磷酸化肽富集中的应用，本发明应用钛离子与磷酸基团之间的强相互作用将钛离子固定在磷酸改性的固相载体上形成固定钛离子亲和色谱材料。磷酸肽由于磷酸基团与固定的钛离子之间的强相互作用而保留在固定钛离子亲和色谱材料，从而实现特异性地从复杂的蛋白酶解液中分离和富集磷酸肽。
背景技术：
：随着人类基因组计划的完成，生命科学进入了功能基因组时代。人类基因组中大约有2%的基因编码500多个蛋白激酶和100多个磷酸酯酶，对应蛋白的磷酸化和去磷酸化。蛋白磷酸化是最常见、最重要的一种翻译后修饰，在真核生物中，蛋白质磷酸化是非常重要和普遍的现象，蛋白质可逆磷酸化将胞外信息传递到核内，因此在细胞生长、分裂、分化、代谢、癌症的产生等生命活动过程中起着关键得作用；对众多蛋白质生物化学功能担负开/关调控责任，是一种普遍的调控机制。据统计，在任一给定时刻，细胞内约有三分之一的蛋白质存在磷酸化形式(文献l.Mann,M.;Jensen,0.N.,Proteomicanalysisofpost隱translationalmodifications,淑肠fec/mo/2003，21,(3),255-61.文献2.M丄oyee,K.;T.Stults,J.;Amott,D.,MassSpectrometricContritutionstothePracticeofPhosphorylationSiteMappingthrough2003.Mo/.Ce〃.Profeow/cs2005，4,235-245.)。蛋白磷酸化修饰位点的鉴定是目前蛋白组学研究中的研究热点和难点。最近，质谱技术在蛋白磷酸化的定性中，已经发展成为重要的工具之一(文献3.Aebersold,R.;Mann,M.,Massspectrometry-basedproteomics.A^mm2003，422,(6928),198-207.)。然而，质谱在鉴定磷酸化蛋白现在仍然是一个巨大的挑战，其具体体现在第一，磷酸化蛋白在细胞内中属于低丰度蛋白；第二，磷酸化肽的负电性使其在质谱检测中难以质子化；第三，酶解产物中存在的大量的非磷酸化肽的质谱信号通常会抑制磷酸化肽的离子信号。因此，复杂蛋白酶解产物中磷酸化肽的分离和富集是质谱成功鉴定磷酸化最为重要的一步(文献4.Reinders,J.;Sickmann,A.,State-of-the-artinphosphoproteomics.尸ra化麵b2005，5,(16),4052-61.文献5.McLachlin,D.T.;Chait,B.T.,Analysisofphosphorylatedproteinsandpeptidesbymassspectrometry.C脏(9—.C/2泄肠/2001，5,(5),591-602.)。从磷酸化蛋白的酶解混合物中分离和富集磷酸化肽是目前进行磷酸化研究的比较理想的方法，也是成功实现质谱分析最关键的一步。到目前为止，分离和富集磷酸肽最常用的是固定化金属离子亲和色谱(ImmobilizedMetalA伍nityChromatography,IMAC)。IMAC运用于磷酸肽的分离和富集是基于磷酸化肽上的磷酸基团与固定金属离子之间的螯合作用。在IMAC技术中，最为广泛使用的金属离子是Fe"(文献6.Nuhse,T.S.;Stensballe，A.;Jensen,O.N.;Peek,S.C.,Large-scaleanalysisofinvivophosphorylatedmembraneproteinsbyimmobilizedmetalionaffinitychromatographyandmassspectrometry.Mo/.Ce〃./Vo/eom/cs2003，2,(11)，1234-43.文献7.Moser，K.;White,F.M.,PhosphoproteomicanalysisofratliverbyhighcapacityIMACandLC-MS/MS.乂Prafeo膨m006，5,(1),98-104.)I口Ga3+(文献8.Posewitz,M.C.;Tempst,P.,Immobilizedgallium(III)affinitychromatographyofphosphopeptides.屈a/.C/e附1999，71,(14),2883-92.)，而广泛使用的螯合基团主要是亚氨基二乙酸(IDA)(文献9.Pan,C.;Ye,M.;Liu,Y.;Feng,S.;Jiang,X.;Han,G.;Zhu,J.;Zou,H.，EnrichmentofphosphopeptidesbyFe3+-immobilizedmesoporousnanoparticlesofMCM-41forMALDIand腿o-LC-MS/MSanalysis.乂细te謹e.T^2006，5,(11),3114-24.)禾口次氮基三乙酸(NTA)(文献10.D醒，J.D.;Watson,J.T.;Bmening,M.L"DetectionofphosphopeptidesusingFe(III)陽nitrilotriacetatecomplexesimmobilizedonaMALDIplate.Jwa/.C77謹2006，78,(5),1574-80.)。IMAC的一个显著的缺点是，一些带有酸性氨基酸残基的肽段同时也会被保留从而干扰磷酸肽的检测。尽管将酸性谷氨酸和天冬氨酸残基酸中的酸性侦B连酉旨化(文献11.Ficarro,S.B.;McCleland,M.Stukenberg,RT.;Burke,D.J.;Ross,M.M.;Shabanowitz,J.;Hunt,D.F.;White,F.M.,PhosphoproteomeanalysisbymassspectrometryanditsapplicationtoSaccharomycescerevisiae.7VW,B/ofec/7"0/2002，20,(3),301-5.)，能减少酸性肽的非特异性吸附，但是通常反应并不能完全进行，而且会增加样品的复杂程度，从而干扰后续的质谱分析。金属氧化物(Zr02(文献12.KweonH.K.;Hakansson,K.,Selectivezirconiumdioxide-basedenrichmentofphosphorylatedpeptidesformassspectrometricanalysis.Jwa/.CTze附2006，78,(6),1743-9.文献13.Zhou,H.;Tian,R.;Ye,M.;Xu,S.;Feng,S.;Pan,C.;Jiang,X.;Li,X.;Zou,H.,Highlyspecificenrichmentofphosphopeptidesbyzirconiumdioxidenanoparticlesforphosphoproteomeanalysis.￡/e"r—o固.s2007，28,(13),2201-15.),Ti。2(文献14.Cantin，G.T.;Shock,T.R.;Park,S.K.;Madhani,H.D.;Yates,J.R.,3rd，OptimizingTi02-basedphosphopeptideenrichmentforautomatedmultidimensionalliquidchromatographycoupledtotandemmassspectrometry.J腦/.C/z證2007,79，(12)，4666-73.文献15.Thingholm,T.E.;Jorgensen,T.J.;Jensen,O.N.;Larsen,M.R.,Highlyselectiveenrichmentofphosphorylatedpeptidesusingtitaniumdioxide.TVat尸rotoc2006，1,(4),1929-35.文献16.Pocsfalvi，G.;Cuccur函，M.;Schlosser,G;Scacco，S.;Papa,S.;Malomi，A.,PhosphorylationofB14.5asubunitfrombovineheartcomplexIidentifiedbytitaniumdioxideselectiveenrichmentandshotgunproteomics.A/o/.Ce〃.尸roteow/cs2007，6,(2),231-7.))也被应用于磷酸肽的分离和富集，并显示出比一般IMAC对磷酸肽更高的特异性。Zr02、Ti02等金属氧化物之所以能富集磷酸肽，是由于其中的锆、钛等离子与磷酸肽中的磷酸基团有很强的相互作用。虽然Zr02、Ti02等金属氧化物对磷酸肽有较好的富集作用，但是由于空间位阻的原因，有些磷酸肽可能不容易被富集。而如果Ti"或者Zr"离子固定于色谱材料上，则由于存在间隔臂而使空间位阻减小，进而提高磷酸肽的富集效果。最近发展出了固定锆离子的新IMAC方法(Zr4+-IMAC)(文献17.Zhou,H.;Xu,S.;Ye，M.;Feng,S.;Pan,C.;Jiang,X.;Li，X.;Han,G.;Fu,Y.;Zou,H.,Zirconiumphosphonate-modifiedporoussiliconforhighlyspecificcaptureofphosphopeptidesandMALDI-TOFMSanalysis.,/Vo/eo附e.ies2006，5,(9),2431-7.文献18.Feng,S.;Ye,M.;Zhou,H.;Jiang,X.;Jiang,X.;Zou,H.;Gong,B.,Immobilizedzirconiumionaffinitychromatographyforspecificenrichmentofphosphopeptidesinphosphoproteomeanalysis.Mo/.Ce〃.Prafeom/"2007，6,(9),1656-65.)，与常规IMAC相比，该方法对磷酸肽显示出更好的特异性和选择性。本发明提出制备固定钛离子亲和色谱(Ti4+-IMAC)材料的方法以及利用Ti4+-IMAC富集磷酸肽的方法。固定钛离子亲和色谱材料的制备和应用，在此前都未见文献报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种固定钛离子亲和色谱材料及其制备和应用，固定钛离子的亲和色谱材料显示出对磷酸肽高的特异性和选择性。为实现上述目的，本发蝗采用的技术方案为一种固定钛离子亲和色谱材料(Ti"-IMAC)，可按如下过程制备获得，将含有磷酸基团的固相载体与钛离子溶液接触，利用钛离子与磷酸改性的固相载体上的磷酸基团的强相互作用，使钛离子通过磷酸配体固定在载体上，获得固定钛离子亲和色谱材料(T产-IMAC)。所述含有磷酸基团的固相载体，磷酸基团与固相载体间为共价键合；其结构如下，固定钛离子亲和色谱材料的制备方法将含有磷酸基团的固相载体与钛离子溶液接触，利用钛离子与磷酸改性的固相载体上的磷酸基团的强相互作用，使钛离子通过磷酸配体固定在载体上，获得固定钛离子亲和色谱材料7^4+-1^1八。图la.给出了固定钛离子的示意图。将磷酸改性的固相载体置于含钛离子的溶液中搅拌或接触一段时间，钛离子通过与磷酸基团的强螯合作用而固定于色谱材料形成固定钛离子亲和色谱材料。所述钛离子溶液可为硫酸钛溶液；所述亲和色谱材料可通过对现有的固相载体进行化学衍生，于其表面化学健合磷酸基团制备获得；所述固相载体为常规色谱载体中的硅胶颗粒、有机聚合物小球或琼脂糖颗粒，或者是整体柱材料、纳米材料、介孔材料(如易于改性的介孔MCM-41)、磁珠、芯片材料或其它颗粒状载体等固相载体。化学衍生的过程是通过对固相载体表面改性后的氨基化，磷酰化反应得到含有磷酸基团的固相载体材料；也可以是其他如磷酯化反应，或者可以衍生得到磷酸基团的反应均可以使用。所述亲和色谱材料可通过将含有磷酸基团的功能单体参与聚合形成的聚合物；所述聚合可为本体聚合、悬浮聚合、乳液聚合或溶液聚合等其他聚合反应均可以使用；功能单体可为2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯或其他可以提供磷酸基团的单体均可以使用；所使用的交联剂为亚甲基双丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三丙烯酸季戊四醇酯、二乙烯基苯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或N,N，-二亚甲基二丙烯酰胺等。本发明提出的磷酸肽的富集方法，以固定钛离子的亲和色谱Ti4+-IMAC为分离材料分离和富集磷酸肽，磷酸肽由于(其上带有的磷酸基团)与固定的钛离子之间的强螯合作用而保留在固定钛离子亲和色谱材料上，从而实现特异性地从复杂的蛋白酶解液中分离和富集磷酸肽的目的。图lb.给出了磷酸肽富集的示意图，磷酸肽中的磷酸基团由于与固定的钛离子之间的强螯合作用而获得保留，而非磷酸肽则由于没有磷酸基团而没有保留，从而使磷酸肽从含大量非磷酸肽的肽的混合物中获得分离。本发明具有如下优点:固定钛离子的亲和色谱材料显示出对磷酸肽高的特异性和选择性。同时，固定钛离子的亲和色谱材料显示出对单磷酸化肽和多磷酸化肽的平等的富集能力。相对于金属氧化1102和Zr02对磷酸化肽的富集，固定钛离子亲和色谱材料显示出更高的特异性。图1a.为制备固定钛离子亲和色谱材料的示意图，图1b.为利用固定钛离子的亲和色谱材料用于分离和富集磷酸肽的示意图；图2.固定钛离子的聚合物亲和材料对磷酸化蛋白a-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽的富集和纯化的MALDI质谱图。富集和检测的磷酸肽的序列和位点见表1。图3.固定钛离子的聚合物亲和材料对磷酸化蛋白(3-酪蛋白，卵清蛋白和标准的酪氨酸混合物中的磷酸化肽的富集和纯化的MALDI质谱图。富集和检测的磷酸肽的序列和位点见表1。图4.固定钛离子的聚合物亲和材料对半复杂样品中磷酸化蛋白oc-酪蛋白和非磷酸化蛋白牛血清白蛋白(BSA)酶解液(摩尔比1:100,l:500)中的磷酸化肽的富集和纯化的MALDI质谱图。(a)直接分析oc-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:100的混合物；(b)分离和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(c.)a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:100的混合物中分离和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:500的混合物中分离和富集得到的磷酸肽。图5固定钛离子的无机MCM-41材料对磷酸化蛋白a-酪蛋白酶解液中的磷酸化肽的富集和纯化的MALDI质谱图。富集和检测的磷酸肽的序列和位点见表l。图6.固定钛离子的无机MCM-41材料对磷酸化蛋白P-酪蛋白和标准的酪氨酸磷酸化肽混合物中的磷酸化肽的富集和纯化的MALDI质谱图。富集和检测的磷酸肽的序列和位点见表1。图7.固定锆离子的聚合物亲和材料对半复杂样品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩尔比1:100,l:500)中的磷酸化肽的富集和纯化的MALDI质谱图。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比1:100的混合物；(b)分离和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(c.)a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:100的混合物中分离和富集得到的磷酸肽;(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:500的混合物中分离和富集得到的磷酸肽。图8.基于GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC对半复杂样品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩尔比1:100,l:500)中的磷酸化肽的富集和纯化的MALDI质谱图。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比1:100的混合物;(b)分离和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽;(c〕a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:100的混合物中分离和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:500的混合物中分离和富集得到的磷酸肽。图9.Fe3+-IMAC对半复杂样品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩尔比1:100,1:500)中的磷酸化肽的富集和纯化的MALDI质谱图。(a)直接分析磷酸化蛋白oc-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比1:100的混合物；(b)分离和富集得到的ot-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(cja-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:100的混合物中分离和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:500的混合物中分离和富集得到的磷酸肽。图10.Ti02对半复杂样品中磷酸化蛋白oc-酪蛋白和BSA酶解液(摩尔比1:100,1:500)中的分离和富集得到的磷酸肽的MALDI质谱图。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比1:100的混合物；(b)分离和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽；(cja-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:100的混合物中分离和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:500的混合物中分离和富集得到的磷酸肽。图11.Zr02对半复杂样品中磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液(摩尔比1:100,l:500)中的磷酸肽的富集和纯化的MALDI质谱图。(a)直接分析磷酸化蛋白a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比1:100的混合物；(b)分离和富集得到的a-酪蛋白酶解液中的磷酸肽;(c.)a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:100的混合物中分离和富集得到的磷酸肽；(d)a-酪蛋白和BSA酶解液摩尔比为1:500的混合物中分离和富集得到的磷酸肽。具体实施方式本发明固定钛离子亲和色谱(Ti4+-IMAC)材料，是利用金属钛离子与磷酸基团之间的强螯合作用将钛离子固载在磷酸基团改性的固相载体上。所述的含钛离子的溶液可以是硫酸钛axso4:b:)溶液也可以是其它任何含钛离子的溶液。将磷酸基团改性的固相载体置于含钛离子的溶液中静置或搅拌一段时间二钛离子就被固定于载体表面形成固定钛离子亲和色谱材料，如图l(a)所示。所述的磷酸基团改性的固相载体是指在表面带有磷酸基团的固相载体。这种磷酸基团改性的固相载体主要可以通过两种方法制备获得一)通过对固相载体进行化学衍生接上磷酸基团。这里的固相载体可以是硅胶、聚合物小球、琼脂糖颗粒等常规色谱载体，也可以是整体柱材料、纳米材料、介孔材料、磁珠、芯片材料、其它颗粒状载体等固相载体。利用这些固相载体表面的活性基团，经过化学反应将磷酸基团固定于固相载体。本发明以MCM-41介孔分子筛为例来说明通过化学衍生来制备磷酸基团改性的固相载体的方法，但本发明并不局限于介孔分子筛，其它任何可以被衍生为磷酸基团改性的固相载体均可以使用。二)直接通过含磷酸基团的单体经聚合后形成带磷酸基团的聚合物固相载体。本发明以2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯单体与亚甲基双丙烯酰胺交联剂聚合反应为例来说明带磷酸基团的聚合物固相载体的制备。但含有磷酸基团的单体不局限于本发明中的2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯，其他可以提供磷酸基团和可供聚合的单体也可以使用。聚合材料中所使用的交联剂并不局限于本发明中提供的亚甲基双丙烯酰胺，其他的交联剂如二甲基丙烯酸乙二醇酯，三丙烯酸季戊四醇酯，二乙烯基苯，三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯，N,N'-二亚甲基二丙烯酰胺等也可以使用。本发明提出的使用固定钛离子亲和色谱材料分离和富集磷酸肽。利用固定钛离子亲和色谱材料分离和富集磷酸肽的过程主要可以分为上样、淋洗、洗脱三步含磷酸肽的肽混合物首先上样到固定钛离子亲和色谱材料，磷酸肽由于与固定的钛离子之间的强相互作用而被保留；上样后，通过淋洗将不保留或以非特异性保留的非磷酸肽去除，最后将特异性保留的磷酸肽洗脱。肽的混合物一般用甲酸、三氟乙酸、乙酸等酸酸化后上样；为了消除非磷酸肽与色谱材料之间由于疏水相互作用和静电相互作用而引起的非特异性吸附，使用的淋洗溶液一般需要含有一定浓度的有机溶剂和有较强的离子强度，如使用200mMNaCl/50%乙腈(ACN)/6。/。三氟乙酸(TFA)的水溶液冲洗。洗脱磷酸肽一般需要在碱性条件下进行，如10%氨水。在固定钛离子亲合色谱材料的使用方式上，可以将其填充为色谱柱以色谱分离模式来富集磷酸肽，也可以通过填充在Tip头里而使用，还可以直接使用，通过离心等其它方法将固定钛离子亲和色谱材料与溶液分离。以下以一种聚合物和一种介孔分子筛材料为固相载体来说明固定钛离子亲和色谱材料的制备，但本发明并不局限于这两种材料。以下以上述制备的两种固定钛离子亲和色谱材料为例说明利用固定钛离子亲和色谱材料分离和富集磷酸肽的方法，但本发明并不局限于这两种材料。以下实施例中，如果没有特殊说明，溶液的百分比浓度均为体积1:匕。实施例l.固定钛离子的聚合物亲和材料的制备通过利用带磷酸基团的单体与交联剂聚合反应生成带有磷酸基团的聚合物，该聚合物然后与钛离子溶液反应得到固定钛离子的聚合物亲和材料，进一步应用于富集和纯化磷酸肽。为了制备带磷酸基团的聚合物材料，首先需要配制聚合物反应液。单体和交联剂是反应液的主要成份，它们发生聚合反应后形成聚合物骨架。为了调节聚合物的物理化学性质，可以使用多种单体，但其中必须包括一种带有磷酸基团的单体。多孔材料有更大的表面积，因此有更高的吸附容量。为了制备多孔的聚合物，需要在反应液中加入一定比例的致孔剂，致孔剂是一些有机溶剂，它们不参与聚合反应，在聚合反应发生后它们所占据的空间将形成孔。通过调节致孔剂在反应液中的比例可以很方便的调节聚合物中孔的大小和机械强度。此外，一般还需要加入少量的引发剂来引发聚合反应。带磷酸基团的聚合物制备得到后，与钛离子溶液反应得到固定钛离子的聚合物亲和材料。本例采用单体2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯与交联剂亚甲基双丙烯酰胺聚合反应生成的带磷酸基团的聚合物。该聚合物具有很好的亲水性，因此非特异性很小，是亲和色谱良好的载体。聚合物拥有极强的耐酸碱性，耐压和耐热性和良好的亲水性,以至能够完全满足于磷酸化肽离和富集所需要的强酸上样，强碱洗脱的严格的基质条件。聚合物然后与钛离子(如Ti(S04)2)溶液)反应，钛离子与聚合物上的磷酸基团有强离子和配位相互作用而固定在聚合物材料上，得到固定化钛离子的亲和聚合物材料，因而具有简单、方便的特点(如图la所示)。通过固定的钛离子与磷酸肽中的磷酸基团的强的相互作用来实现特异性的分离和富集磷酸肽。固定在聚合物材料上一的钛离子可以用于从复杂的蛋白质酶解液中分离和富集磷酸肽(如图lb所示)。(1)带磷酸基团聚合物亲和材料的制备以2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯为功能单体，亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，十二醇(400^L)，二甲基亚砜(540pL)和N,N-二甲基甲酰胺(100pL)为致孔剂，单体、交联剂、致孔剂按质量百分比分别为13%、10%和77%均匀混合置于20mL的离心管中，接着加入为功能单体质量用量的1%的引发剂偶氮二异丁氰，然后将混合液超声振荡20min后，再通入N2脱氧10min，将离心管密塞并浸于60°C水浴中反应12h。反应完成后，研磨成均一性的微米级颗粒后，用甲醇浸泡除去致孔剂、残留反应试剂以及反应产生的一些低聚合度物质，离心滤去甲醇，得到的聚合物材料然后置于真空干燥箱中干燥后备用。(2)固定钛离子的聚合物亲和材料的制备称取10mg的聚合物材料，与10mL，100mM的Ti(S04)2溶液室温下搅拌过夜得到固定钛离子的亲和聚合物材料。得到的固定钛离子的亲和聚合物材料用二次蒸馏水清洗，除去残留的Ti(S04)2溶液和杂质，将清洗过的聚合物颗粒重新分散于体积浓度30%ACN/0.1%TFA溶液中备用。利用制备的固定钛离子聚合物亲合材料的分离和富集磷酸肽见实施例3-1。实施例2.固定钛离子的无机亲和材料的制备MCM-41是一种利用水热分子自组织方法，即利用一定浓度的有机导向(表面活性剂)与无机物种(单体或者齐聚物)相互作用形成的六方相液晶织态结构的无机介孔硅材料。当通过热处理或化学手段除去有机导向剂后，所得到的固体称为MCM-41介孔分子筛。MCM-41介孔分子筛呈现多层次有序结构，可以在多个尺度(例如纳米级，微米级或宏观尺度)层次上具有特定有序结构或形貌。纳米量级上，MCM-41呈有序的"蜂巢状"多孔结构，即有-一维线性孔道或呈六方密堆的阵列，其孔径可以在1.5-30nm范围内调解，最典型的孔径约为4nm，且具有很高的比表面积(通常可达1200m2/g)。MCM-41分子筛的优越性在于它具有均一且可调控的中孔孔径，稳定的骨架结构，具有一定壁厚且易于掺杂的无定型骨架组成和比表面积大且可修饰的内表面。MCM-41的应用主要是以MCM-41中孔分子筛及其改性产物为主。MCM-41中孔分子筛本身可用作催化剂，吸附剂或催化剂载体等。但是改性MCM-41以满足不同的需要仍然是MCM-41的一个研究热点。本例中，无机MCM-41材料通过水热晶化法合成得到，得到的MCM-41材料按照前面的方法(文献17)，依次通过酸化引入硅羟基，进一步通过硅烷化反应引入氨基，最后通过磷酰化反应，将内壁引入磷酸基团。含有磷酸基团的无机MCM-41材料与钛离子反应，钛离子通过与磷酸基团的强烈的离子和配位相互作用，得到固定钛离子的无机MCM-41材料。通过固定的钛离子与磷酸肽中的磷酸基团的强烈的相互作用来实现特异性的分离和富集磷酸肽。固定在无机MCM-41材料的钛离子可以用于从复杂的蛋白质酶解液中分离和富集磷酸肽(如图lb所示)。(1)带磷酸基团的无机MCM-41材料的制备制备无机MCM-41材料合成无机MCM-41材料按照前面的描述的方法(文献9)。简之，取2g的十六烷基三甲基溴化铵溶解到205mL的氨水(质量浓度为25%)和270mL的二次蒸馏水中，加热搅拌均匀后立即加入10mL的四乙氧基硅烷，反应两个小时后，然后将产物过滤，并用二次蒸馏水洗涤，然后置于真空干燥箱中干燥。将干燥后的产物加入到450mL的乙醇和6mL的盐酸中，在室温下搅拌6h，然后过滤，将得到的产物分别用无水乙醇和水清洗，产品在120。C下真空干燥，得到无机的MCM-41材料。无机材料MCM-41的活化取1.0gMCM-41分散于20mL、6M盐酸中，轻微搅拌5h。抽滤，滤饼用二次蒸馏水洗涤多次，直到溶液显中性，再用无水乙醇淋洗一遍，产品在12(TC下真空干燥。无机材料MCM-41的氨基化取0.5g的活化后的MCM-41放入三颈瓶中，抽真空，在Ar气保护下，加入25mL重蒸过的无水甲苯，再加入1.5mL3-氨丙基甲氧基硅垸，先常温搅拌5h，再升温至ll(TC回流16h。抽滤，滤饼用甲苯洗涤多次，再用乙醇冲洗，在11(TC下真空干燥。磷酸基团衍生的无机MCM-41材料取0.2g的氨基化的MCM-41分散于15mL的无水甲苯中，再加入0.5mL无水吡啶，0.5mL重蒸过的三氯氧磷，室温下搅拌18h。抽滤，滤饼先用甲苯清洗，再用二次蒸馏水清洗，最后置于三乙胺水溶液中浸泡20min,用二次蒸馏水清洗，再用乙醇清洗，在6(TC下真空干燥。(2)固定钛离子的无机MCM-41材料的制备称取10mg的磷酸酯衍生的无机MCM-41材料，与10mL，100mM的Ti(S04)2溶液室温下搅拌过夜得到固定的钛离子的MCM-41材料。得到的固定的T产的MCM-41材料用二次蒸馏水清洗，除去残留的Ti(S04)2溶液和杂质，将清洗过的MCM-41重新分散于30%ACN/0.1%TFA溶液中备用。利用制备的固定钛离子无机MCM-41亲和材料分离富集磷酸肽见实施例3-2。实施例3.固定钛离子亲和色谱材料用于磷酸肽的选择性富集样品溶液的制备lmg的ot-酪蛋白和l3-酪蛋白的分别溶解在lmL的50mM的碳酸氢铵溶液中(pH8.2)，按照与胰蛋白酶的质量比40:1的比例加入胰蛋白酶进行酶解反应，反应时间为16h,酶解温度控制在37。C。获得的蛋白酶解溶液置于-3(TC冰箱中保存备用。6.6mg的牛血清白蛋白和4.5mg的卵清蛋白分别溶解在lmL的还原性溶液中(pH8.2,8M尿素，50mM的碳酸氢铵溶液)，室温下放置4h,然后向每管溶液中分别加入25pL，1M的DTT溶液，37。C下还原2h，再向每管溶液中加入50pL，1M的IAA溶液，室温下暗处静置30min，再用50mM的碳酸氢铵溶液稀释十倍，再以胰蛋白酶和蛋白的比例按照l:40(w/w)加入，在37。C水浴下酶解16h。获得的卵清蛋白酶解液置于-30'C冰箱中保存备用。获得的牛血清白蛋白溶液分装冻干后置于-3(TC冰箱中保存备用。实施例3-1固定钛离子的聚合物亲和材料用于磷酸肽的富集(1).样品1:(X-酪蛋白酶解液1的标准磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.pL")溶解在80%ACN/6%TFA溶液中与5pL固定的T产的聚合物亲和材料(10mg.mU1)室温下振荡培育30min,然后依次分别用30的200mMNaCl/80%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振荡淋洗10min，再用10pL，10%NH3.H20(质量浓度)洗脱结合的磷酸化肽，离心收集上层清夜，冷冻干燥机中冻干。富集的磷酸肽用2含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基质溶液重新溶解，然后取0.5点靶，用MALDI-TOFMS分析。所有的MALDI-TOF质谱分析在布鲁克Autoflex飞行时间质谱仪上(Bruker,Bremen,Germany)完成，质谱仪上装有延时离子萃取装置，脉冲激光的波长为337nm。实验中得到的质谱数据都在线性正离子检测模式中进行。质谱分子量的校正采用外标法.，从标准物血管紧縮素II和胰岛素链B的离子信号对质谱校正。实验中，每个质谱是30个激光点的累加。分析结果由图2可以看出来自a-酪蛋白酶解液中的13个磷酸化肽能够特异性的被固定钛离子的聚合物亲和材料分离和富集，同时被MALDI-TOFMS质谱检测。(2).样品2:标准磷酸化P-酪蛋白，卵清蛋白的酶解液和标准的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽1的标准磷酸化P-酪蛋白,卵清蛋白的酶解液和标准的模型酪氨酸磷酸化肽(RRLIEDAEpYAARG,MW1599.00)的混合肽(1pmol.^iL—"溶解在80%ACN/6%TFA溶液中与5fiL固定钛离子的聚合物亲和材料(10mg.mL—1)室温下振荡培育30min,然后依次分别用30的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振荡淋洗10min，在用10pL，10%NH3.H2O洗脱结合的磷酸化肽，离心收集上层清夜，冷冻干燥机中冻干，加入2|iL含1%H3P04的DHB(25mg.mL—"的基质溶液，重新分散纯化的磷酸肽，然后取0.5点靶，用MALDI-TOFMS分析。分析结果由图3可以看出来自P-酪蛋白,卵清蛋白的酶解液和标准的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽的7个磷酸化肽能够特异性的被固定钛离子的聚合物亲和材料分离和富集，同时被MALDI-TOFMS质谱检测。同时，酪氨酸磷酸化肽同样能被有效的富集。因此，卵清蛋白酶解过程中引入的DTT,IAA，尿素以及酶解液中的糖基化肽段都不会干扰磷酸化肽的分离和富集。(3)样品3:半复杂样品的酶解混合物1^L的标准磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.(aL")分别与1|iL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.^L")混合得到半复杂的肽段混合物溶解在80%ACN/6%TFA溶液中与5固定化Ti"的聚合物亲和材料(10mg.mL—"室温下振荡培育30min,然后依次分别用30jiL的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振荡淋洗10min，再用10jiL，10%NH3.H2O洗脱结合的磷酸化肽，离心收集上层清夜，冷冻干燥机中冻干，加入2iiL含P/。H3P04的DHB(25mg.mL")的基质溶液，重新分散纯化的磷酸肽，然后取0.5点耙，用MALDI-TOFMS分析。分析结果由图4可以看出，磷酸肽在高丰度的非磷酸化肽的背景干扰下C非磷酸化蛋白酶解液的干扰比例高达100倍和500倍)，图4(a)可以看出，当BSA酶解液与a-酪蛋白酶解液比例在100:1时，大量的非磷酸化肽的峰主导MALDI质谱图。图4(c)和(d)可以看出，非磷酸化蛋白酶解液干扰比例在100倍和500倍的情况下，磷酸化肽仍然能被固定钛离子的聚合物亲和材料特异性的分离和富集，而得到的MALDI质谱图，13个磷酸肽的质谱峰清晰可见，而非磷酸肽没有任何保留，所获得的磷酸肽与直接富集单独的(x-酪蛋白酶解液(图4(a))中的磷酸肽的质谱图很好的匹配。实施例3-2固定钛离子的无机MCM-41材料用于磷酸肽的富集(1).样品Ol-酪蛋白酶解液1JliL的标准磷酸化(x-酪蛋白酶解液(1pmol.)iL")溶解在80%ACN/6%TFA溶液中与5(iL固定化钛离子的MCM-41(10mg.mL")室温下振荡培育30min,然后依次分别用30的80%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振荡淋洗10min，在用10pL，10%NH3.H2O洗脱结合的磷酸化肽，离心收集上层清夜，冷冻干燥机中冻干，加入2pL含l。/。H3P04的DHB(25mg.mL")的基质溶液，重新分散纯化的磷酸肽，然后取0.5pL点靶，用MALDI-TOFMS分析。分析结果由图5可以看出来自(x-酪蛋白酶解液中的13个磷酸肽能够特异性的被固定钛离子的无机MCM-41材料分离和富集，同时被MALDI-TOFMS质谱检测。(2).样品2:标准磷酸化P-酪蛋白的酶解液和标准的模型酪氨酸磷酸化肽的肽混合物1的标准磷酸化卩-酪蛋白和标准的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽(lpmol.^L—J)溶解在80%ACN/6%TFA溶液中与5固定化钛离子的MCM-41(10mg.mL—1)室温下振荡培育30min,然后依次分别用30pL的80%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振荡淋洗10min，在用10pL，10%NH3.H20洗脱结合的磷酸肽，离心收集上层清夜，冷冻干燥机中冻干，加入2)iL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基质溶液，重新分散纯化的磷酸肽，然后取0.5pL点靶，用MALDI-TOFMS分析。分析结果由图6可以看出来自(3-酪蛋白和标准的模型酪氨酸磷酸化肽的混合肽的5个磷酸肽能够特异性的被固定钛离子的无机MCM-41材料分离和富集，同时被MALDI-TOFMS质谱检测。同时，酪氨酸磷酸化肽同样能被有效的富集。比较例1.与固定锆离子亲和色谱应用于分离和富集磷酸肽的比较比较例1-1聚合物亲和材料作为基质(1)固定锆离子聚合物亲和材料固定锆离子的聚合物材料与实施例3.1中的带磷酸基团材料完全一样。称取10mg的聚合物材料，与10mL，100mM的ZrOCl2溶液室温下搅拌过夜得到固定锆离子的亲和聚合物材料。得到的固定锆离子的亲和聚合物材料用二次蒸馏水清洗，除去残留的ZrOCl2溶液和杂质，将清洗过的聚合物颗粒重新分散于30%ACN/0.1%TFA溶液中备用。(2)固定锆离子聚合物亲和材料应用于半复杂样品分离和富集磷酸化肽1pL的标准磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.pL")分别与1pL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol^L")混合得到半复杂的肽段混合物溶解在80%ACN/6%TFA溶液中与5|iL固定锆离子的聚合物亲和材料(10mg.mL")室温下振荡培育30min,然后依次分别用30的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振荡淋洗10min，再用10|aL，10%NH3.H20洗脱结合的磷酸肽，离心收集上层清夜，冷冻干燥机中冻干，加入2|iL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基质溶液，重新分散纯化的磷酸肽，然后取0.5pL点靶，用MALDI-TOFMS分析。分析结果图7(a)是直接分析(x-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩尔比在1:100时的MALDI质谱图，可以看出，大量的非磷酸肽主导MALDI质谱图。图7(b)显示了来自于oc-酪蛋白酶解液中的13个磷酸肽的MALDI质谱图。图7(c)和(d)可以看出，非磷酸化蛋白酶解液干扰比例在100倍时，来自于(x-酪蛋白酶解液中的13个磷酸肽能被固定锆离子的聚合物亲和材料特异性的分离和富集，当干扰物比例在500倍时得到的MALDI质谱图，12个磷酸肽的质谱峰清晰可见，非磷酸肽没有任何保留。尽管Zr"-IMAC对磷酸肽同样显示出高的特异性。然而，Ti4+-IMAC和Zr4+-IMAC显示出对不同磷酸肽的偏爱。从图4c和4d可以看出，单磷酸化肽(a6,YKVPQLEIVPNpSAEER)在所有的磷酸肽的峰里面，显示出最强的质谱信号。从图7c和7d可以看出，二磷酸化肽(a7,DIGpSEpSTEDQAMEDIK)显示出最强的质谱信号。因此，Ti"-IMAC显示出对单磷酸化肽更强的富集能力，而Zr4+-IMAC显示出对多磷酸化肽更强的富集能力。比较例1-2GMA-EDMA微球作为基质(1)基于GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC的制备本比较例中使用的GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC为前面非专利文献18作者所提供。详细的制备方法见文献18。(2)基于GMA-EDMA微球的Zr4+-IMAC应用于半复杂样品中分离和富集磷酸化肽1|iL的标准磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.^L—"分别与1(iL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.^iL")混合得到半复杂的酶解液，再分别与10Zr4+-IMAC(10mg.mU1分散在100%ACN溶液)混合，再加入10%HAC溶液至总体积为100jiL室温下振荡培育30min,然后依次分别用100|iL的200mMNaCl/10%HAC;10%HAC的溶液振荡淋洗10min，最后加入10(iL，10%NH3.H2O洗脱结合的磷酸化肽，离心收集上层清夜，冷冻干燥机中冻干，加入2|iL含1%H3P04的DHB(25mg.ml/')的基质溶液，重新分散纯化的磷酸肽，然后取0.5点靶，用MALDI-TOFMS分析。分析结果图8(a)是直接分析ot-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩尔比在1:100时的MALDI质谱图，可以看出，大量的非磷酸化肽主导MALDI质谱图。图8何显示了来自于cx-酪蛋白酶解液中的13个磷酸化肽的MALDI质谱图。图S(c)是非磷酸化蛋白酶解液干扰比例在100倍时，来自于ot-酪蛋白酶解液中的13个磷酸化肽能被Zr"-IMAC特异性的分离和富集，当千扰物比例在500倍时得到的MALDI质谱图(图8(d),10个磷酸化肽的质谱峰清晰可见，非磷酸化肽没有任何保留，而且磷酸化肽的峰强度明显弱于相同量的ot-酪蛋白酶解液分离和富集得到的磷酸化肽的峰。尽管基于GMA-EDMA的Zr4+-IMAC对磷酸肽同样显示出高的特异性，由于化学反应的不完全性以至得到的磷酸基团的数量有限，因此，基于GMA-EDMA的Zr4+-IMAC的表面含有相对少的活性磷酸基团而导致更少的磷酸肽的结合位点。图8c和8d可以看出，磷酸肽的质谱信号几乎比用T严-IMAC富集方法得到的质谱信号(图4c和4d)儿乎要低一倍。从图8c-d和图4c-d的比较可以看出，与聚合物基质相同的是基于GMA-EDMA的Zr4+-IMAC显示出多磷酸化肽的更强的富集能力，Ti4+-IMAC显示出对单磷酸化肽更强的富集能力。比较例2.与固定化金属离子(F^+)亲和色谱应用于分离和富集磷酸肽的比较(1)固定化金属离子(F^+)亲和色谱的活化Fe3+-IMAC(Porous20MCbeads)活化按照推荐的方法活化。称取10mg的粒子，先分别用50mMEDTA，1MNaCl清洗两遍，接着用二次蒸馏水清洗三遍，然后将清洗过的粒子分散于100mMFeCl3溶液中培育30min,此步重复三次。螯合Fe3+-IMAC粒子然后依次用0.1%HAC,500mMNaCl，ddH20清洗，最后分散于1mL二次蒸馏水中备用。(2)固定化金属离子(F^+)亲和色谱从半复杂样品中分离和富集磷酸化肽一分别取10的活化过的Fe3+-IMAC用上样缓冲液50%ACN,0.1%TFA活化30min,然后离心除去溶液，余下的Fe3+-IMAC粒子分别与半复杂的酶解液(组成为1的标准磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.pi;1)分别与1^L，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.^iL")混合溶解在50。/。ACN/0.1。/。TFA溶液中)室温下振荡培育30min,然后依次分别用100|iL的50%ACN/0.1%TFA;75%ACN/10%CH3OH/10%HAC;100|iL的10%HAC的溶液振荡淋洗10min，最后加入用10|aL，10%NH3.H2O洗脱结合的磷酸肽，离心收集上层清夜，冷冻干燥机中冻干，加入2pL含l%H3POj9DHB(25mg.mL—^的基质溶液，重新分散纯化的磷酸肽，然后取0.5点耙，用MALDI-TOFMS分析。分析结果图9(a)是直接分析a-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩尔比在1:100时的MALDI质谱图，可以看出，大量的非磷酸化肽主导MALDI质谱图。图9(b)显示了来自于a-酪蛋白酶解液中的13个磷酸化肽的MALDI质谱图。图9(c)和图9(d)是非磷酸化蛋白酶解液干扰比例在100倍和500倍时，仅仅有来自于a-酪蛋白酶解液中的5个多磷酸肽能被Fe3+-IMAC特异性的分离和富集，同时伴随有大量的非磷酸肽被保留。因此，Fe3+-IMAC相比与Ti4+-IMAC禾t]Zr4+-IMAC，显示出更差的特异性。比较例3.与二氧化钛(Ti02)应用于半复杂样品中分离和富集磷酸化肽的比较1|iL的标准磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmoLpL")分别与1pL，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.pL")混合得到半复杂的肽段混合物溶解在80%ACN/6%TFA溶液中与5pLTi02(GLsciencesInc.Tokyo,Japan)(10mg.mL-1分散在30%ACN/0.1%TFA溶液中)室温下振荡培育30min,然后依次分别用30的200mMNaCl/50%ACN/6%TFA;30%ACN/0.1%TFA的溶液振荡淋洗10min，再用10pL，10%NH3.H2O洗脱结合的磷酸化肽，离心收集上层清夜，冷冻干燥机中冻干，加入2iiL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基质溶液，重新分散纯化的磷酸肽，然后取0.5(iL点耙，用MALDI-TOFMS分析。分析结果图lO(a)是直接分析a-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩尔比在1:100时的MALDI质谱图，可以看出，大量的非磷酸肽主导MALDI质谱图。图lO(b)显示了来自于a-酪蛋白酶解液中的13个磷酸肽的MALDI质谱图。图10(c)是非磷酸化蛋白酶解液干扰比例在100倍时，来自于CC-酪蛋白酶解液中的7个磷酸肽能被Z/+-IMAC特异性的分离和富集，当干扰物比例在500倍时得到的MALDI质谱图(图10(d)，4个磷酸肽的质谱峰清晰可见，非磷酸化肽没有任何保留，而且磷酸肽的峰强度明显弱于相同量的a-酪蛋白酶解液分离和富集得到的磷酸肽的峰。因此，Ti02用于半复杂样品中磷酸肽的分离和富集，其特异性和容量明显低于Ti4+-IMAC和Zr4+-IMAC。比较例4.与二氧化锆(ZK)2)应用于半复杂样品中分离和富集磷酸化肽的比较Zr02的制备和用于分离和富集磷酸化肽按照非专利文献13的方法。1pL的标准磷酸化a-酪蛋白酶解液(1pmol.^iL力分别与1^L，5的非磷酸化蛋白牛血清白蛋白酶解液(100pmol.pL")混合得到半复杂的肽段混合物溶解在50%ACN/10%HAC溶液中与5[xLZr02粒子(10mg.mL-1分散在50%ACN/10%HAC溶液中)室温下振荡培育30min,然后依次分别用30pL的50%ACN/10%HAC;50%ACN的溶液振荡淋洗10min，再用10jiL，10%NH3.H2O洗脱结合的磷酸肽，离心收集上层清夜，冷冻干燥机中冻干，加入2jiL含1%H3P04的DHB(25mg.mL")的基质溶液，重新分散纯化的磷酸肽，然后取0.5pL点靶，用MALDI-TOFMS分析。分析结果图ll(a)是直接分析a-酪蛋白酶解液和BSA酶解液摩尔比在1:100时的MALDI质谱图，可以看出，大量的非磷酸化肽主导MALDI质谱图。图ll(b)显示了来自于(x-酪蛋白酶解液中的13个磷酸肽的MALDI质谱图。图11(c)是非磷酸化蛋白酶解液干扰比例在100倍时，来自于ct-酪蛋白酶解液中的8个磷酸肽能被Zr4+-IMAC特异性的分离和富集，当干扰物比例在500倍时得到的MALDI质谱图(图ll(d))，2个单磷酸化肽的质谱峰清晰可见，伴随着少量的非磷酸肽被保留。因此，Zr02用于半复杂样品中磷酸肽的分离和富集，其特异性和容量明显低于Ti4+-IMAC和Zr4+-IMAC。表1.固定钛离子聚合物亲和材料从模型磷酸化a-酪蛋白|3-酪蛋白,卵清蛋白的酶解液和标准的模型酪氨酸磷酸化肽分离和富集所得到的磷酸肽的分子量，序列和磷酸化位点<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>磷酸化肽SEQUENCELISTING<110>中国科学院大连化学物理研究所<120>—种固定钛离子亲和色谱材料及其制备和应用〈130>〈160〉20<170〉Patentlnversion3.1〈210〉1<211>10〈212〉PRT<213>artificial<220〉〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(I)..(IO)<223〉〈400〉1ThrValAspMetGluSerThrGluValPhe1510<210>2〈211〉12〈212>PRT<213>artificial<220>〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(12)<223><400>2ThrValAspMetGluSerThrGluValPheThi'Lys1510磷酸化肽〈210〉3<211〉12<212〉PRT<213>artificial〈220><221>PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(12)<223><400>3GluGlnLeuSerThrSerGluGluAsnSerLysLys1510<210〉4<211>14<212〉PRT<213〉artificial<220〉〈221>PHOSPHORYLATION<222>(1)..(14)<223>〈400〉4ValProGinLeuGlulieValProAsnSerAlaGluGluArg1510〈210〉5<211〉15<212〉PRT〈213>artificial<220>〈221>PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(15)〈223〉<400>5磷酸化肽TyrLeuGlvGluTyrLeulieValProAsnSerAlaGluGluArg1.51015<210>6〈211〉16〈212〉PRT<213〉artificial〈220〉〈221>PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(16)〈223〉<400〉6AsplieGlvSerGluSerThrGluAspGinAlaMetGluAsplieLys151015〈210〉7<211〉16<212>PRT<213>artificial〈220〉〈221〉PHOSPHORYLATION<222>(1)..(16)<223〉<400>7TyrLvsValProGinLeuGlulieValProAsnSerAlaGluGluArg1.51015〈210〉8〈211>19<212>PRT<213〉artificial〈220〉〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(19)〈223〉磷酸化肽〈400〉8LysLysTvrLysValProGinLeuGlulieValProAsnSerAlaGlu151015GluArgLeu<210〉9<211〉21<212〉PRT〈213〉artificial〈220〉〈221>PHOSPHORYLATION〈222>(1)..(21)〈223〉<400〉9AsnThrMetGluHisValSerSerProSerGluGluSerlielieSer151015GinGluThrTvrLys<210〉10〈211〉24<212〉PRT<213〉artificial〈220〉<221〉PHOSPHORYLATION<222>(1)..(24)〈223>〈400〉10GinMetGluAlaGluProSerlieSerSerSerGluGlulieValPro151015AsnProAsnSerValGluGinLys20'〈210〉11<211>26磷酸化肽〈212〉POT〈213〉artificial<220>〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(26)<223〉<400〉11GluLysValAsnGluLeuSerLysAsplieGlvSerGluProSerThr1'51015GluAspGinAlaMetGluAsplieLvsGin202^〈210〉12<211>25<212>PRT<213>artificial<220><221>PHOSPHORYLATION<222>(1)..(25)<223〉〈400>12AsnAlaAsnGluGluGluTyrSerlieGlvSerSerSerGluGluSer151015AlaGluValAlaThrGluGluValL、's20〈210>13〈211>25〈212>PRT<213〉artificial〈220〉〈221〉PHOSPHORYLATION〈222〉(1)..(25)〈223>磷酸化肽〈400>13AsnAlaAsriGluGluGluTvrSerlieGlvSerSerSerGluGluSer151015AlaGluValAlaThrGluGluValLys2025〈210〉14〈211〉15〈212>PRT〈213〉artificial<220>〈221〉PHOSPHORYLATION<222〉(1)..(15)<223〉<400>14PheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeuGinLys1510lb<210>15〈211>19<212>PRT〈213〉artificial<220><221>PHOSPHORYLATION〈222>(1)..(19)<223><400>15lieGluLysPheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeu151015GinAspLys〈210>16〈211〉20〈212〉PRT<213>artificial磷酸化肽〈220><221>PHOSPHORYLATION〈222>(1)..(20)<223〉<柳〉16PheGinSerGluGluGinGinGinThrGluAspGluLeuGinAspLvs151015lieHisProPhe20<210〉17<211>25〈212〉PRT〈213〉artificial<220〉〈221>PHOSPHORYLATION<222>(1)..(25)<223><400>17ArgGluLeuGluGluLeuAsnValProGlvGlulieValGluSerLeu151015SerSerSerGluGluSerlieThrArg2025<210>18〈211〉20<212〉PRT<213〉artificial〈220>〈221〉PHOSPHORYLATION〈222>(1).(20)〈223〉〈400〉18GluValValGlySei'AlaGluAlaGlyValAspAlaAlaSerValSer磷酸化肽151015GluGluPheArg20<210>19<211〉26〈212〉PRT<213〉artificial〈220><221〉PHOSPHORYLATION<222〉(1)..(26)<223〉<400〉19PheAspLysLeuProGlyPheGlyAspSerlieGluAlaGinCvsGly1510化'ThrSerValAsnValHisSerSerLeuArg2025〈210>20<211〉13<212>PRT<213>artificial<220><221>PHOSPHORYLATION<222>(1)..(13)<223><400〉20ArgArgLeulieGluAspAlaGluTvrAlaAlaArgGlv1510权利要求1.一种固定钛离子亲和色谱材料，其特征在于其可按如下过程制备获得，将含有磷酸基团的固相载体与钛离子溶液接触，利用钛离子与磷酸改性的固相载体上的磷酸基团的强相互作用，使钛离子通过磷酸配体固载在载体上，获得固定钛离子亲和色谱材料Ti4+-IMAC。2.按照权利要求l所述的固定钛离子亲和色谱材料，其特征在于所述含有磷酸基团的固相载体，磷酸基团与固相载体间为共价键合;;结构如下，<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>3.—种权利要求1所述固定钛离子亲和色谱材料的制备方法，其特征在于将含有磷酸基团的固相载体与钛离子溶液接触，利用钛离子与磷酸改性的固相载体上的磷酸基团的强相互作用，使钛离子通过固载在载体上的磷酸配体，获得固定钛离子亲和色谱材料T,-IMAC。4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述钛离子溶液为硫酸钛溶液。5.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述亲和色谱材料可通过对现有的固相载体进行化学衍生，于其表面化学健合磷酸基团制备获得。6.按照权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述固相载体为常规色谱载体中的硅胶颗粒、有机聚合物小球或琼脂糖颗粒，或者是整体柱材料、纳米材料、介孔材料、磁珠或芯片材料。7.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述亲和色谱材料可通过将含有磷酸基团的功能单体参与聚合形成的聚合物。8.按照权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述功能单体为2-(甲基丙烯酰氧)-乙基磷酸酯；所使用的交联剂为亚甲基双丙烯酰胺、二甲基丙烯酸乙二醇酯、三丙烯酸季戊四醇酯、二乙烯基苯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或N,N，-二亚甲基二丙烯酰胺；所述聚合可为本体聚合、悬浮聚合、乳液聚合或溶液聚合。9.一种权利要求1所述固定钛离子亲和色谱材料的应用，其特征在于:以固定钛离子的亲和色谱Ti4+-IMAC为分离材料分离和富集磷酸肽，磷酸肽由于与固定的钛离子之间的强螯合作用而保留在固定钛离子亲和色谱材料上，从而实现特异性地从复杂的蛋白酶解液中分离和富集磷酸肽的目的。全文摘要本发明提供了一种固定钛离子亲和色谱材料及其制备和应用，利用钛离子与磷酸改性的固相载体上的磷酸基团的强相互作用而将钛离子固定于载体上。本发明使用固定钛离子亲合色谱材料富集磷酸肽，磷酸肽由于与固定的钛离子之间的强螯合作用而保留在亲和色谱材料上使其获得分离。文档编号B01J20/286GK101396650SQ20071001296公开日2009年4月1日申请日期2007年9月26日优先权日2007年9月26日发明者叶明亮,周厚江,邹汉法申请人:中国科学院大连化学物理研究所