专利名称：一种醇羟基亲水色谱固定相及其制备方法
技术领域：
本发明涉及液相色谱固定相，具体的说是一种醇羟基亲水色谱固定相及其制备方法；其是采用dick chemistry作为键合反应方法的醇羟基亲水色 谱固定相。技术背景反相高效液相色谱(RP-HPLC)是目前使用最为广泛的高效分离技术， 但是反相色谱中使用的疏水固定相(如C18， C8等)对强极性化合物(如 寡糖，糖苷，强极性寡肽等)的保留很弱，甚至不保留。为了对强极性化 合物有较好的保留作用而达到分离的目的，使用极性固定相是一种很好的 途径。亲水作用液相色谱模式(HILIC)是近年来发展起来的用于分离强极 性化合物的色谱技术，类似于正相色谱，使用极性固定相和极性相对较小 的流动相，但与正相色谱不同的是其流动相中含水(水含量一般小于40%) [Alpert， A. J. J C/zrawatogr. 1990， 177-196]。亲水作用色谱用于分离强极性化合物(如寡糖，寡肽和极性药物分子等)已有文献报道[Strege，M.A. Anal. Chem. 1998， 70， 2439-2445; Strege, M. A. et al， Anal. Chem. 2000, 72， 4629-4633; Wang， X. D. et al， CTzra/watogr.」，2005, 1083， 58~62; Tolstikov, V. V. et al，说'oc/zew. 2002， 301, 298—307; Yoshida， T. ^加/. C&m. 1997， 69, 3038—3043; Risley， D.S. et al，爿"a/. CTze附.2000， 72， 1736-1739; Dallet， P. et al, / Ozrawatogr. 5 2000， 742， 447-452; Olsen， B. A. / 爿2001.913,113-122]。但是，亲水作用色谱的固定相依然是使用正相固定相，主要 是直接使用硅胶，氨基，氰基等作为固定相[Guo, Y. et al， J C72rawato^.A 2005, 1074, 71-80; Garbis， S. D. et al，爿wa/.C/7e/w. 2001， 73， 5358-5364]，存在 着重现性差和使用寿命短的问题。例如，键合氨基固定相在酸性条件下会发生电离，随pH变化其表面状态会发生改变；直接使用硅胶则也会因为硅 羟基在碱性条件下发生电离而改变表面结构。这些表面结构的变化会对分 离造成不可预测的影响，特别是对重现性和柱子的使用寿命有很大的影响。 目前，专门为亲水作用色谱开发的固定相刚刚起步，主要是将含甲酰 胺基，羟基的聚合物键合到硅胶上作为亲水固定相，商品化的亲水作用色谱固定相种类较少[Guo, Y. et al, Ozrawfltogr .A 2005， 1074， 71-80]。目 前，对各类亲水作用固定相缺乏系统的比较研究，还没有被广泛使用和普 遍接受的亲水作用色谱固定相[Guo, Y. et al, 乂 Ozramatogr J， 2005, 1074, 71-80]。"点击化学"(click chemistry)是美国斯克利普斯研究所(Scripps Research Institute)的K. B. Sharpless教授(2001年诺贝尔化学奖得主)在 2001年提出的一个合成化学概念，其核心内容是以高选择性，高转化率， 条件温和，操作简单的化学反应来实现功能基团的偶联，达到高效制备功 能分子和功能材料的目的。当前，最为广泛使用的"点击化学"(click chemistry)反应是Huisgen 1，3-diploar cycloaddition反应，其反应-式如下r2、 r2、n'n、、nazides acetylenes"点击化学"(clickchemistry)已经被应用到固体表面修饰的研究中，但目前 还没有使用其进行固定相键合的报道。 发明内容本发明的目的在于提供了一种新型醇羟基亲水色谱固定相及其制备方 法，以满足在亲水作用液相色谱模式下实现对强极性化合物的分离。 为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种醇羟基亲水色谱固定相，这种键合醇羟基固定相以醇羟基为极性基团，结构新颖，性质稳定，并且结构中含有1， 2， 3-三唑环结构，结构为\ /n其中，X为-OCH3或-OCH2CH3， Y为-CH200C-或者-CH2NHOC-;当 m=0时，n=0;当m=l时，n=0 4。所述的固定相的制备使用click chemistry作为键合方法，键合醇羟基作 为极性基团，即利用硅胶上的固载的叠氮基团与溶液中含醇羟基分子上修 饰的炔基的l， 3-环加成反应来实现醇羟基的键合。首先在硅胶表面引入叠氮基团，然后以水/乙醇或水/甲醇混合体系为反 应溶剂，将修饰有末端炔烃的一元或多元醇分子键合到硅胶表面，即得醇 羟基极性固定相。此固定相结构简单，性质稳定(在酸碱条件下不发生电 离)，制备过程简单(室温下水溶液体系中反应)，高效(click chemistry 选择性和转化率都可达100%)。采用该方法制备的极性固定相在水/乙腈 (水含量<40%)流动相中表现出典型的亲水作用液相色谱特征，对极性化 合物有很好的保留和分离选择性。具体步骤如下a.硅胶表面引入叠氮基团在有机溶剂中加入硅烷偶联剂、叠氮化钠 和催化剂，硅垸偶联剂、叠氮化钠与催化剂的摩尔比为1 : (1. 2 — 3 ):(0 . 0 1—0. 1 )，于60 130°C条件下反应8 24小时，然后加入经 160°C加热6 18小时的微球型硅胶，每克硅胶所需硅烷偶联剂为2-8mmol; 在60~130°C条件下继续反应12~24小时，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯 甲烷，乙醇，水，丙酮洗涤，所得固体于真空干燥箱中40~80°C条件下干
燥6 12小时，即得(3-丙基)叠氮基硅胶； 步骤a所用硅烷偶联剂有如下结构其中，X为-OCH3或-OCH2CH3， A为Cl-或Br-。该反应为X3SiNa其中，X为-OCH3或-OCH2CH3， A为Cl-或者Br-。所用有机溶剂为 乙腈、甲苯或N，N-二甲基甲酰胺，每克硅胶所需有机溶剂的量为5-20mL;催化剂为碘化钠或者碘化钾；球形硅胶是粒径和孔径均匀的全多孔硅胶小球，粒径为5 40,，孔径为60 300A。b. click chemistry键合醇羟基固定相将上述制备的(3-丙基)叠氮基 硅胶中加入体积比为1/10-10/1的水/甲醇或水/乙醇混合溶剂中，每克(3-丙基)叠氮基硅胶所需混合溶剂量为2 0 — 5 0 mL，再加入修饰有末端 炔基的醇羟基化合物、催化剂，修饰有末端炔基的醇羟基化合物加入的摩 尔剂量为硅胶上叠氮的摩尔剂量的1 10倍，最好为2 5倍，催化剂为硫 酸铜和抗坏血酸钠，所用摩尔剂量分别为修饰有末端炔基的醇羟基化合物 摩尔剂量的1 10%和2 40%;在10 80°C条件下反应24 72小时，用砂芯 漏斗过滤，依次用乙醇，水，重量浓度2-20%EDTA水溶液，水，丙酮洗 涤，所得固体于真空干燥箱中40~80°C条件下干燥6 12小时，即醇羟基 固定相；步骤b所用的修饰有末端炔基的醇羟基化合物的结构为其中Y为-CH200C-或者-CH2NHOC-;当m=0时，n=0;当m-l时， n=0~4。该反应为其中，X为-OCH3或-OCH2CH3， Y为-CH200C-或者-CH2NHOC-; m二0 时，n=0; m=l时，n=0 4。催化剂为硫酸铜和抗坏血酸钠，所用剂量分别 为修饰有末端炔基的醇羟基化合物剂量的1~10%和2 40% (摩尔比)。200610047965. 1
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图1为本发明实施例1制备的醇羟基固定相用于亲水模式下的色谱图； 图2为本发明实施例1制备的醇羟基固定相应用于分离糖的色谱图。 本发明具有如下优点
1. 采用醇羟基作为极性功能基团，其结构简单，而且作为极性固定相 在亲水作用液相色谱模式下可以实现对强极性化合物的高效分离；
2. 醇羟基作为功能基团，其性质十分稳定，其表面结构不会因为pH 的改变而发生变化，也不容易与溶质分子发生反应，避免了常用的键合氨 基固定相结构的不稳定性。
3. 采用clickchemistiy作为键合反应方法，可以在温和的条件下实现高 选择性和高转化率的固载。
具体实施例方式
本发明所述的固定相可有效地用于亲水作用色谱模式下对极性化合物 的分离。下面结合实施例和附图，对本发明做进一步说明。实施例仅限于 说明本发明，而非对本发明的限定。
在1000ml三口烧瓶中加入500ml无水甲苯，45mmo1 (约10ml) 3-氯 丙基三乙氧基硅烷，60mmo1 (约4.0g)叠氮化钠，然后加入3.0mmo1碘化 钠(约0.5g)作为催化剂，80。C下反应24h，然后加入粒径为5pm的球形 硅胶颗粒20g, 8(fC下再反应24h，然后依次用二氯甲烷，乙醇，水，丙 酮各洗涤两次，每次200ml， 60oC真空干燥12小时即得(3-丙基)叠氮 基硅胶。取2.5g千燥后(3-丙基)叠氮基硅胶于反应器中加入60ml水， 60ml乙醇，5mmo1丙炔醇(约0.3g)，然后加入0.25mmo1硫酸铜和0.75mmo1 抗坏血酸钠作为催化剂，室温下反应48h，依次用乙醇，水，10Q/。的EDTA 水溶液，水，丙酮各洗涤两次，每次100ml，室温下真空干燥12小时即得 产品，结构为
把所得醇羟基固定相填料填装于4.6mm* 150mm的不锈钢HPLC色谱 柱中，制得的色谱柱用于测试其在亲水色谱模式下对强极性化合物的保留 和分离混合样品。用于分离萘和尿嘧啶的条件为乙腈/水作为流动相，乙 腈和水的体积比为95比5，流速0.6ml/min，柱温为30°C，检测波长为254nm， 色谱图如1所示(1为萘，2为尿嘧啶)。分离结果显示，在本发明所提供 的醇羟基柱上，反相色谱柱死时间流出的强极性化合物尿嘧啶得到了很好 的保留，并且与萘得到了很好的基线分离，两者出峰顺序与常规反相柱匕 正好相反，表现出典型的亲水作用模式特征和良好的分离选择性。
使用实施例1所制备的色谱柱分离在亲水作用色谱模式下分离单糖和
实施例1
实施例2
寡糖。以乙腈/水作为流动相，梯度洗脱(水体积含量0-10分钟5-10%; 10-25分钟10%)条件下，果糖，葡萄糖，蔗糖，麦芽糖得到了良好的分
离(如图2所示，图中1， 2， 3， 4分别为果糖，葡萄糖，蔗糖，麦芽糖)。 实施例3
与实施例1不同之处在于，采用葡萄糖酸丙炔酯代替丙炔醇，按实施 例1的合成步骤可得另一种醇羟基固定相和此固定相填充的色谱柱。固定
相的结构为其结构为
oh ho
实施例4
在500ml三口烧瓶中加入200ml无水甲苯，60mmo1 (约15ml) 3-氯丙 基三乙氧基硅烷，60mmo1 (约4.0g)叠氮化钠，然后加入5.Ommo1碘化钠 (约0.5g)作为催化剂，11(fC下反应24h，然后加入粒径为5pm的球形 硅胶颗粒20g， H0。C下再反应24h，然后依次用二氯甲垸，乙醇，水，丙 酮各洗涤两次，每次200ml， 60°C真空干燥12小时即得(3-丙基)叠氮基 硅胶。取2.5g干燥后(3-丙基)叠氮基硅胶于反应器中加入60ml水，60ml 乙醇，5mmo1丙炔醇(约0.3g)，然后加入0.25mmo1硫酸铜和0.75mmo1 抗坏血酸钠作为催化剂，室温下反应48h，依次用乙醇，水，10。/。的EDTA 水溶液，水，丙酮各洗涤两次，每次100ml，室温下真空千燥12小时即得 产品，结构为
实施例5
在500ml三口烧瓶中加入300ml无水乙腈，30mmol (约7ml) 3-氯丙 基三乙氧基硅烷，40mmol (约2.6g)叠氮化钠，然后加入3.0mmol碘化钠 (约0.5g)作为催化剂，80。C下反应24h，然后加入粒径为5pm的球形硅 胶颗粒20g， 80。C下再反应24h，然后依次用二氯甲烷，乙醇，水，丙酮 各洗涤两次，每次200ml， 60°C真空干燥12小时即得(3-丙基)叠氮基硅 胶。取2.5g干燥后(3-丙基)叠氮基硅胶于反应器中加入60ml水，60ml 乙醇，5mmol丙炔醇(约0.3g)，然后加入O.lmmol硫酸铜和0.3mmo1抗 坏血酸钠作为催化剂，室温下反应48h，依次用乙醇，水，10%的EDTA 水溶液，水，丙酮各洗涤两次，每次100ml，室温下真空干燥12小时即得<formula>formula see original document page 8</formula>
实施例6
在500ml三口烧瓶中加入300ml无水N，N-二甲基甲酰胺，30mmol(约
7ml)3-氯丙基三乙氧基硅烷，40mmol(约2.6g)叠氮化钠，然后加入3.0mmo1 碘化钠(约0.5g)作为催化剂，110°C下反应24h，然后加入粒径为5pm 的球形硅胶颗粒20g， U0。C下再反应24h，然后依次用二氯甲烷，乙醇， 水，丙酮各洗涤两次，每次200ml， 60。C真空干燥12小时即得(3-丙基) 叠氮基硅胶。取2.5g干燥后(3-丙基)叠氮基硅胶于反应器中加入60ml 水，60ml乙醇，5mmo1丙炔醇(约0.3g)，然后加入O.lmmol硫酸铜和 0.3mmol抗坏血酸钠作为催化剂，室温下反应48h，依次用乙醇，水，10% 的EDTA水溶液，水，丙酮各洗涤两次，每次100ml，室温下真空干燥12 小时即得产品，结构为
权利要求
1.一种醇羟基亲水色谱固定相，其特征在于其结构为，其中，X为-OCH3或-OCH2CH3，Y为-CH2OOC-或者-CH2NHOC-；当m＝0时，n＝0；当m＝1时，n＝0～4。
2. —种权利要求l所述的固定相的制备方法，其特征在于使用Clickchemistry作为键合方法，键合醇羟基作为极性基团，包括如下步骤a. 硅胶表面引入叠氮基团在有机溶剂中加入硅垸偶联剂、叠氮化钠 和催化剂，硅烷偶联剂、叠氮化钠与催化剂的摩尔比为l : 1. 2 — 3: 0 . 0 1 — 0 . 1 ，于60~130°C条件下反应8~24小时，然后加入经160°C 加热6~18小时的微球型硅胶，每克硅胶所需硅烷偶联剂为2-8mmol;在 60~130°C条件下继续反应12 24小时，用砂芯漏斗过滤，依次用二氯甲烷， 乙醇，水，丙酮洗涤，所得固体于真空干燥箱中40 80。C条件下干燥6 12 小时，即得(3-丙基)叠氮基硅胶；b. click chemistry键合醇羟基固定相将上述制备的(3-丙基)叠氮基 硅胶中加入体积比为1/10~10/1的水/甲醇或水/乙醇混合溶剂中，每克(3-丙基)叠氮基硅胶所需混合溶剂量为2 0 — 5 0 mL，再加入修饰有末端 炔基的醇羟基化合物、催化剂，修饰有末端炔基的醇羟基化合物加入的摩 尔剂量为硅胶上叠氮的摩尔剂量的1~10倍，催化剂为硫酸铜和抗坏血酸 钠，所用摩尔剂量分别为修饰有末端炔基的醇羟基化合物摩尔剂量的 1 10%和2 40%;在10 80。C条件下反应24 72小时，用砂芯漏斗过滤， 依次用乙醇，水，重量浓度2-20%EDTA水溶液，水，丙酮洗涤，所得固 体于真空千燥箱中40~80°C条件下干燥6~12小时，即醇羟基固定相。
3. 按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤a所用的有机 溶剂为乙腈，甲苯或N， N-二甲基甲酰胺;每克硅胶所需有机溶剂的量为5-30 mL。
4. 按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤a所用硅烷偶联剂有如下结构<formula>formula see original document page 2</formula>其中，X为-OCH3或-OCH2CH3， A为Cl-或Br-。
5. 按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤a所用的催化 剂为碘化钠或者碘化钾。
6. 按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤a所用的球形 硅胶是粒径和孔径均匀的全多孔硅胶小球，粒径为5 40pm，孔径为 60~300A。
7.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤b所用的修饰 有末端炔基的醇羟基化合物的结构为其中Y为-CH200C-或者-CH2NHOC-;当m=0时，n=0;当m=l时， n=0~4。
8.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤b所用的修饰有末端炔基的醇羟基化合物的摩尔比剂量为硅胶上叠氮的摩尔比剂量的2~5倍。
全文摘要
一种醇羟基亲水色谱固定相，其结构为右式，其中，X为-OCH<sub>3</sub>或-OCH<sub>2</sub>CH<sub>3</sub>，Y为-CH<sub>2</sub>OOC-或者-CH<sub>2</sub>NHOC-；当m＝0时，n＝0；当m＝1时，n＝0～4。本发明采用clickchemistry作为键合反应方法首先在硅胶表面引入叠氮基团，然后以水/乙醇或水/甲醇混合体系为反应溶剂，将修饰有末端炔烃的一元或多元醇分子键合到硅胶表面，即得醇羟基极性固定相。此固定相结构简单，性质稳定(在酸碱条件下不发生电离)，制备过程简单(室温下水溶液体系中反应)，高效(clickchemistry选择性和转化率都可达100％)。采用该方法制备的极性固定相在水/乙腈(水含量＜40％)流动相中表现出典型的亲水作用液相色谱特征，对极性化合物有很好的保留和分离选择性。
文档编号B01J20/288GK101152624SQ20061004796
公开日2008年4月2日 申请日期2006年10月1日 优先权日2006年10月1日
发明者青 徐, 梁鑫淼, 郭志谋, 雷爱文 申请人:中国科学院大连化学物理研究所