专利名称：：用于液相色谱的组合柱以及相关系统和方法
技术领域：
：本发明涉及液相色谱，更具体而言涉及用于液相色谙的组合柱(integratedcolumn),含有组合柱的系统，以及使用组合柱的方法。
背景技术：
：在液相色i普系统或全溶液液相色镨系统中，液相色语(LC)柱位于进样器和检测器之间，用于将一种或多种目的成分从待分析样品中的各种干扰物中分离出来，并使得检测器可以对这些成分进行检测。液相色谱系统中的常用质量检测器可以按照样品组分的每单位时间或每单位体积的质量来测量和提供结果。由这种输出信号可以提供"色谱图"。操作者可使用色镨图来准确地识别和定量分析样品中存在的化学组分。目前色镨学的趋势是使用高效和微型的液相色谱柱。最近对于樣吏型化的强烈需求的理由是微型化液相色谙柱所消耗的溶剂量极低，用于分析所需的样品体积也显著降低，因此就可以在样品量有限时提供高效、灵敏的分离。在液相色谦学中，使用填充有微颗粒的直径很窄的柱可获得高分离度。填充有微型化微颗粒的液相色谱柱通常是通过将例如键合二氧化硅颗粒的分离介质均匀地填充到窄直径的管中而制备的，这种分离介质也被称为填料或固定相。通常用来制备微型化分析柱的材料包括聚合物、玻璃、金属、烧结二氧化硅(fusedsilica)及其亚类聚合物涂敷的烧结二氧化硅和聚合物包裹的烧结二氧化硅。代表性材料通常包括不锈钢和玻璃衬里的不锈钢。微型化液相色镨柱包括小孔柱、微孔柱和毛细管柱。这些柱通常的长度为约5mm至300mm之间，但在有些情况下它们的长度也可能达到最长为5000mm。小孔柱通常的内径为约2腿，而微孔柱的直径为约1mm。烧结二氧化硅柱和其他毛细管柱的内径通常小于1mm，经常还小于0.1mm。实际上，具有0.075mm内径的毛细管柱几乎成为了用于液相色i普质语的标准品。烧结二氧化硅毛细管柱可以承受例如9000psi或更高的高填充压。在蛋白质组学领域中，已经将填充有反相材料的二氧化硅毛细管用于蛋白质/肽的HPLC-MS/MS分析。该方法使用了连接有质量检测器的高效液相色镨(HPLC)系统。HPLC可分离上千种蛋白质/肽，然后通过串联质镨进行表征。通过将质镨/质镨(MS/MS)镨图与理论上的镨图进行匹配而识别肽序列。通过将肽序列与来自基因组学或蛋白质组学数据库的预计片段进行匹配而识别蛋白质序列。虽然一维反相(RP)HPLC加上质量分析是用于蛋白质/肽分析的有力工具，但是该方法却受到一根柱上能负载和分离的肽的数量以及质i普仪能检测的肽的数量的固有限制。在复杂的样品中可能有几千种蛋白质。为了提高HPLC分离的毛细管的分离能力而使用了二维HPLC技术，该技术使用离子交换色i普和RPHPLC的组合，先用离子交换色镨根据肽的电荷分离肽，再使用RPHPLC根据肽的疏水性分离肽。一个实例是使用填充混合床喷头通过离子交换-反相分离来分离肽，然后进行质量分析。JohnYates报道了使用二维LC-MS/MS对酵母蛋白质组进行的蛋白质组学分析。将肽混合物上样至离子交换柱上并用不同盐浓度洗脱。通过反相梯度分离肽级分，然后用串联质i普仪进行分析。通过这种方法利用数据库识别了几千种蛋白质。这一方法具有二维LC分离的优势，但是在反相-串联质量分析前需要进行大量的洗涤以除去盐。填充混合床也不够稳定，仅能用于几次注入。另一个实例是使用分析性维度的强阳离子交换(SCX)柱与两个反相柱联合，以分离蛋白质胰蛋白酶消化产物。复杂的样品可以在SCX柱上预分级，收集并在反相柱上分离至最终的分离度，通过质镨仪检测和识别。两个反相柱可以在同一时间分别用于上样/清洗和分离。这种系统是用于分离复杂的蛋白质混合物的有力工具。但是，它需要两套HPLC泵、两个反相HPLC柱以及用于操作该系统的复杂的软件。常规的一维HPLC系统不能用于进^f亍同样的分离。因此，需要一种使用一维HPLC系统而且不需盐梯度的HPLC方法或系统，来实现目前必须通过二维HPLC-MS/MS分析才能实现的蛋白质/肽混合物的分离。
发明内容本发明涉及用于液相色谱的组合柱，包括一个第一柱(或段)和一个第二柱(或段)。这两个柱(或段)具有正交的分离模式。此处正交的分离模式的含义是指两种不同的分离机制。具有正交分离模式的两个柱通常填充有两种不同的固定相。例如一个柱可选自阳离子交换柱、阴离子交换柱、亲和柱和金属螯合柱；另一个柱可为反相柱。在另一个实例中，两个柱各自独立地选自阳离子交换柱、阴离子交换柱、亲和柱、金属螯合柱和反相柱。用于组合柱的流动相应与质语仪相兼容，这样就可以不需要因为盐梯度而引起的过多的洗涤柱的过程。例如，可以使用具有pH梯度的流动相根据蛋白质/肽的等电点(pl)来分离它们。然后再使用适于反相分离的流动相。根据本发明的某一个实施方案，具有正交分离模式的两个柱可以通过管和接头相连接；可以直接相连；或者可以通过螺母和接头直接相连。在另一个实施方案中，组合柱的两段被填充在一根柱中而形成混合床HPLC柱。例如，柱的一段填充有强阳离子交换材料，而柱的其余段填充有反相材料。在另一个实施方案中，第一柱为一个样品制备管。样品制备管的一个实例是一种两端带有过滤器而中间为固定相的容器。在某一个实施方案中，组合柱还可以包括一个或多个附加的柱(或段)。组合柱所使用的材料可以选自但不限于烧结二氧化硅、聚合物涂敷的烧结二氧化硅、聚合物包裹的烧结二氧化硅、不锈钢、玻璃、玻璃衬里的不锈钢、金属或聚合物。组合柱的柱或段可以是HPLC芯片的形式。HPLC芯片是一种基于微流体芯片的装置，可以用于进行纳流高效液相色谦(HPLC)。HPLC芯片的一个实例是一种比信用卡稍小的可重复利用的微流体聚合物芯片。HPLC芯片在聚合物芯片上直接集成了纳流LC系统的样品富集和分离柱以及用于电喷雾质谱的喷头，并将它们精密地连接在一起。在某一个实施方案中，各柱的内径独立地为约0.05mm至约10mm之间，优选地为约0.15mm至约4.6mm之间，更优选地为约0.15mm至约1.0mm之间。在某一个实施方案中，各柱的长度独立地为约5mm至约500mm之间，优选地为约20mm至约300mm之间，更优选地为约100咖至约250mm之间。本发明还提供一种用于分析混合物的液相色谱系统，所述系统包括一个进样器、至少一套HPLC泵、一套用于液相色镨的组合柱、一种或多种流动相和一个检测装置，其中所述组合柱包括一个第一柱(或段)和一个第二柱(或段)，其中所述的第一柱和第二柱具有正交的分离才莫式。在某一个实施方案中，系统中的所述组合柱还可包括一个或多个附加的柱(或段)，优选地有一个至最多十个、一个至最多六个，更优选地有一个或最多两个附加的柱(或段)。在某一个实施方案中，所述系统含有一套HPLC泵。一套HPLC泵包括一个或多个HPLC泵。例如通常一个一维HPLC系统具有一套HPLC泵。在某一个实施方案中，所述检测装置为质谱仪。在某一个实施方案中，所述一种或多种流动相与质谦仪相兼容。例如，可为具有pH梯度的流动相续之以适用于RPHPLC的流动相。pH梯度可为阶梯性梯度、连续梯度或它们的组合。本发明还涉及使用组合柱和/或含有组合柱的系统来分离混合物的方法。可被分离的混合物包括但不限于小分子，蛋白质或肽，或者它们的组合。图l显示了组合柱的一个实例，其中第一柱和第二柱是直接连接的。图1A为该组合柱的一部分的放大图，显示了第一柱和第二柱之间的连接以及分析柱的末端接头。图IB为该组合柱一个末端的放大图。图2显示了组合柱的一个实例，其中第一柱和第二柱之间通过毛细管相连接。图3显示了组合柱的一个实例，其中第一段和第二段为填充在一根柱内的两种不同的固定相。图4和图5显示了使用组合的离子交换-反相柱分离小鼠肝脏蛋白质得到的色谦图。具体实施例方式目前进行的大多数二维HPLC分离方法都使用了强阳离子交换柱和反相HPLC柱。先通过强阳离子交换再通过反相分离，从而对蛋白质/肽混合物进行分级。然而常规的阳离子交换分离需要使用与质镨仪不兼容的盐梯度。这样就必须进行离线阳离子交换分离，或者在质量分析前必须在上样后进行大量的洗涤柱的过程。本发明通过使用组合柱和含有组合柱的系统以及一种或多种与质谱仪相兼容的流动相，而解决了这一问题。图1显示了组合柱的一个实例110。组合柱110包括第一柱103和第二柱104。柱103和104通过螺母106、末端接头102和末端接头107相连接。如图1所示，柱IIO也可包括末端螺母101、末端接头102、末端接头107和过滤器板(frit)105。当使用组合柱110进行蛋白质/肽分离时，例如，将分析混合物在低pH条件下上样至强阳离子交换柱上。然后通过溶剂分选器将少量的pH緩冲液泵入柱中，或者通过注射回路将少量的pH緩冲液注入柱中。通过改变pH緩沖液的梯度，根据蛋白质/肽的等电点(pl)对混合物分级。当流动相的pH等于或高于它们的pl时，蛋白质/肽就不再带负电并从阳离子交换柱上被洗脱下来。然后使用适用于反相HPLC分离的流动相，通过反相HPLC柱对该级分进一步分离。分离中仅需使用少量的pH緩冲液。不使用盐梯度。这样就使得HPLC系统可以与质镨仪直接相连而不需要大量的洗涤柱的过程，分离中使用的pH緩冲液与质傳仪相兼容。例如，可使用曱酸、乙酸或柠檬酸作为酸。可使用氨水或取代胺作为碱。通过使用组合柱和与质i普仪相兼容的流动相，本发明用一个HPLC系统实现了复杂的蛋白质/肽混合物的分离。在此之前，只有通过使用两个HPLC系统的常规二维HPLC分离才能实现这一效果。图1A为组合柱110的一部分的放大图，显示了第一柱103和第二柱104之间是通过连接螺母106、末端接头102和末端接头107直接相连接，它还可包括过滤器板105。图1B为組合柱IIO—个末端的放大图，显示末端螺母IOI、末端接头102和末端接头107。图2显示了组合柱的另一个实例210,在这一实例中，第一柱203和第二柱204之间通过毛细管206相连接。柱210还可包括末端螺母201、末端接头202、末端接头207和过滤器板205。图3显示了组合柱的又一个实例310。柱310为混合床HPLC柱。在这一实例中，第一柱为第一段303，第二柱为第二段304。段303和段304为填充在一才艮柱内的两种不同的固定相。例如，柱310的一部分为段303，填充有强阳离子交换材料，而柱的其余部分为段304，填充有反相材料。柱310还可包括末端螺母301、末端接头302、末端接头307和过滤器板305。在段303和段304之间可以含有过滤器板或过滤器(图3中未示出)。图1、图2和图3显示了本发明的一些实例，对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明范围的情况下还可以产生多种变化形式。例如段303和段304可被填充至电喷雾界面喷头(ESI喷头)中。组合柱的柱或段可以是HPLC芯片的形式。以下实施例说明了使用组合柱的多种应用中的一种。实施例材料本实验中使用的水是使用Milli-Q系统(Millipore，Bedford,MA，USA)制备的。尿素、二硫苏糖醇(DTT)、碳酸氢铵和捵乙酰胺(IAA)购自Bio-Rad(Hercules,CA,USA)。盐酸胍和柠檬酸购自Sigma(St.Louis，MO,USA)。胰蛋白酶购自Promega(Madison,WI，USA)。曱酸(FA)、三氟乙酸和乙腈购自Aldrich(Milwaukee,WI,USA)。三曱胺购自AppliedBiosystems(FosterCity,CA，USA)。氩氧化铵购自ShanghaiChemicalPlant(Shanghai,China)。除了乙腈为HPLC级纯度以外，其余所有4匕学品均为分析纯。方法I.样品制备总肝脏样品将小鼠肝脏(1.0g)悬浮于10ml裂解緩沖液中，该裂解緩冲液含有8M尿素、4%的3-[(3-胆酰胺丙基)二曱氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、65mM二硫苏糖醇(DTT)和40mM的2-氨基-2-(鞋曱基)-1，3-丙二醇(Tris)。将悬液匀浆化约1分钟，超声处理lOOwx30秒，然后以25000g(RCF)离心1小时。上清液中含有总肝蛋白质。使用牛血清清蛋白(BSA)作为蛋白质标准，通过Bradford蛋白质分析来评估蛋白质含量。II.胰蛋白酶消化将蛋白质样品(600ng)过滤并重新溶于还原溶液(6M盐酸胍，100mM碳酸氢铵，pH8.3)中。然后将含蛋白质样品的lOOju1还原溶液中与2jli1的1M二疏苏糖醇混合。将混合物在56。C培养1小时。加入10pl的1M碘乙酰胺，然后将混合物在室温下避光培养40分钟。将蛋白质混合物离心并重新溶于100mM碳酸氢铵緩沖液中，然后加入胰蛋白酶(50:1),在37r培养20小时。IE.2DLC-MS/MS鸟枪法分析使用LCQDecaXPPlus离子阱质镨仪(Thermo,SanJose,CA)进行2DLC-MS/MS实验。在组合柱上装备了含有自动采样器和高压泵的Surveyor液相色镨系统(Thermo，SanJose，CA)。组合柱包括两段。前段为SCX，后段为RP。SCX所用的液相色镨溶剂为一系列不同pH的溶液(pH2.5、pH3、pH3.5、pH4、pH4.5、pH5、pH5.5、pH6、pH7、pH8)。pH2的溶液为酸(曱酸、柠檬酸等)的水溶液，pH8的溶液为碱(氢氧化铵、三甲胺等)的水溶液。使用碱将酸性溶液的pH值从pH3调节至pH7。用于RP梯度的液相色镨溶剂例如，流动相A:0.1%的甲酸水溶液(v/v);流动相B:0.1°/。的曱酸乙腈溶液(v/v)。使用Surveyor自动采样器(AS)的no-waste功能，将经过月夷蛋白酶消化的肽混合物注入至组合柱的上端。使用LC泵或自动采样器的全回路注射功能，将pH2.5的溶液加至组合柱中。然后用流动相A洗涤组合柱一段时间(例如80分钟)。然后用RP梯度溶液例如5%至65%的流动相B洗脱115分钟。使用一系列不同pH值的溶液代替pH2.5的溶液重复上述步骤，例如寸吏用pH3、pH3.5、pH4、pH4.5、pH5、pH5.5、pH6、pH7和pH8的溶液。使用装备有Orthogonal电喷雾离子源的MS分析洗脱下来的肽。加热毛细管的温度设定为200。C.在ESI针头上施加3.3kV的电压产生了明显的信号。标准化的碰撞能为35.0。通过自动增益控制调节离子阱中储存的离子数量。按照如下的DynamicExclusionTM设置来^l定质谱仪重复计数3、重复时间0.8分钟、排除时间3.0分钟；使其在进行一次全MS扫描后就对MS诿中强度最高的三个离子进行三次MS/MS扫描。IV.蛋白质识别使用BioWorksTM软件包中的TurboSEQUEST程序，将所得的MS/MS谱自动针对人类蛋白的蛋白质数据库(EMBL-EBI人类蛋白质组系列，公开于06/04/2004)进行检索。具有的ACn评分至少在0.1以上(不论电荷状态如何)的SEQUEST结果才被接受。对于+1电荷状态的肽，如果它已被胰蛋白酶完全降解并且具有至少为1.9的交互相关性(Xcorr)时就被接受。对于+2电荷状态的肽，当它具有的Xcorr〉2.2时就被接受。对于+3电荷状态的肽，当它具有的Xcorr>3.75时就净皮接受。图4和图5显示了使用组合柱的二维LC-MS/MS分离肽混合物得到的色谱图。来自小鼠肝脏蛋白质的胰蛋白酶消化产物的肽先被上样至强阳离子交换柱的顶端，然后通过注入pH緩冲液流而将肽洗脱至反相柱中。当每种緩冲液流过离子交换柱时，就有一种级分的肽被洗脱至反相柱的顶端。然后肽通过反相梯度分离并通过串联质谱进行分析。将MS/MS谱用于数据库检索并通过Biowork3.0软件识别蛋白质。结果总结于表l。通过这种方法共从小鼠肝脏中识别了1105种蛋白质。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在一定程度上具体描述了本发明。本领域技术人员应当理解，本发明实施方案中的公开内容仅为举例的方式，在不脱离本发明范围和精神的前提下，对各个部分的排列和组合可以进行很多种变化。本领域技术人员可以理解，虽然本文所述的实施方案在形式和排列上似乎包含了对于所展示的信息单元的一些限制，但是本发明的可应用性远远超出了这些实施方案。权利要求1.一种用于液相色谱的组合柱，包括一个第一柱和一个第二柱，其中所述第一柱和所述第二柱具有正交的分离模式。2.根据权利要求1的组合柱，其中所述第一柱选自阳离子交换柱、阴离子交换柱、亲和柱和金属螯合柱；所述第二柱为一个反相柱。3.根据权利要求1的组合柱，其中所述第一柱为一个反相柱；所述第二柱选自阳离子交换柱、阴离子交换柱、亲和柱和金属螯合柱。4.根据权利要求1的组合柱，其中所述第一柱和第二柱通过管和接头相连接。5.根据权利要求1的组合柱，其中所述第一柱和第二柱直接相连。6.根据权利要求5的组合柱，其中所述第一柱和第二柱通过螺母和接头直接相连。7.根据权利要求1的组合柱，其中所述第一柱为组合柱的第一段，所述第二柱为组合柱的第二段，并且所述第一段和第二段被填充在一根柱中。8.根据权利要求1的组合柱，其中所述第一柱为一个样品制备管。9.根据权利要求1的组合柱，所述组合柱还包括一个或多个附加的柱。10.根据权利要求1的组合柱，其中所述第一柱和第二柱所包括的材料独立地选自烧结二氧化硅、聚合物涂敷的烧结二氧化硅、聚合物包裹的烧结二氧化硅、不锈钢、玻璃、玻璃衬里的不锈钢、金属或聚合物。11.根据权利要求1的组合柱，其中所述第一柱和第二柱为HPLC芯片。12.根据权利要求1的组合柱，其中所述第一柱和第二柱的内径独立地为约0.05mm至约10mm之间。13.根据权利要求12的组合柱，其中所述第一柱和第二柱的内径独立地为约0.15mm至约4.6腿之间。14.根据权利要求13的组合柱，其中所述第一柱和第二柱的内径独立地为约0.15mm至约1.0mm之间。15.根据权利要求1的组合柱，其中所述第一柱和第二柱的长度独立地为约5mm至约500mm之间。16.根据权利要求15的组合柱，其中所述第一柱和第二柱的长度独立地为约20mm至约300腿之间。17.根据权利要求16的组合柱，其中所述第一柱和第二柱的长度独立地为约50mm至约250mm之间。18.根据权利要求1的组合柱，其中所述正交分离模式中的一种包括一种具有pH梯度的流动相。19.一种用于分析混合物的系统，所述系统包括一个进样器；至少一套HPLC泵；一套用于液相色谱的组合柱，所述组合柱包括一个第一柱和一个第二柱，其中所述的第一柱和第二柱具有正交的分离模式；一种或多种流动相；以及一个检测装置，20.根据权利要求19的系统，其中所述的组合柱还可包括一个或多个附力口的柱。21.根据权利要求19的系统，其中所述至少一套HPLC泵只由一套HPLC泵组成。22.根据权利要求19的系统，其中所述检测装置为一台质谱仪。23.根据权利要求19的系统，其中所述一种或多种流动相与质镨4义相兼容。24.根据权利要求23的系统，其中所述一种或多种流动相中的至少一种为一种具有pH梯度的流动相。25.—种使用根据权利要求1的组合柱来分离混合物的方法。26.根据权利要求25的方法，其中所述的混合物为蛋白质、肽、小分子，或者它们的组合。27.—种使用根据权利要求19的系统来分离混合物的方法。28.根据权利要求27的方法，其中所述的混合物为蛋白质、肽、小分子，或者它们的组合。全文摘要公开了一种用于液相色谱的组合柱。还公开了含有该组合柱的系统和使用该组合柱的方法。文档编号B01D15/08GK101115540SQ200580047890公开日2008年1月30日申请日期2005年12月6日优先权日2004年12月8日发明者嵘曾,谢佳辉申请人:谢佳辉;曾嵘