巢式固定好氧反硝化菌耦合沉水植物在湖泊修复中的应用及装置的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境生物学领域，更具体涉及一种巢式固定化好氧反硝化菌耦合沉水植物在湖泊生态修复中的应用，同时还涉及一种巢式固定化好氧反硝化菌耦合沉水植物在湖泊生态修复中的装置。
【背景技术】
[0002]富营养化湖泊中氮素的消减是污染治理、湖泊修复的关键，反硝化作用是湖泊水体脱氮的限制性步骤。硝态氮经过反硝化作用依次形成亚硝态氮、一氧化氮、一氧化二氮，最终形成氮气而被彻底去除。湖泊可以通过自净作用脱氮，这主要依赖于沉积物和水体微生物的反硝化作用。好氧反硝化菌可以在有氧条件下进行反硝化作用，因其对氧的耐受范围广、生长周期短、同步异养硝化好氧反硝化等优点，许多株好氧反硝化菌从不同类型的反应器和自然生态系统中被分离出来。
[0003]为了解决好氧反硝化菌直接投放于工艺中存在的脱氮效率低、菌种易流失、脱氮稳定性差等问题，菌株的固定化方法相继被开发出来。例如用海藻酸钠和聚乙烯醇等材料进行菌株的包埋，用高分子有机生物质载体进行负载等(张雪琪，2014)。已有研究表明，生物质载体和聚乙烯醇对好氧反硝化菌的固定具有良好的化学稳定性，可回收利用性，可再生性等优点，还可用作人工湿地的高效脱氮填料(专利号:ZL 201320576702.5; ZL201310680417.2)。然而将其应用到湖泊的原位修复中，却受到湖泊环境条件的限制。湖泊水体中的氧含量远低于空气，使菌种在氧的获得上受到限制，反硝化不彻底容易出现亚硝态氮的积累；反硝化过程的实现还依赖于充足的碳源为反硝化菌提供电子供体，然而自然水体中可被反硝化微生物直接利用的碳源较为缺乏，这亦使反硝化作用受阻；湖泊的原位生态修复是一个人为干预的生态演替过程，涉及湖泊生态系统中诸多因素的相互促进、相互牵制、共同参与，因而单一的菌株投放对湖泊生态的影响力，可能不足以改变反硝化作用的强度，需要不同生物型、生态位的生物共同作用。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是在于提供了一种巢式固定化好氧反硝化菌耦合沉水植物在湖泊生态修复中的应用。克服了好氧反硝化菌应用于湖泊治理时，由于湖泊水体含氧不足、可直接利用碳源的缺乏对反硝化顺利进行的限制，同时通过生物质载体的特殊结构耦合湖泊高等水生植物，实现了沉水植被退化的受污染湖泊中植被的重建与恢复。
[0005]本发明的另一个目的是在于提供了一种巢式固定化好氧反硝化菌耦合沉水植物在湖泊生态修复中的装置，该装置结构简单，使用方便，消除了湖泊底质对沉水植物生长的限制，促进了湖泊沉水植物的扩繁。
[0006]为了实现上述技术目的，本发明采取了如下技术方案:
一种巢式固定化好氧反硝化菌耦合沉水植物在湖泊修复中的应用，其步骤是: I)丝瓜络小柱的预处理:取老熟的丝瓜剥去外皮，除去内瓤，切成底面边长为Icm的正六边形、高为5cm的六边柱状体(图1)，放在沸水(100°C左右)中煮沸20~30min，然后用自来水冲洗30?60s，放在去离子水中浸泡12?24h，在68?72 °C烘箱中烘5?6h至恒重，于干燥器中贮存备用。
[0007]2)好氧反硝化细菌菌悬液制备:采用已有的好氧反硝化菌株制备细菌浓度为9 X15?9X107cfu/mL的菌悬液。该菌株来源于本实验室已筛选出的细菌，筛选方法请见农业环境科学学报，2010年第6期，人工湿地高效好氧反硝化菌的分离鉴定及反硝化特性研究。
[0008]所述的细菌菌株保藏编号CCTCC N0:M2013488；
所述的好氧反硝化细菌菌悬液的制备方法请见授权专利一种固定化好氧反硝化菌的制备方法:授权专利号为ZL 201310423208.X；
3)好氧反硝化细菌的固定:将120g聚乙烯醇加热溶解于温度为60?80°C的1040mL去离子水中，冷却至30?40 °C后放置于室温(20?25 °C，以下相同)下23?25h，同160mL细菌浓度为9X 15?9 X 107cfu/mL的好氧反硝细菌的菌悬液混合均匀，然后放入28?30根已灭菌的丝瓜络小柱，使混合液浸入到丝瓜络的缝隙中；
4)固定化好氧反硝化菌巢式载体制备:为了将固定有好氧反硝化菌的丝瓜络小柱复合形成图2所示的蜂巢状，申请人利用一个制备支架(图3、图4)辅助小柱的排列和交联。将巢式载体制备支架锁扣扣住，高温(121°C)灭菌30min后，浸泡于饱和硼酸溶液中，用无菌镊子将浸满好氧反硝化菌液和聚乙烯醇混合液的丝瓜络转移到制备支架中，并排列成图2所示的蜂巢状，于4°C冰箱中交联固化12?24h，使独立的小柱粘合形成巢式结构。交联完毕，将支架锁扣打开，自下而上取出巢式载体，用无菌水洗涤2?3次后转移至0.9%的生理盐水中，于4C冰箱中It存备用；
5)植物根系与巢式载体联合:在步骤(4)制得的巢式载的体巢孔中分别插入I?3株沉水植物成株的根系，使茎叶部分留于巢孔上方，根系则通过巢孔与固定化的好氧反硝化菌充分接触。根系泌氧形成的局部好氧区，可以为好氧反硝化菌供氧，同时根系分泌的有机酸等小分子有机碳化合物，为好氧反硝化菌提供易于利用的碳源。
[0009]所述的沉水植物为满足当地气候及水域条件的苦草、菹草、黑藻、穗花狐尾藻、金鱼藻以及伊乐藻等其中的一种或二至六种的任意组合；
6)断枝处理:剪断巢式载体底部过长的根系组织，并从植物顶端剪断过长的叶，保留植株叶长20?25cm，然后把巢式载体置于一块无纺布上，将剪断的根和叶再次剪成0.5?1.0cm的碎片并平均分配入巢孔中。对于植物成株，从根尖一端剪掉少量根系组织，不会对植物的存活造成显著影响，还会刺激植物生长激素的分泌，促进新根的萌发和伸长。
[0010]7)包裹载体:以无纺布包裹巢式载体，露出沉水植物的茎叶部分，放置于水体的沉积物-水界面。剪碎的根系可以进一步被水体中纤维分解型微生物分解成新的易于被好氧反硝化菌利用的碳源，成为一种缓释性的生态碳源补充剂。
[0011]—种巢式固定化好氧反硝化菌耦合沉水植物在湖泊生态修复中的装置，它由负载有好氧反硝化菌的丝瓜络小柱及小柱排列形成的巢孔组成。为了将负载有好氧反硝化菌的丝瓜络小柱复合形成图2所示的蜂巢状装置，申请人利用一个制备支架辅助小柱的排列和交联。该支架由底板、垂直轴、十个巢孔(9 一 20个，可以更多)、第一锁扣、第二锁扣、第三锁扣、第四锁扣、第一合页、第二合页、第一直角面、第二直角面组成。其连接关系是:垂直轴和十个巢孔垂直焊接在底板的表面，其中垂直轴焊接在正方形底板的一个顶点处，十个巢孔均为底面为正六边形的不锈钢柱状体(形状与丝瓜络小柱相同)，垂直轴焊接在在底板的平面上，使组件之间以间隔一个正六边形柱状体的方式排列分布。通过第一合页、第二合页把第一直角面、第二直角面连接到垂直轴上，使第一直角面、第二直角面可以沿垂直轴旋转，形成如图3所示的闭合状态或图4所示的打开状态。第一锁扣、第二锁扣、第三锁扣均为不锈钢质地的圆环，第四锁扣为一根刚好可以穿过圆环的不锈钢具柄插杆。第一锁扣、第二锁扣均焊接在第一直角面上，第三锁扣焊接在第二直角面上。当第一直角面、第二直角面沿垂直轴旋转至闭合状态时，第一锁扣、第二锁扣、第三锁扣在垂直方向上重叠，将第四锁扣的插杆自上而下依次穿过第一锁扣、第三锁扣、第二锁扣的圆环，第一直角面、第二直角面被固定在闭合状态下。这一支架可以辅助负载有好氧反硝化菌的丝瓜络小柱排列并交联形成蜂巢状结