一种利用白腐菌漆酶降解酸性艳绿的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及染料降解技术领域，更具体地，涉及一种利用白腐菌漆酶降解酸性艳 绿的方法。
【背景技术】
[0002] 造纸行业中除了办公及印刷等所用的白色纸张外，大量带有颜色的纸张的需求量 也随着人们生活水平的提高和经济的飞速发展而不断的增加，这样就需要各种用于给纸张 染色的染料，造成了大量的染料废水。
[0003] 染料废水是含染料的有色废水，是难以处理的工业废水之一。随着染料工业和印 刷工业的迅猛发展，染料的种类和数量在不断的增加。在染料生产和使用的过程中，约有 10~20%的染料随废水排放到环境中去。生产染料的基本原料是苯系、萘系、蒽醌、苯胺及 联苯胺类化合物，并且在生产过程中长与金属、盐类等物质相螯合，因此染料废水中含有很 多具有生物毒性的有机物，即使废水中残余的染料浓度很低，排入水体中后也会造成水体 透光率降低、水体生态系统的破坏等问题。因此染料的降解成为了处理染料废水的首要问 题。
[0004] 漆酶广泛的底物范围使得它可以用于降解多种结构的染料。朱启忠等人研究了 白毒鹅膏菌漆酶的粗酶液与12种工业染料的反应，结果发现漆酶粗酶液能与直接大红、 直接黑等造纸用染料反应，且脱色率在70%左右；S.RodriguezCouto研究了Trametes hirsuta漆酶对直接黑等染料的降解效果，结果显示直接黑的脱色率达到70%，直接蓝则接 近80%，显示了漆酶对染料较好的降解效果。
[0005] 酸性艳绿GS是工业中常用的一种染料，由于其较难降解，从而成为了研究难题， 目前还没有看到关于真菌漆酶降解酸性艳绿GS的研究报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是克服现有技术中降解酸性艳绿的缺陷，提供一种利 用白腐菌漆酶降解酸性艳绿的方法。
[0007] 本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的： 一种利用白腐菌漆酶降解酸性艳绿的方法，是利用贝壳状革耳菌发 酵产生的粗酶液处理酸性艳绿。
[0008] 申请人通过研究表明利用贝壳状革耳菌尸<?_6·ctwcAgtof发酵产生的粗酶液中漆 酶能够高效降解酸性艳绿。
[0009] 优选地，是利用利用贝壳状革耳菌ctwcAsiiAs·发酵产生的粗酶液在25~ 35°C，pH为3~5下反应，所述粗酶液中漆酶的用量为0. 5~1U/mL，酸性艳绿的浓度为 60 ~80mg/L。
[0010] 通过SPSS优化发现利用利用贝壳状革耳菌ctwcAsiiAs·发酵产生的粗酶液 在28°C，pH为4下反应，所述粗酶液中漆酶的用量为0. 8U/mL，酸性艳绿的浓度为80mg/ L，在35min酸性艳绿的脱色率即可到达98%。
[0011] 优选地，上述反应体系中添加1-羟基苯并三唑；具体地，所述1-羟基苯并三唑的 添加量为0.005% (质量分数)。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明提供了利用白腐菌漆酶降解酸性艳绿的方法，是利用贝壳状革耳菌cmcAatos发酵产生的粗酶液处理酸性艳绿，通过SPSS软件设计贝壳状革耳菌漆酶对染料 酸性艳绿GS的脱色试验，确定5个因素，分别为反应体系pH(A)、反应温度（B)、漆酶用量 (C)、染料浓度（D)和介体用量（E)，每个因素选定3个水平进行正交设计。对试验所得数 据进行方差分析，结果显示：①各个因素对酸性艳绿GS脱色率的影响顺序为B>A>C>E>D，② 从正交设计中得到单因素统计表可知漆酶降解酸性艳绿GS的最佳脱色条件：28°C，pH为 4下反应，所述粗酶液中漆酶的用量为0.8U/mL，酸性艳绿的浓度为80mg/L，介体用量为 0. 005%。按照SPSS分析所得的酸性艳绿GS的最佳脱色条件进行反应，结果表明染料在反 应35min后脱色率达到98%，该方法具有广泛和实际的应用价值。
【具体实施方式】
[0013] 下面通过实施例对本发明进一步具体描述。本发明的设计思想或同类物质的简 单替代属于本发明的保护范围。下述所使用的实验方法若无特殊说明，均为本技术领域现 有常规的方法，所使用的配料或材料，如无特殊说明，均为通过商业途径可得到的配料或材 料。
[0014] 本发明所用到的贝壳状革耳菌ciWcAstof是专利号为201210270321. 4的 中国专利所公开的菌株，该菌株4°C下保存于PDA斜面培养基中。
[0015] 实施例1 菌种：贝壳状革耳菌下保存于PDA斜面培养基中。
[0016] 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液：准确称取固体柠檬酸和柠檬酸钠，加蒸馏水溶解后，分 别将其定容至1L。并混合得到不同pH的缓冲液。
[0017] 酸性艳绿GS母液：称取酸性艳绿GS0.lg，用蒸馏水溶解，并最终用容量瓶定容至 100mL。实验时根据需要对母液进行适当稀释。
[0018] 1-羟基苯并三唑（Η0ΒΤ)溶液：配制质量分数为1%的Η0ΒΤ溶液，称取HOBTlg，用 加热的蒸馏水溶解，冷却后定容至100mL。常温保存。
[0019] 粗酶液的制备：（1)种子的制备：取出冰箱中保存于PDA斜面上的成熟菌丝，用接 种针挑取菌丝体至捣碎器中，加入适量的蒸馏水将菌体破碎制成菌丝悬浮液，将菌丝悬浮 液以1 :3的比例接种于装有60ml液体培养基的300ml三角瓶中。28°C，160rpm摇床培养 3d。过滤，用无菌水洗净备用。（2)摇瓶诱导液体发酵：将种子以1:4的比例接种于含有 80ml发酵培养基（10g麦麸、10g玉米杆粉、2mmol/LCuS04)的300ml三角瓶中，160rpm， 30°C培养。培养过程中每2d取一瓶发酵液，经6层纱布过滤后，4°C下5000rpm冷冻离心 15min，收集上清液即为粗酶液，将培养一定天数具有最高漆酶活性的发酵液收集4000rpm 离心10min，取上清液4°C保存备用。
[0020] 一、酸性艳绿GS的脱色降解 染料脱色率的测定：10mL的反应体系中，含有不同浓度的染料溶液和酶液，其余用蒸 馏水补足。在常温下反应一定时间，用紫外可见光分光光度计进行分析，记录染料在特征波 长处的吸光值的变化，相同实验条件下，加入等量灭活酶液作为对照。
[0021] 贝壳状革耳菌漆酶降解酸性艳绿GS的体系包括：0.lmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓 冲溶液（pH4.0)7.92mL，100mg/L酸性艳绿GS2mL(终浓度20mg/L)，粗酶液70ul(漆酶 总酶活约为280U/mL)。反应时间根据实际确定，制作酸性艳绿GS标准曲线，工作曲线的线 性回归方程为y=〇. 019x+0. 121，R2=0. 9971。因此，在脱色降解实验中，可利用吸光度来计算 溶液中染料的浓度。
[0022] 在常温下，pH=3的条件下，添加粗酶液使体系中漆酶酶活为1.OU/mL，对染料浓 度为80mg/L的酸性艳绿GS进行脱色，其脱色率随反应时间的延长基本不变。添加浓度为 0. 01%的介体Η0ΒΤ，酸性艳绿GS在lh内脱色明显，因此将漆酶降解酸性艳绿GS的反应时 间定为lh。
[0023] 脱色体系在反应过程中每lmin取样，于200~800nm进行紫外-可见光谱扫描， 发现在500~700nm间没有其他特征峰出现，且只在酸性艳绿GS的吸光值在最大吸收峰 636nm处明显下降。酶解反应lh后吸收峰变化不大。
[0024] 实施例2贝壳状革耳菌漆酶降解酸性艳绿GS正交试验设计 本研究选用5个因素(反应体系pH、反应温度、漆酶用量、介体用量和染料浓度)，每个 因素分为3个水平。按照所选定的因素和水平利用SPSS软件设计出正交表。
[0025] 根据因素和水平要求，运行IBMSPSSStatistics程序，进入数据编辑窗口，点击 "数据一正交设计一生成"，打开"生成正交设计"对话框，在"因子名称"框中输入A，点击添 加；同样输入输入B、C、D、E、F，然后选中变量A，点击"定义值"，进入"生成设计：定义值"对 话框，在"值"一栏中前三行分别输入1、2、3,即表示因素A有3个水平，点击"继续"返回上 一级"生成正交设计"主对话框，以同样方式输入因素B、C、D、E、F的三个水平，选择"创建 数据集"，点击确定，系统生成正交试验设计表，共18组正交实验，按照每个实验条件进行漆 酶对酸性艳绿GS的降解，得到结果如表2。
[0026] 对得到的18组实验数据进行分析，各个因素对酸性艳绿GS脱色率的影响顺序 为B>A>C>E>D，且因素B对脱色率影响最为显著，漆酶降解酸性艳绿GS的最佳脱色条件是 反应体系pH=4. 0、反应温度为28°C、漆酶用量为0. 8U/mL、染料浓度为80mg/L、介体用量为 0.005%〇
[0027] 按照最佳脱色条件进行反应，可知染料在前lOmin内反应速率很高，且在lOmin后 反应达到平衡，反应35min后，染料脱色率为98%，由此可证明SPSS分析正交试验数据准确 可靠。
【主权项】
1. 一种利用白腐菌漆酶降解酸性艳绿的方法，其特征在于，是利用贝壳状革耳菌 CtWcAs 发酵产生的粗酶液处理酸性艳绿。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是利用利用贝壳状革耳菌ctwcAsiiAs·发酵产生的粗酶液在25~35°C，pH为3~5下反应，所述粗酶液中漆酶的用量 为0. 5~1U/mL，酸性艳绿的浓度为60~80mg/L。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，是利用利用贝壳状革耳菌 发酵产生的粗酶液在28°C，pH为4下反应，所述粗酶液中漆酶的用量为0. 8U/mL，酸性艳绿的浓度为80mg/L。4. 根据权利要求1至3任一种所述的方法，其特征在于，反应体系中添加1-羟基苯并 三唑。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述1-羟基苯并三唑的添加量为 0.005wt%〇
【专利摘要】本发明公开了一种利用白腐菌漆酶降解酸性艳绿的方法，是利用贝壳状革耳菌<i>Panus</i><i>？conchatus</i>发酵产生的粗酶液处理酸性艳绿，通过SPSS软件设计贝壳状革耳菌漆酶对染料酸性艳绿GS的脱色试验，按照SPSS分析所得的酸性艳绿GS的最佳脱色条件进行反应，结果表明染料在反应35min后脱色率达到98%，该方法具有广泛和实际的应用价值。
【IPC分类】C02F103/28, C02F3/34
【公开号】CN105417725
【申请号】CN201510931354
【发明人】李国深
【申请人】李国深
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2015年12月15日