一种利用产絮菌发酵液去除水中重金属离子的方法
【专利摘要】一种利用产絮菌发酵液去除水中重金属离子的方法属于水质净化及环境保护【技术领域】。按照以下步骤进行：(1)菌种活化：从斜面培养基挑取一环类芽孢杆菌(Paenibacillus?sp.)CGMCC?No.2040菌苔接种于液体培养基中活化；(2)发酵培养：将活化后的菌液按1％～2％体积比接种于优化培养基中继续培养36～96h，得到菌株发酵液；(3)取适当菌株发酵液加入到重金属溶液中，调节pH为3～7，在温度为20～30℃摇床反应10～90min，使水中重金属被充分吸收；后离心取上清液，等离子体发射光谱仪法测定溶液中的重金属离子浓度。本发明方法中去除水中重金属离子过程中操作简单，成本低廉，无污染，具有较好的推广应用价值，其对蓄电池生产废水中铅离子的去除率达到94％以上。
【专利说明】一种利用产絮菌发酵液去除水中重金属离子的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于水质净化及环境保护【技术领域】，特别涉及一种利用产絮菌发酵液去除水中重金属离子的方法。
【背景技术】
[0002]重金属废水是一种对生态环境危害极大的工业废水，主要来源于采矿、选矿、冶炼、电镀、化工、制革和造纸工业，这些工业产生的含汞、铬、镉、镍、铜、铅等重金属废水具有较大的毒性。含重金属的废水排放到水体中，在藻类和底泥中积累，被鱼和贝类经体表吸附与体内吸收，产生食物链浓缩，对人类健康和生态环境的危害越来越严重，因此有效地从工业废水中去除重金属已经成为环保领域十分迫切的任务。
[0003]目前应用于重金属离子污染水体的方法有化学处理、离子交换、吸附法、膜分离等等，但都存在一定的弊端。化学处理通过沉淀、氧化还原、絮凝作用等有效去除重金属，但投入化学药剂成本及运行成本较高，且造成二次污染；离子交换法操作繁琐，运行费用较高；吸附和膜分离法同样存在运行成本高等问题。因此需要探索一种高效且价格低廉的处理方法。
[0004]近几年来，微生物对金属的结合能力即利用微生物从水溶液中富集、脱除重金属离子的方法一生物吸附法，引起了研究人员的注意。该方法不仅可在有效脱除有毒金属的同时不引入其它有害物质，而且它在mg/L级的废水处理中具有独特优势，进而弥补了现有工艺的不足。生物处理是一种新兴的重金属污染处理技术，通过生物吸附剂的络合、螯合、离子交换、吸附、絮凝等生化作用将重金属离子吸附于生物细胞之中，以达到消除重金属污染的目的，因且其具有成本低、选择性强、处理效率高、无二次污染等优点，在重金属污染处理方面有着广泛研究和应用前景。
[0005]生物吸附的研究国内外多处于实验室研究阶段，采用人工模拟废水，探索各种微生物对不同重金属的吸附特性和规律，研究的主要注意力集中在细胞壁对金属离子的吸附过程上，并揭示了细胞内部对金属离子也有吸附作用。一般来说，金属的生物吸附是以许多金属结合机理为基础的。这些机理可以是单独起作用的，也可以与其他机理结合在一起起作用，这取决于过程的条件和环境。
[0006]目前国内 外报道的文献及所公开的专利中，利用微生物去除水中重金属离子的生物吸附法应用较多，涉及的微生物主要有细菌、酵母菌、藻类和霉菌等对重金属的吸附，但是对细菌及其代谢产物——胞外多糖去除废水中的重金属研究比较少。利用微生物絮凝剂(Microbial flocculant MBF)对废水中的重金属进行处理,是近年来研究的热点。Friedman 和 Dugan 于 1968 年报道了 Zoogleoall5 产生的絮凝剂对 Co2+、Cu2+、Fe3+ 和 Ni2+有去除作用。其后各国研究者陆续报道了各种微生物所产生的生物大分子对金属离子的处理作用，其研究结果均存在絮凝剂投加量较大，处理效率不理想等现象。如王竞等(2001年)利用胞外高聚物产生菌(Paenibacillus sp.)GX4-1的发酵液制成的絮凝剂WJ-1对水中Cr(VI)进行絮凝吸附去除研究，当pH = 1.5，絮凝剂投放量为40-50!^的条件下，对Cr(VI)浓度为200mg/L，此时去除率为51%。郭帅(2008年)利用絮凝剂产生菌动胶菌属(Zoogloea sp.)B2对重金属pb2+的处理研究表明:在最佳pH值6.0条件下,投加量为30mL时，最大去除效率为68.72%。姚敏杰等(2009年)研究胶质芽孢杆菌(Bacillusmucilaginosus)产生的微生物絮凝剂(MBF)对高浓度重金属离子模拟废水的絮凝作用。将IOmL MBF分别加入到IOOmL含Fe3+、Al3+、pb2+、Zn2+、Ca2+和Mg2+的模拟废水中，去处理率均小于80%。宋京津(2011年)等利用微生物絮凝剂产生菌113产生的絮凝剂MBF 113对含重金属Cd2+溶液去除的最佳pH值为7.0，投加量为20mL，处理20min时，可达到最大去除效率为68.2%。
【发明内容】
[0007]针对以上不足，本发明的目的在于提供一种简单、绿色、高效且廉价的去除水中重金属离子的方法，不仅可在常温条件下去除大部分重金属离子，去除效率高，均大于90%，而且培育操作过程简单，用量低，投加量仅为0.1% (v/v)，价格低廉，较易推广应用。
[0008]一种利用产絮菌发酵液去除水中重金属离子的方法，按照以下步骤进行:
[0009](I)菌株活化:从斜面培养基挑取一环类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCCN0.2040菌苔接种于液体培养基中，在25~35°C温度下以转速为120~160r/min的摇床振荡培养18~24h即可完成活化；
[0010](2)发酵培养:将活化后的菌液按1%~2%体积比接种于优化培养基中继续培养36~96h，得到菌株发酵液；
[0011](3)取适当菌株发酵液加入到浓度为I~120mg/L的重金属溶液中，使菌种发酵液与重金属溶液的体积比为(I~10)%: 1，调节pH为3~7，在温度为20~30°C摇床以转速为140~180r/min条件下反应10~90min，使水中重金属被充分吸收；后5000~10000r/min离心分离5~IOmin后取上清液,等离子体发射光谱仪法测定溶液中的重金属尚子浓度。
[0012]将步骤(2)制备的菌株发酵液制成絮凝剂制品，利用絮凝剂制品去除水中重金属离子的方法，按照以下步骤进行:
[0013](I)絮凝剂制品的制备:将步骤(2)制备的菌株发酵液稀释后3~10倍离心分离，经蒸发浓缩、加入75~95%的乙醇，乙醇的体积与发酵液的体积比为1: (2~5)，获得絮凝沉淀物，取沉淀物经离心分离和真空干燥制备成絮凝剂制品；
[0014](2)取适当絮凝剂制品加入到浓度为I~120mg/L的重金属溶液中，使絮凝剂制品的质量与重金属溶液的体积比为(I~10)%克/升，调节pH为3~7，在温度为20~30°C摇床以转速为140~180r/min条件下反应10~90min，使水中重金属被充分吸收；后5000~10000r/min离心分离5~IOmin后取上清液，等离子体发射光谱仪法测定溶液中的
重金属离子浓度。
[0015]所述斜面培养基成分为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，琼脂20g/L，pH =
7,分装入试管，121°C下高压灭菌30min，制成斜面。
[0016]所述液体培养基成分为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，pH7，121°C下高压灭菌30min。
[0017]所述优化培养基成分为:可溶性淀粉15g/L，酵母膏3g/L，K2HP046g/L,MgSO4.7Η200.2g/L, NaCl0.lg/L, pH8，在 121°C下高压灭菌 30min。
[0018]所述重金属溶液为含铜离子、锌离子、镍离子或铅离子的重金属离子的溶液，或者含重金属铅离子的蓄电池生产废水。
[0019]本发明方法中去除水中重金属离子过程中操作简单，成本低廉，无污染，具有较好的推广应用价值，其对蓄电池生产废水中铅离子的去除率达到94%以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040发酵液对不同浓度重金属铅离子的去除作用效果图。
[0021]图2类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040发酵液对不同浓度重金属铜离子的去除作用效果图。
[0022]图3类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040发酵液对不同浓度重金属锌离子的去除作用效果图。
[0023]图4类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC N0.2040发酵液对不同浓度重金属镍离子的去除作用效果图。
[0024]图5类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040发酵液处理含铅废水前的扫描电镜显微图片。
[0025]图6类芽抱杆菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040发酵液对含5mg/L铅离子废水处理后的扫描电镜显微图片
[0026]图7 类芽抱杆菌(Paenibacillus sp.) CGMCC N0.2040 发酵液对含 50mg/L 铅离子废水处理后的扫描电镜显微图片。
图8本发明【具体实施方式】中16S rRNA序列提交到GenBank数据库，进行序列比对及系统发育分析的结果，其中UserSeq即为本发明所述菌株。
【具体实施方式】
[0027]本发明产絮菌株经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号:CGMCC N0.2040，分类命名:类芽孢杆菌Paenibacillus sp.，保藏日期:2007年5月11日。
[0028]本发明实施例中产絮菌株制备的方法，在果树种植、栽培土壤或公园草坪土壤距地表约2-5cm处土样中分离得到的野生菌种经梯度稀释涂布平板法筛选、纯化所得，按照如下步骤进行:
[0029](I)称取果树种植、栽培土壤或公园草坪土壤距地表约2-5cm土壤样品l_10g放到灭菌的250mL三角烧瓶中，添加无菌水使最终体积为IOOmL,加塞后放入30°C，150r/min摇床中震荡培养24h ；
[0030](2)静置约20-40min，用移液枪吸取ImL上清液注入装有9mL无菌水的试管中充分混合均匀后，换枪头再从此试管中吸取ImL溶液注入另一支装有9mL无菌水的试管中，依次制得ICT1~10_5稀释梯度的土壤悬液；
[0031](3)在无菌操作台上，用移液枪分别移取10-1，10-3, 10-5的土壤悬液各0.1mL置入在3个PBA培养基上，再用无菌涂布棒涂布均匀；把制备好的PBA培养基贴上标签倒置在30°C的恒温培养箱中培养2~3d，选择表面光滑且带粘性的单菌落再通过多次在PBA培养基上进行划线分离后得到纯菌落。
[0032]所述PBA培养基成分为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，琼脂20g/L，pH7，121°C下高压灭菌30min。此培养基用来筛选、分离菌种。
[0033]絮凝活性测定方法为:①初筛:在试管中装入浓度为5g/L的高岭土悬浊液20mL (把I改为L,以下同)，加入2~3滴培养后的微生物发酵液,震荡、摇匀、静置5min,观察絮团生成情况，将有絮团生成的细菌作为微生物絮凝剂产生菌进行培养。将获得的具有絮凝效果的细菌菌株，采用平板划线法对所培养的细菌菌株进行分离和纯化，获得纯菌株，并进行絮凝活性测定；②复筛:在IOOmL量筒中加入0.5g高岭土，加IOOmL水摇匀后，制备成高岭土悬浮液，加入0.1mL初筛后的微生物发酵液，摇匀后静置5min，取50mL处上清液采用分光光度计测定其光密度OD55tl,以不加微生物发酵液的高岭土悬浮液作为对比，计算絮凝率；③确定高效产絮菌株:筛选絮凝活性最强菌株经培养的发酵液与高岭土悬浊液以
0.1% (v/v)比例混合絮凝，其絮凝率为95.47%;④将此菌株保存于斜面培养基，置于冰箱保存。
[0034]本发明菌株鉴定:
[0035]①16S rRNA基因的PCR扩增:将筛选出的菌株用上海生工公司的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取其基因组DNA。以基因组DNA为模板进行PCR扩增反应。扩增引物为:27F:5’ -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3M541R:5’ -AAG GAG GTG ATC CAC CC-3’。
[0036]16S rRNA 反应体系为 100 μ 1:Taq (5U/μ I) 0.8 μ I ; 10 X PCRBuffer (Mg2+Plus) 10 μ I ；dNTP Mixture (2.5mM/each) 8 μ I ；模板 DNA2.5ng ;引物27F(10ymol/L)2y 1，引物 1541R (10ymol/L)2y I ;ddH20 补足到 100 μ I。
[0037]PCR扩增条件:95 V预变性5min ；95 V变性lmin，57 °C退火lmin，72 V延伸lmin20s，运行共30循环；72°C最终延伸5min。
[0038]②琼脂糖凝胶电泳:
[0039]PCR扩增产物在I %琼脂糖凝胶上进行电泳。其条带在1500bp左右。PCR扩增产物经克隆测序，测得16S rNA序列为1426bp。其序列测定结果如下:
[0040]TTCGGCGGCTGGCTCCCTTGCGGGTTACCCCACCGACTTCGGGTGTTGCAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCMTTCCGACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGATCGGCTTTTTAGGATTCGCTCCACCTCGCGGCTTCGCTTCCCGTTGTACCGACCATTGTAGTACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTGCTTAGAGTGCCCACCATCATGTGCTGGCAACTAAGCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCTTGAATGTTCCGAAGAAAAGGTACATCTCTGCACCGGTCATTCAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATACTCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGTGTTAACTTCGGCACCAAGGGTATCGAAACCCCTAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTTACAGCCCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTCATCCAGTTTCCGATGCGACCCGAAGTTGAGCTTCGGGATTAAACACCAGACTTAAATGACCGCCTGCGCGCGCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGGGCTTTCTTCTCAGGTACCGTCA
【权利要求】
1.一种利用产絮菌发酵液去除水中重金属离子的方法，其特征在于按照以下步骤进行: (1)菌株活化:从斜面培养基挑取一环类芽孢杆菌Paenibacillussp.CGMCC N0.2040菌苔接种于液体培养基中，在25~35°C温度下以转速为120~160r/min的摇床振荡培养18~24h即可完成活化； (2)发酵培养:将活化后的菌液按1%~2%体积比接种于优化培养基中继续培养36~96h，得到菌株发酵液； (3)取适当菌株发酵液加入到浓度为1~120mg/L的重金属溶液中，使发酵液与重金属溶液的体积比为(1~10)%: 1，调节pH为3~7，在温度为20~30°C摇床以转速为140~180r/min条件下反应10~90min，使水中重金属被充分吸收；后5000~10000r/min离心分离5~1Omin后取上清液，等离子体发射光谱仪法测定溶液中的重金属离子浓度。
2.根据权利要求1所述的一种利用产絮菌发酵液去除水中重金属离子的方法，其特征在于所于将步骤(2)制备的菌株发酵液制成絮凝剂制品，利用絮凝剂制品去除水中重金属离子的方法，按照以下步骤进行: (1)絮凝剂制品的制备:将菌株发酵液稀释后3~10倍离心分离，经蒸发浓缩、加入75~95%的乙醇，乙醇的体积与发酵液的体积比为1: (2~5)，获得絮凝沉淀物，取沉淀物经离心分离和真空干燥制备成絮凝剂制品； (2)取适当絮凝剂制品加入到浓度为I~120mg/L的重金属溶液中，使絮凝剂制品的质量与重金属溶液的体积比为(I~10) %克/升，调节pH为3~7，在温度为20~30°C摇床以转速为140~180r/min条件下反应10~90min，使水中重金属被充分吸收；后5000~10000r/min离心分离5~IOmin后取上清液,等离子体发射光谱仪法测定溶液中的重金属尚子浓度。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用产絮菌发酵液去除水中重金属离子的方法，其特征在于所述斜面培养基成分为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，琼脂20g/L，pH =7,分装入试管，121°C下高压灭菌30min，制成斜面。
4.根据权利要求1或2所述的一种利用产絮菌发酵液去除水中重金属离子的方法，其特征在于所述液体培养基成分为:牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaC15g/L，pH7，12rC下高压灭菌30min。
5.根据权利要求1或2所述的一种利用产絮菌发酵液去除水中重金属离子的方法，其特征在于所述优化培养基成分为:可溶性淀粉15g/L，酵母膏3g/L，K2HP046g/L，MgSO4.7Η200.2g/L, NaCl0.lg/L, pH8，在 121°C下高压灭菌 30min。
6.根据权利要求1或2所述的一种利用产絮菌发酵液去除水中重金属离子的方法，其特征在于所述重金属溶液为含铅离子、铜离子、锌离子和镍离子的重金属离子的溶液，或者含重金属铅离子的蓄电池生产废水。
【文档编号】C02F101/20GK103833144SQ201410006084
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年1月6日 优先权日:2014年1月6日
【发明者】姜彬慧, 胡筱敏, 李亮, 付丽丽, 李凤达, 杨程程, 赵研, 邓述波 申请人:东北大学