专利名称：6-氨基青霉烷酸降解细菌及其筛选方法
技术领域：
本发明涉及降解6-氨基青霉烷酸的细菌及其筛选方法。
背景技术：
抗生素废水是一类含有难降解物质和生物毒性物质的高浓度有机废水。近年来由于制药工业的飞速发展，特别是抗生素的出现给中国甚至世界的水资源带来了严重的污染。对抗生素废水进行合理有效的治理已经迫在眉睫，这是关系到社会的发展以及人类未来的问题。抗生素废水的成分十分复杂，含有多种难降解的有机物和无机物，一般处理起来很困难，例如对于抗生素一般使用细菌对其降解，但其中所含的残留物质洁霉素对革兰氏阳性菌和厌氧菌具有很强的抗性，由于诸如此类的特性，废水处理起来十分困难。目前抗生素废水处理方法主要有化学处理法、物化处理法(包括包埋法、混凝-沉淀法、光降解法、反渗透和膜分离技术、吸附法、电解法)、生物处理法以及多种组合法。其中生物处理法有处理条件温和、费用低、微生物适应性强、易培养和可强化等优点，故已广泛应用于抗生素废水的处理。
在发酵及化学合成制药废水中，氨基青霉烷酸(6-APA)和阿莫西林是最常见的特征污染物。6 -APA作为制备具有重要商业价值的氨苄西林和阿莫西林的起始材料，可以通过青霉素V或青霉素G的酶水解来获得，同时产生苯氧乙酸副产品。阿莫西林是一种广谱β -内酰胺类抗生素，属于青霉素类有机物，用作兽药，治疗细菌感染的过程中遇到的肠道和全身感染。但化学法生产6-ΑΡΑ和阿莫西林造成严重的环境污染，需要使用诸如吡啶、五氯化二磷和亚硝酰氯等危险化学品。这些6-ΑΡΑ和阿莫西林制药废水主要来自设备的清洁、洗涤废水，锅炉吹下和地板清洗废水。由于制定了严格的制药工业废水污染物排放标准(从以前COD ( 300mgL-l减少到COD ( 120mgL_l)，所以，采取适当的技术处理含6-APA和阿莫西林制药废水已成为当务之急。生物处理法有处理条件温和、费用低、微生物适应性强、易培养和可强化等优点，故已广泛应用于抗生素废水的处理。而生物法最核心的也就是能够降解特征污染物的细菌。所以，获得高效降解6-APA的细菌是处理含6-APA废水的关键之一。但目前，国内外均没有相关的报道。
发明内容
因此，本发明的技术目的在于筛选能够高效降解6-APA的细菌。因此，本发明的第一方面涉及一株6-氨基青霉烧酸降解细菌Bordetella sp.L2,其于2012年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为 CGMCC N0.6691。优选地，所述6-氨基青霉烷酸降解细菌Bordetella sp.L2的16S rRNA基因序列GenBank 注册号为 HQ840720。本发明的第二方面涉及上述的6-氨基青霉烷酸降解细菌Bordetella sp.L2的筛选方法，其包括步骤:先将采取的来自抗生素工厂排污沟的样品放入到富集培养基中培养，然后再转入到分离培养基中进行选择培养，之后经多代平板稀释法进行分离、纯化，最终获得纯培养菌株，利用标准的菌种鉴定手段鉴定所述纯培养菌株，其中所述富集培养基的成分为:葡萄糖 20g、蛋白胨 4g、酵母粉 lg、牛肉膏 2g、NaC14g、K2HPO4L 5g、MgCl2.6H200.lg、FeSO4.7H200.lg、维生素液10ml、微量元素液10ml,最后定溶于IL ;所述分离培养基的成分为:葡萄糖 10g、6-APA5g、NaC14g、K2HPO4L 5g、MgCl2.6Η200.lg、FeSO4.7Η200.lg、维生素液10ml、微量元素液10ml，最后定溶于IL ;其中维生素液的成分为钴胺素0.0lg、抗坏血酸0.025g、核黄素0.025g、柠檬酸0.02g、吡多醛0.05g、叶酸0.0lg、对氨基苯甲酸0.0lg、肌酸 0.025g,微量元素液的成分为 MnSO4.7H200.0lg、ZnSO4.7Η200.05g、H3BO30.0lg、N(CH2COOH) 34.5g、CaCl2.2H200.0lg、Na2MoO40.0lg、CoCl2.6H200.2g、AlK (SO4) 20.0lg。本发明的第三方面涉及含有上述的6-氨基青霉烧酸降解细菌Bordetella sp.L2的组合物。优选地，所述组合物能降解青霉素类、头孢类抗生素生产废水中的6-APA。本发明的第四方面涉及上述的6-氨基青霉烧酸降解细菌Bordetella sp.L2在处理含6-APA头孢菌素的污染物中的用途。优选地，所述污染物为污水。本发明的第五方面涉及上述的组合物在处理含6-APA头孢菌素的污染物中的用途。优选地，所述污染物为污水。换言之，本发明利用常规的筛选方法从抗生素生产厂家的排污沟里筛选出一株6-氨基青霉烧酸降解细菌博代氏〔杆〕菌Bordetella sp.L2。本发明的博代氏〔杆〕菌Bordetella sp.L2已于2012年10月18日在位于北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCCN0.6691，其建议的分类命名为博德特氏菌Bordetella SP.。该菌株的16S rRNA基因序列GenBank注册号为HQ840720。菌株L2为需氧短杆菌，在pH值为8.0时，6-氨基青霉烷酸(6-APA)降解率约为28%。 该菌株降解6-APA能力较强，对含6-APA头孢菌素产生废水的处理具有现实意义和重要的工程应用价值。本领域技术人员公知，在本发明所获得的上述6-氨基青霉烷酸降解细菌新种的基础上，本领域技术人员可以对所述细菌进行适当的诱变而继续提高其水解6-氨基青霉烷酸的能力，这样的诱变后的基于本发明所述菌种的突变株也落入本发明保护的范围。所述诱变包括辐射、化学诱变等。同时，本领域技术人员也可能将本发明获得的上述菌株与其他导致污染的常见微生物的降解菌株共同使用，已达到同时消除多种污染抗生素的目的。
图1:菌株 Bordetella sp.L2 的 16S rDNA 序列。图2:菌株Bordetella sp.L2的系统发育树分析。图3:菌株Bordetella sp.L2与其他菌株的16s rRNA基因序列相似性分析。图4:菌株Bordetella sp.L2的透射电镜照片。图5:菌株Bordetella sp.L2菌落的高倍显微镜照片。图6:菌株Bordetella sp.L2在固体培养基上的菌落形态。
具体实施例方式下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。实施例实施例1降解6-APA的功能菌的分离材料与方法1、培养基①富集培养基:葡萄糖，20g;蛋白胨，4g ;酵母粉，Ig ;牛肉膏，2g ；NaCl,4g ；K2HPO4,1.5g ；MgCl2.6Η20，0.Ig ；Fe S04.7Η20，0.Ig ;维生素液 IOml (钴胺素，0.0lg ;抗坏血酸，0.025g ；核黄素，0.025g ;柠檬酸，0.02g ;吡多醛，0.05g ;叶酸，0.0lg ;对氨基苯甲酸，0.0lg ;肌酸，0.025g);微量元素液(MnSO4.7H20，0.0lg ；ZnSO4.7Η20，0.05g ;Η3Β03，0.0lg ;Ν(CH2COOH) 3，
4.5g ；CaCl2.2Η20，0.0lg ；Na2Mo04,0.0lg ；CoCl2.6Η20，0.2g ；Α1Κ(SO4)2,0.0lg) 10ml,最后定溶于1L。②分离培养基:葡萄糖IOg ；6-APA5g ;NaCl，4g ；K2HPO4,1.5g ；MgCl2.6Η20，0.Ig ；FeS04.7H20,0.1g ;维生素液IOml(钴胺素,0.0lg ;抗坏血酸,0.025g ;核黄素，0.025g ;梓檬酸，0.02g ;批多醛，0.05g ;叶酸，0.0lg ;对氨基苯甲酸，0.0lg ;肌酸，0.025g);微量元素液(MnSO4.7H20，0.0lg ；ZnSO4.7Η20，0.05g ；H3BO3,0.0lg ;N (CH2COOH) 3，4.5g ；CaCl2.2Η20，0.0lg ；Na2Mo04,0.0lg ；CoCl2.6Η20，0.2g ；A1K(SO4)2,0.0lg) 10ml，最后定溶于 IL02、样品采集和菌株分离样品采自哈尔滨制药总厂排污沟，取一定量水样及土样加入到富集培养基中于37°C摇床中培养2d，然后取5ml该培养液加入到IOOml分离培养基中继续培养2d，该培养液经稀释后涂布分离培养基固体平皿，在37°C的培养箱中培养2d，通过划线法进一步分离纯化，得到一株能够降解6-氨基青霉烷酸(6-APA)的细菌，命名为L2。实施例2菌株L2的菌种鉴定1、基因组DNA提取按照常规技术手段大量培养上述菌株L2，然后获取其基因组DNA。2、菌株L2的16S rDNA的鉴定方法2.116S rRNA基因序列的PCR扩增、测序及系统发育树的构建2.1.116S rRNA基因序列的PCR扩增扩增16S rRNA基因序列的两端引物选用通用引物:正向引物BSF8/20:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (SEQ ID NO:1)和反向引物 BSR1541/20:5' -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3' (SEQ ID NO:2)。PCR 反应体系为 50 μ L,反应条件为 94°C变性5min ;接下来进行35个循环反应:94°C变性45s，50°C退火45s，72°C延伸90s ;然后72°C再延伸lOmin，最后于4°C保存。2.1.2扩增产物的克隆及序列测定
PCR产物用TAKARA公司生产的pMD 18_T Vector克隆试剂盒进行克隆，先将16S rRNA基因片段纯化，连接到pMD 18-T Vector载体上，5 μ L连接反应液转化感受态细胞DH5a，并用菌落PCR进行鉴定。重组子的基因序列由上海生工生物工程技术服务有限公司测定。2.1.3系统发育树的构建运用NCBI的BLAST程序比对数据库中嗜盐菌属的16S rRNA基因序列和本研究中得到的16S rRNA基因序列。选择相似性高的序列用于系统发育分析。系统发育树用MEGA5.0软件构建。2.2菌株L2的16S rDNA的鉴定结果2.2.1菌株L2的16S rRNA基因序列扩增菌株L2的16S rRNA基因序列，得到了长度约1.5kb的扩增片段。扩增片段经胶回收、连接、克隆后测序，测得菌株L2的16S rDNA为1523bp (SEQ ID NO:3，同时请见图1 )，该序列已提交NCBI数据库，其收录号为HQ840720。AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGGATGCTTTACACATGCAAGTCGGACGGCAGCACGGACTTCGGTCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATGTATCGGAACGTGCCCAGTAGCGGGGGATAACTACGCGAAAGCGTGGCTAATACCGCATACGCCCTACGGGGGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCACTATTGGAGCGGCCGATATCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAGCTGGTTTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCCATCCCGCGTGTGCGATGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGGCAGGAAAGAAACGGCGCCAGCTAATACCTGGCGCTAATGACGGTACCTGCAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTCGGAAAGAAAGATGTGAAATCCCAGAGCTTAACTTTGGAACTGCATTTTTAACTACCGGGCTAGAGTGTGTCAGAGGGAGGTGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGCTGTTGGGGCCTTCGGGCCTTAGTAGCGCAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTCTGGAATCCCGAAG AGATTTGGGAGTGCTCGCAAGAGAACCGGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGGACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCCAATCTCAGAAACCCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGGGGGCGATTACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCGGAAGGTGCGGCTGGATCACCTCCTT (SEQ IDNO:3)。 2.2.2L2菌株系统发育树的构建和16S rRNA基因序列的相似性比较2.2.2.1L2菌株系统发育树的构建及分析将L2的序列输入到NCBI数据库中，运用Blast程序将这株细菌和数据库中的16SrRNA基因序列进行比对，从数据库中挑选与L2的16SrRNA基因序列具有较高相似性的菌株，再挑选同样起源于Alcaligenaceae科的6株菌作为外群，利用MEGA4.0软件构建系统发育树，如图2所示。从图中可以看出，L2与未培养的博德特氏菌(Bordetella)属的2个菌株分在一个分支上，且相近的菌株 Uncultured Bordetella sp.clone Floct.34 和 UnculturedBordetella sp.clone Floct.23 都是未培养的细菌，虽然，也与 Bordetella trematumstrain DSM11334分在一个分支上，可能与Bordetella trematum strain DSM11334 的亲缘关系较近，但不排除是新菌种的可能。2.2.2.2L2菌株16S rRNA基因序列的相似性比较为了比较各菌株间16S rRNA基因序列的相似性，通过DNAstar软件的SequenceDistances程序获得各菌株的16S rRNA基因序列相似性，见图3，表I。从图3 中可以得出，菌株 L2 与 Uncultured Bordetella sp.clone Floct.23、Uncultured Bordetella sp.clone Floct.34、Uncultured Bordetella sp.clone F2feb.7和 Bordetella trematum strain DSM11334 的序列同源性分别为 100%、99.9%、99.7% 和99.8%。菌株L2与许多未培养菌株相似性很高，它有可能是一个未被纯培养的新菌株。从表I 中可以得出，菌株 L2 与菌株 Bordetella sp.MT-EKBordetella trematumstrain DSM11334、Bordetella sp.MT-12、Bordetella hinzii LMG13501、UnculturedBordetella sp.clone2cll 和Uncultured Bordetella sp.clone Fl jan.8 的相似性都比较高，均可以达到99%以上，且都为Boixletella属的成员。这说明菌株L2为Boixletella属的一个种。表I菌株L216S rDNA序列NCBI同源性检索结果
权利要求
1.一株6-氨基青霉烧酸降解细菌Bordetella sp.L2,其于2012年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.6691。
2.根据权利要求1所述的6-氨基青霉烧酸降解细菌Bordetellasp.L2,其特征在于其16S rRNA基因序列GenBank注册号为HQ840720。
3.根据权利要求1或2所述的6-氨基青霉烧酸降解细菌Bordetellasp.L2的筛选方法，其包括步骤:先将采取的来自抗生素工厂排污沟的样品放入到富集培养基中培养，然后再转入到分离培养基中进行选择培养，之后经多代平板稀释法进行分离、纯化，最终获得纯培养菌株，利用标准的菌种鉴定手段鉴定所述纯培养菌株，其中所述富集培养基的成分为:葡萄糖 20g、蛋白胨 4g、酵母粉 lg、牛肉膏 2g、NaC14g、K2HPO4L 5g、MgCl2.6Η200.lg、FeS04-7H200.lg、维生素液10ml、微量元素液IOml,最后定溶于IL ;所述分离培养基的成分为:葡萄糖 10g、6-APA5g、NaC14g、K2HPO4L 5g、MgCl2.6Η200.lg、FeSO4.7Η200.lg、维生素液10ml、微量元素液10ml，最后定溶于IL ;其中维生素液的成分为钴胺素0.0lg、抗坏血酸0.025g、核黄素0.025g、柠檬酸0.02g、吡多醛0.05g、叶酸0.0lg、对氨基苯甲酸0.0lg、肌酸 0.025g,微量元素液的成分为 MnSO4.7H200.0lg、ZnSO4.7Η200.05g、H3BO30.0lg、N(CH2COOH) 34.5g、CaCl2.2H200.0lg、Na2MoO40.0lg、CoCl2.6H200.2g、AlK (SO4) 20.0lg。
4.一种含有权利要求1或2所述的6-氨基青霉烧酸降解细菌Bordetella sp.L2的组合物。
5.根据权利要求4所述的含有权利要求1或2所述的6-氨基青霉烷酸降解细菌Bordetella sp.L2的组合物，其特征在于其能降解青霉素类、头孢类抗生素生产废水中的6-APA成分。
6.根据权利要求1或2所述的6-氨基青霉烧酸降解细菌Bordetellasp.L2在处理含6-APA头孢菌素的污染物中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述污染物为污水。
8.根据权利要求4或5所述的组合物在处理含6-APA头孢菌素的污染物中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途 ，其特征在于所述污染物为污水。
全文摘要
本发明涉及6-氨基青霉烷酸降解细菌及其筛选方法。具体而言，本发明涉及一株6-氨基青霉烷酸降解细菌Bordetella sp.L2，其于2012年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.6691，其16S rRNA基因序列GenBank注册号为HQ840720。其为需氧短杆菌，在pH值为8.0时，其对6-氨基青霉烷酸(6-APA)的降解率约为28%。该菌株降解6-APA能力较强，对含6-APA头孢菌素产生废水的处理具有现实意义和重要的工程应用价值。
文档编号C02F101/38GK103184177SQ20121056849
公开日2013年7月3日 申请日期2012年12月24日 优先权日2012年11月21日
发明者林海龙, 陈先明, 关旸, 陈兆波, 王晓雨, 王锐, 范阳 申请人:中国长江三峡集团公司