专利名称：一种异养硝化好氧反硝化细菌及其培养和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及环境微生物领域，具体涉及一种高效脱氮的异养硝化好氧反硝化细菌，及其培养和应用。
背景技术：
传统的生物脱氮是将硝化反应与反硝化反应进行了有机地结合。其中硝化反应是指好氧条件下NH4+经N<V氧化为N<V的过程,该过程于1890年被Winogradsky首次发现。传统的硝化反应由2种微生物共同完成，即氨氧化细菌(AOB)(又称为亚硝化细菌)和亚硝酸氧化细菌(NOB)(又称为硝化细菌)。
氨氧化菌与亚硝酸氧化菌这两类细菌都是好氧菌，不需要有机碳源，属于化能自养菌，一般要求BOD浓度应在20mg/L以下。如果有机物浓度较高，异养型细菌会迅速增殖，使化能自养型的硝化细菌不能优势生长，硝化反应就无法进行。此外，自养的硝化细菌时代时间较长，约为31h左右。氨氧化细菌在氧化氨的过程中获得其生长所需的能量，是整个自养硝化作用的限速步骤。反硝化是把N03_或N02_转化为N2O或N2的还原过程，主要是由兼性厌氧的反硝化菌在缺氧环境条件下来完成的。这类微生物大都是厌氧菌，而且需要有机物作为能源。由于硝化和反硝化这两类微生物的营养需求和生存条件差异比较大，因此传统的硝化和反硝化只能在两个独立的、反应条件截然不同的反应器中进行，或者在同一个反应器中造成交替的好氧和缺氧环境。传统的生物脱氮工艺对有机物和氮的去除效果均比较好，但是却存在许多难以克服的技术难点首先氨氧化细菌和亚硝酸氧化细菌均为化能自养菌，由于时代时间较长，致使反应器启动缓慢，从而增加了污水处理成本；第二，由于硝化菌和反硝化菌的营养需求和生存条件不同，整个脱氮过程必须在好氧和缺氧两个独立的反应池中进行，这就增加了反应器的体积。或者同一个反应器中在时间上造成交替的好氧和缺氧环境，但是系统的控制也很繁琐；第三，反硝化菌为异养菌，所以反硝化过程需要较高的有机物浓度，污水中B0D:TN大于2. 86时反硝化正常，而低于这个值，反硝化就不能正常进行。而有机物在硝化过程发生之前就已经被好氧降解，所以运行中反硝化段往往又需要补加碳源。反硝化完成后，这部分有机物还有余量，为保证出水有机物达标，需再一次好氧降解，这就延长了脱氮工艺的处理流程。有些工艺利用硝化液回流来解决反硝化过程中的碳源不足问题，但硝化液回流量大、能耗闻；第四，硝化过程中硝化细菌会产酸，酸性条件对硝化反应有抑制作用，所以在硝化过程中需不断加碱，从而提高了处理成本；第五，抗冲击能力弱，高浓度氨氮和亚硝酸盐等会抑制硝化作用。近年来，人们对生物脱氮过程中出现的一些现象进行了大量理论和试验研究，提出了一些突破传统理论的新观点和新技术。这些理论从根本上打破了传统理论认为的硝化反应只能在好氧条件下由自养菌完成、反硝化只能在缺氧或厌氧条件下由异养菌完成的观点，其中就包括异养硝化和好氧反硝化。 异养硝化是指在好氧条件下异养微生物将还原态N (包括有机态N)氧化为N02_和NO3-的过程。也有学者把异养硝化定义为在好氧条件下异养微生物将氨/铵态氮或负三价态的有机态氮氧化为羟胺、亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的过程。异养硝化菌不仅种类繁多，而且他们可以利用的基质范围广泛，既可以是无机态氮也可以是有机态氮，如铵、胺、酰胺、肟、N-烷基羟胺、氧肟酸及芳香硝基化合物等。异养硝化菌甚至可以将有机氮直接氧化为硝酸盐氮，而跨过氨化作用和氨氧化作用两步。相对于自养硝化菌而言，虽然异养菌分解效率较低，但是他们生长速率快、细胞产量高，对溶解氧要求低，环境的适应能力也强，在环境中的数量往往远大于自养菌，因此在某些环境中异养硝化作用与自养硝化作用相当，甚至超过自养硝化。此外，目前发现的异养硝化菌大多同时具有好氧反硝化能力。
异养硝化微生物的发现解决了传统生物脱氮处理启动时间长、硝化环节条件要求苛刻、硝化和反硝化不能同步进行等缺点，具有较好的发展前景。
发明内容
本发明的目的是提供一株能够高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌。该细菌不仅可快速将氨氮去除，而且可在亚硝酸盐或硝酸盐为唯一氮源条件下生长，并将亚硝酸盐氮或硝酸盐中的氮有效去除；本发明的另一目的是提供一种从焦化废水活性污泥中筛选上述能够高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌的方法；本发明的另一目的是提供一种适用于上述能够高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌的培养条件，使得该菌能表现出更好的异养脱除氨氮的能力，更好的去除亚硝酸盐氮的能力以及更好的去除硝酸盐氮的能力；本发明的另一目的是提供上述能够高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌在水中脱氮的应用。为实现上述目的，本发明的技术方案如下一株能够高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌，属于不动杆菌属(Acinetobacter),其命名为 Acinetobacter sp. Yl ;保藏登记号为 CGMCC NO. 6563,保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号，保藏时间为2012年9月14日。上述细菌是从焦化废水的活性污泥中分离得到的，其分离方法如下步骤一、采集样品及富集培养从煤气化公司焦化废水处理厂的第一曝气池中采集活性污泥；取20mL活性污泥接种于装有180mL牛肉膏蛋白胨培养基的500mL三角瓶中，在120rpm、30°C下摇床富集培养I周；步骤二、分离纯化用生理盐水将经富集后的培养液按照体积比依次稀释为lO'lO'lO'lO'lO—5、10 5、10 7、10 8、10 9和10 10的菌悬液,取0.1mL稀释好的菌悬液涂布于异养氨化培养基的平板上，在30°C下恒温培养；随后挑选长出100个单菌落的平板，将各单菌落接种于异养氨化液体培养基中，在120rpm、3(TC条件下培养；培养期间每天用纳氏试剂、格里斯试剂及二苯胺检测NH4+-N剩余量、NO2--N及NO3--N的积累量进行硝化活性确认，同时作空白对照；对有效降解NH/-N的培养液再次进行梯度稀释、平板分离，最后纯化得到本发明的菌株Acinetobacter sp. Yl ;采用异养硝化培养基对该菌株进行菌种保藏；所述的牛肉膏蛋白胨培养基为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH 7. 0，蒸馏水10OOmT,；所述的异养氨化培养基为=NH4Cl O. 382g，结晶乙酸钠2g，MgSO4 · 7H20 O. 05g,K2HPO4O. 22g, NaCl 0. 12g, MnSO4 · 4 H20 0. Olg, FeSO4O. Olg, H2O IOOOmL, pH 7. 0 ；所述的异养硝化培养基为(NH4)2SO4O. 4 7g，柠檬酸钠4. 9g，MgSO4 · 7H20 0. 05g,K2HPO4O. 2g, NaCl 0. 12g, MnSO4 · 4H20 0. Olg, FeS040. Olg, H2O IOOOmL, pH 7. 0。在上述培养基制作平板或斜面等固体培养基时，在其液体培养基中添加1. 5-2%的琼脂。菌株鉴定(I)本发明菌株Acinetobacter sp. Yl的形态特征选用上述异养硝化培养基制作平板，用梯度稀释法对细菌的培养液进行稀释，涂布平板后恒温培养，观察其菌落特征在异养硝化培养基平板上Acinetobacter sp. Π形成乳白色的菌落，直径较大，约3_4mm,圆形，扁平，表面光滑。对Acinetobacter sp. Yl的菌体进行革兰氏染色，结果为阴性，菌体接近球形。(2) 16S rDNA 的 PCR 扩增和测序从新鲜异养硝化培养基平板中挑取菌体于50μ L TaKaRa Lysis BufferforMicroorganism to Direct PCR(Code No. D304)中变性后离心取上清液作为模板，反应条件为80°C，15min。使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (Code No. D310)进行PCR扩增目的片段。PCR反应体系(50 μ L)为上述I的变性反应液I μ L，PCR Premix25 μ L，Forward primer(20pmol/μ L0. 5 μ L,Reverse primer2(20pmol/μ L)0. 5 μ L,16S-free H2O23 μ L0反应条件如表I所示。取5 μ L 进行 3%琼脂糖凝胶电泳，使用 TaKaRa Agarose Gel DNA PurificationKitVer. 2. O (Code No. DV805A)和 MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction KitVer. 3. 0 (CodeNo. D823A)切胶回收目的片段，DNA测序委托宝生物工程(大连)有限公司完成。表I PCR扩增条件Tablel Conditions of PCR amplification
权利要求
1.一种能够高效脱氮的异养硝化-好氧反硝化细菌，属于不动杆菌属(Acinetobacter),其命名为 Acinetobacter sp. Yl ;保藏登记号为 CGMCC NO. 6563,保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2012年9月14日。
2.根据权利要求1的细菌的分离方法，其特征在于，其分离方法如下 步骤一、采集样品及富集培养 从煤气化公司焦化废水处理厂的第一曝气池中采集活性污泥；取20mL活性污泥接种于装有180mL牛肉膏蛋白胨培养基的500mL三角瓶中，在120rpm、30°C下摇床富集培养I周; 步骤二、分离纯化 用生理盐水将经富集后的培养液按照体积比依次稀释为io'io'io'io'io'io-6、10_7、10_8、10_9和10,的菌悬液,取0.1mL稀释好的菌悬液涂布于异养氨化培养基的平板上，在30°C下恒温培养；随后挑选长出100个单菌落的平板，将各单菌落接种于异养氨化液体培养基中，在120rpm、30°C条件下培养；培养期间每天用纳氏试剂、格里斯试剂及二苯胺检测NH4+-N剩余量、N02_-N及N03_-N的积累量进行硝化活性确认，同时作空白对照；对有效降解NH4+-N的培养液再次进行梯度稀释、平板分离，最后纯化得到本发明的菌株Acinetobacter sp. Yl ;采用异养硝化培养基对该菌株进行菌种保藏； 所述的牛肉膏蛋白胨培养基为牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g, pH 7. 0，蒸馏水IOOOmL, pH 7. 0 ； 所述的异养氨化培养基为NH4C1 0. 382g，结晶乙酸钠2g，MgSO4 7H20 0. 05g,K2HPO4O. 22g, NaCl 0. 12g, MnSO4 4H20 0. Olg, FeSO4O. Olg, H2O IOOOmL, pH 7. 0 ； 所述的异养硝化培养基为(NH4) 2S040. 47g，柠檬酸钠4. 9g，MgSO4 7H20 0. 05g,K2HPO4O. 22g, NaCl 0. 12g, MnSO4 4H20 0. Olg, FeS040. Olg, H2O IOOOmL, Ph7. 0 ； 在上述培养基制作平板或斜面等固体培养基时，在其液体培养基中添加1. 5-2%的琼脂即可。
3.—种根据权利要求1所述细菌的培养方法，其特征在于，将异养硝化培养基斜面上保存的Acinetobacter sp. Yl接种于异养硝化培养液中，80 150rpm、30 37°C条件下恒温振荡培养；所述的异养硝化培养液为碳源朽1檬酸钠2. 5 20. Og,氮源(NH4)2SO40.47 3. 8g,其余成分为 MgSO4 7H20 0. 05g, K2HPO4O. 2g, NaCl 0. 12g, MnSO4 4H20 0. Olg,FeS040. Olg, H2O IOOOmL, pH 6. 0 9. 0。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述的异养硝化培养液为(NH4)2SO4O. 47g，柠檬酸钠 4. 9g, MgSO4 7H20 0. 05g, K2HPO4O. 2g, NaCl 0. 12g, MnSO4 4H200.Olg, FeS040. Olg, H2O IOOOmL, pH 7.0。
5.根据权利要求3的培养方法，其特征在于，所述异养硝化培养液以以乙酸钠为碳源，以硫酸铵为氮源；所述异养硝化培养液为碳源乙酸钠3. 4 13. 6g，氮源(NH4)2SO4O. 47 3.8g，其余成分为 MgSO4 7H20 0. 05g, K2HPO4O. 2g, NaCl 0. 12g, MnSO4 4H20 0. Olg,FeS040. Olg, H2O IOOOmL, pH 6. 0 9. 0。
6.—种根据权利要求1所述细菌的培养方法,其特征在于,将Acinetobacter sp. Yl以柠檬酸钠为碳源，以亚硝酸钠为氮源进行好氧反硝化培养，所述培养基为柠檬酸钠。2. 5 9. 8g, NaNO2O. 25 1. 0g，其余成分为 MgSO4 7H20 0. 05g, K2HPO4O. 2g, NaClO. 12g,MnSO4 4H20 0. Olg, FeS040. Olg, H2O IOOOmL, pH 7. O 8. 0。
7.—种根据权利要求1所述细菌的培养方法,其特征在于,将Acinetobacter sp. Yl以柠檬酸钠为碳源，以亚硝酸钠为氮源进行好氧反硝化培养，所述培养基为柠檬酸钠2. 5 .9.8g, NaNO3O. 3 1. 3g，其余成分为 MgSO4 *7H20 0. 05g, K2HPO4O. 2g，NaC10. 12g,MnSO4 *4H20.0.Olg, FeS040. Olg, H2O IOOOmL, pH 7. 0 8. 0。
8.根据权利要求1的细菌处理含氮废水的用途。
全文摘要
本发明涉及一种高效脱氮的异养硝化好氧反硝化细菌，及其培养和应用。该细菌属于不动杆菌属(Acinetobacter)，其命名为Acinetobacter sp.Y1；保藏登记号为CGMCC NO.6563，保藏机构为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间为2012年9月14日。该细菌从焦化废水的活性污泥中分离得到，不仅可快速将氨氮去除，而且可在亚硝酸盐和硝酸盐为唯一氮源条件下生长，并将亚硝酸盐氮和硝酸盐氮有效去除，可以应用于处理含氮废水。
文档编号C02F3/34GK103013872SQ20121052546
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者刘玉香, 李风雷, 刘文静, 吕永康, 李亚青, 叶俊岭, 宋宇杰 申请人:太原理工大学