专利名称：微生物协同植物治理锰污染的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别涉及一种微生物协同植物治理锰污染的方法。
背景技术：
锰及其化合物应用于国民经济的各个领域。其中钢铁工业是最重要的领域，用锰量占90% 95%，主要作为炼铁和炼钢过程中的脱氧剂和脱硫剂，以及用来制造合金。其余5% 10%的锰用于其他工业领域，锰在国民经济中具有十分重要的战略地位。随着锰矿的开采，残留的固体废料，排放的污水等对水体，土壤环境的污染日夜严重。锰是变价元素，按地球化学分类，它是强烈的亲氧元素。土壤中的锰主要来自于氧化物和含氧酸盐，有机质的护胶作用和生物作用对锰的迁移、富集、沉淀起着重要作用。在矿物中，一般锰常和铁、镁共生，此外，锰也常和锌、铜、镍、钴、钙等一起沉淀。锰的主要矿物是软锰矿(MnO2·ηΗ20)，黑锰矿(Mn3O4)，水锰矿[MnO (OH)]和褐锰矿(Mn2O3) ，在这些矿物中随着结晶构型的不同，又有α、β、Γ之分，除此之外，还有很多含锰矿物。紫花苜蓿的土壤改良功能紫花苜蓿为多年生豆科草本植物，其根系深而多，生物量高，具有大量的分泌物；细根及根瘤菌更新很快，随着紫花苜蓿种植年限的延长，耕层土壤有机质、速效养分含量逐渐增加；此外，紫花苜蓿适应性强，这进一步确定了其在贫瘠、退化土壤改良中的重要地位。对土壤重金属污染的治理，目前常用的有客土法、淋滤法、吸附固定法等物理方法以及生物还原法、络合浸提法等化学方法。但这些方法往往工程量大、投资昂贵，对大面积的污染实施难度大。如对Ikm的污染土壤进行工程治理，每Im深度土体的耗费高达 800 2400万美元。生物修复技术可以削弱乃至消除环境污染物的毒性，降低污染物风险。同传统的物理化学方法相比，生物修复具有成本低，不产生二次污染，生态协调而易于被公众接受等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物协同植物治理土壤锰污染的方法，该方法利用微生物协同植物，稳定和去除环境中的锰污染，恢复受污染生态系统的正常功能，有利于大范围治理锰污染。本发明方法还具有价格低的优点。实现的技术方案是
微生物协同植物治理锰污染的方法，有以下步骤
1)取菌种R-118和R-2；
2)将挑取菌种R-118和R-2接种到液体LB培养基中，温度为，200-250r/min的转速，震荡培养1-2天，得到经培养后的菌种R-118和R-2 ；
3)将经培养后的菌种R-118和R-2分别用不同的发酵罐培养，罐内压力为0.05Mpa，发酵36小时，得到R-118和R-2菌种发酵液；
4)将吸附锰污染较强的植物移栽到含有Mn2+的无土营养液中，加入R-118或R-2菌种发酵液，移至光照充分的条件下，生长5-7天，检测锰离子含量变化。步骤4)所述的含有Mn2+的无土营养液的配置方法为取NH4NO3 0. 3g，KH2PO4 0. 19g，KNO3 0. 08g溶解混勻后吸取10ml，加水至1L，再加入1. 512g MnSO4混勻。步骤4)中含有Mn2+的无土营养液与菌种发酵液的体积比为75:1。本发明所述的吸附锰污染较强的植物为豆科、十字花科植物，如紫花苜蓿、油菜寸。所述菌种R-118和R-2的制备方法是1)取锰矿石表面物质，加去离子水搅拌，制成原菌悬液，将原菌悬液均勻涂布在固态PYCM培养基平板上；2)在25 恒温下培养 1 2天，挑取单菌落划线纯化，在固态PYCM培养基中25 培养，所得锰氧化微生物待选菌株，在液体PYCM培养基，摇床转速为200r/min，温度为^°C，培养2_4天，测定培养液中锰离子的含量变化，筛选出锰氧化微生物，得到R-118和R-2锰氧化微生物菌种。由于锰污染土壤的植物修复是利用锰超量积累植物或超积累植物的超量吸收积累锰的吸收作用来降低或清除土壤锰污染物。植物对锰金属污染位点的修复有三种方式 植物固定、植物挥发和植物吸收，通过这三种方式去除环境中锰离子。微生物对锰污染的修复主要是对土壤中的锰进行固定、转移或转化，改变锰在土壤中的环境化学行为，可促进有毒、有害物质解毒或降低毒性，从而达到生物修复的目的。因此，本发明利用了微生物修复技术和植物修复技术协同作用的原理，
申请人的实验结果表明，本发明所述方法，植物(紫花苜蓿)能够耐受锰含量较高的土壤，不但能够正常生长，而且能促进生长。微生物协调植物吸附锰的能力 ③紫花苜蓿和菌R-118>④紫花苜蓿和菌R_2>⑤紫花苜蓿 > ①菌R-118>②菌R-2。是基于微生物协同植物治理锰污染的新方法，
通过测定营养液中锰离子含量表明，本实验所述微生物协同植物治理土壤锰污染的效果明显，适用于大范围推广使用。
图1为锰的标准曲线；
图2为含有Mn2+的无土营养液中Mn2+随时间的变化曲线。
具体实施例方式本发明所用试剂均采用市售的化学纯产品。一.建立标准曲线
①甲醛肟试剂8. 0克盐酸羟胺溶于50. OmL水中，再加入4. OmL甲醛(37%)，定容于 IOOmL容量瓶。②EDTA溶液(0. 015mol/L)称取5. 6g乙二胺四乙酸二钠，定容于IOOOmL容量瓶中。①盐酸羟胺溶液(5%)准确称取5. Og盐酸羟胺，定容于IOOmL容量瓶中。用硫酸锰做标准液(Mn2+)。准确称取0. 7684g MnSO4 ·Η20，用去离子水溶解后转移至250mL容量瓶中定容摇勻备用。甲醛肟法测量锰含量的试剂用量及加入顺序为先取待测溶液2. OOmL于50mL的容量瓶中，加水约10 mL,再依次加入0. 50mL氨水(1:1)溶液、 0. 60mL 甲醛肟、0. 20mL 盐酸羟胺(5% )、l.OOmL EDTA (0. 015mol/L)，定容、摇勻，显色 IOmin,于375nm测定吸光度。将标准液分别稀释1，4，8，10，20倍，即锰含量分别为lg/L 0. 5g/L
0.25g/L 0. 125g/L 0. lg/L 0. 05g/L.然后分别取2ml于50ml容量瓶中，用甲醛肟法测吸光度，以空白为参比。结果表明，锰含量在0. lg/L-lg/L范围内有良好的线性关系。回归方程 y=0. 823x+0. 1123 R2=0. 9996.标准曲线如图 1 所示。二 .菌种发酵液的制备
1.菌种R-118和R-2的制备
1)取锰矿石表面物质，加去离子水搅拌，制成原菌悬液，将原菌悬液均勻涂布在固态 PYCM培养基平板上；
2)在25 恒温下培养1 2天，挑取单菌落划线纯化，在固态PYCM培养基中25 培养，所得锰氧化微生物待选菌株，在液体PYCM培养基，摇床转速为200r/min，温度为
^°C，培养2-4天，测定培养液中锰离子的含量变化，筛选出得到两种锰氧化微生物，命名为R-118和R-2菌种。2. LB培养基成分蛋白胨Ig ；酵母膏0. 5g ；NaCl Ig ；琼脂1. Sg ；蒸馏水IOOml ； PH调至7.0;
3.将菌种R-118和R-2从斜面挑取少量菌种接种到液体培养基中，以备发酵使用。然后，将烧瓶固定在摇床上，进行微生物震荡培养。固定在摇床上的烧瓶以200-250r/min的转速运动，温度保持在培养1-2天。4.菌种发酵罐培养
将两种菌种分别加入不同的发酵罐培养，罐内压力保持在0. 05Mpa。发酵36小时后，将菌种发酵液装入桶内用作野外实验。三.植物的种植 1)紫花苜蓿的种植
将取土壤(取自重庆理工大学校园内)，去除杂质，分成2份，每份重量为lOOOg，装入2 个瓷盘中。把紫花苜蓿种子均勻的洒在上述土壤中，表面再覆盖一层土壤，浇适量的水。将光照培养箱的温度控制在20°C，每天浇水观察植物生长状态，并记录。植物生长的过程中，应及时补水分和养料。2 )含有Mn2+的无土营养液制备
用分析天平准确称取NH4NO3 0. 3g, KH2PO4 0. 19g，KN03 0 . 08g溶于IOOml容量瓶中混勻后，吸取IOml加入IL烧杯中，加水至1L，得到无土栽培营养液。再准确称取1. 512g MnSO4 溶于无土栽培营养液中，得到含有Mn2+的无土营养液。所得含有Mn2+的无土营养液，平均分装到6个纸杯中。3)种植
为模拟锰污染环境并且容易检测，本实施例采用无土栽培紫花苜蓿。
步骤1)所述植物生长至有较强的根系后进行移栽，移栽时先浇适量的水，使土壤润湿利于植物取出而不损伤根系。取出植物后，用水将根系上的泥土洗净，将植物固定在泡沫上，5株植物为一个实验单元，移栽进盛装有含有Mn2+的无土营养液的纸杯中。放在光照充足的条件下生长。注意每个杯子中植株差距不能过大。四.紫花苜蓿和微生物吸附锰检测
1.首先将配好的含有Mn2+的无土栽培营养液吸取anl，用甲醛肟法测得初始OD=O. 456。 用标准曲线计算Mn2+含量为，0. 4179g/L.然后将无土栽培液摇勻，分装到6个纸杯中，每个纸杯150ml含有Mn2+的无土栽培营养液。最后进行紫花苜蓿和细菌吸附试验。方法如下
①号纸杯为含有Mn2+的无土栽培营养液(做空白对照)；
②号纸杯为含有Mn2+的无土栽培营养液中加入2ml的R-118菌种发酵液(下简称为菌 R-118)；
③号纸杯为含有Mn2+的无土栽培营养液中加入aiilR-2菌种发酵液(下简称为菌R-2);
④号纸杯为紫花苜蓿移栽在加入anlR-118菌种发酵液的含有Mn2+的无土栽培营养液中(下简称为紫花苜蓿和菌R-118)；
⑤号纸杯为紫花苜蓿移栽在加入anlR-2菌种发酵液的含有Mn2+的无土栽培营养液中 (下简称为紫花苜蓿和菌R-2);
⑥号纸杯移花苜蓿栽紫在含有Mn2+的无土栽培营养液中(下简称为紫花苜蓿)。2.将每个纸杯移至光照充分的条件下让其生长，每过一天用取2ml营养液用甲醛肟法测其OD值，待所需各组数据稳定后停止。注意，吸取营养液时，先将营养液摇勻。3.实验结果
从图2中可以得出紫花苜蓿和微生物吸附锰能力
(1)空白对照中Mn2+含量逐渐增加，导致的原因是由于在开放的环境中，水分的蒸发导致营养液中锰离子的浓度增加。(2)由每条曲线最低点得出，吸附锰的能力③紫花苜蓿和菌R_118>④紫花苜蓿和菌R-2>④紫花苜蓿 > ③菌R-118>②菌R-2.
(3)菌R-118和R-2达到最低后锰离子浓度急剧增加说明随着时间的推移，适合菌种生长的条件变化，菌种逐渐死亡。Mn2+重新释放到营养液中浓度又逐渐变高。(4)菌种R-2较菌R-118最先开始出现死亡，说明营养液中的成分更适合菌R-118 生长。(5)紫花苜蓿协同微生物菌种吸附锰的含量最多，但不等于单独两者相加的量。(6)紫花苜蓿不仅具有较好的吸附锰能力，并且不会随时间的变化将Mn2+重新释放到环境中。结论通过上面的两个实验结果可以看出，紫花苜蓿能够耐受锰含量较高的土壤，不但能够正常生长，而且能促进生长；吸附锰的能力紫花苜蓿协同菌种吸附锰的含量最多，其中，⑤紫花苜蓿和菌R_118>④紫花苜蓿和菌R_2>②紫花苜蓿 > ③菌R_118>②菌 R-2。
权利要求
1.一种微生物协同植物治理锰污染的方法，其特征在于有以下步骤1)取菌种R-118和R-2；2)将挑取菌种R-118和R-2接种到液体LB培养基中，温度为，200-250r/min的转速，震荡培养1-2天，得到经培养后的菌种R-118和R-2 ；3)将经培养后的菌种R-118和R-2分别用不同的发酵罐培养，罐内压力为0.05Mpa，发酵36小时，得到R-118和R-2菌种发酵液；4)将吸附锰较强的植物移栽到含有Mn2+的无土营养液中，加入R-118或R-2菌种发酵液，移至光照充分的条件下，生长5-7天，检测锰离子含量变化，锰离子浓度降低。
2.根据专利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)所述的含有Mn2+的无土营养液的配置方法为-M NH4NO3 0. 3g，KH2PO4 0. 19g，KNO3 0. 08g溶解混勻后吸取10ml，加水至1L， 再加入1. 512g MnSO4混勻。
3.根据专利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中含有Mn2+的无土营养液与菌种发酵液的体积比为75:1。
4.根据专利要求1所述的方法，其特征在于，所述吸附锰污染较强的植物为豆科植物。
5.根据专利要求1所述的方法，其特征在于，所述菌种R-118和R-2的制备方法是1) 取锰矿石表面物质，加去离子水搅拌，制成原菌悬液，将原菌悬液均勻涂布在固态PYCM培养基平板上；2)在25 恒温下培养1 2天，挑取单菌落划线纯化，在固态PYCM培养基中25 培养，所得锰氧化微生物待选菌株，在液体PYCM培养基，摇床转速为200r/ min，温度为^°C，培养2-4天，测定培养液中锰离子的含量变化，筛选出锰氧化微生物，得到R-118和R-2锰氧化微生物菌种。
全文摘要
本发明公开了一种微生物协同植物治理锰污染的方法有以下步骤1)取菌种R-118和R-2；2)将菌种接种到液体LB培养基中，温度为28℃，200-250r/min的转速，震荡培养1-2天；3)将经培养后的菌种R-118和R-2用不同的发酵罐培养，罐内压力为0.05Mpa，发酵36小时，得到两种菌种发酵液；4)将吸附锰较强的植物移栽到含有Mn2+的无土营养液中，加入两种发酵液，移至光照充分的条件下，生长5-7天，检测锰离子含量变化，锰离子浓度降低。该方法利用微生物协同植物，稳定和去除环境中的锰污染，恢复受污染生态系统的正常功能，有利于大范围治理锰污染。本发明方法还具有价格低的优点。
文档编号B09C1/00GK102489499SQ20111041747
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者王万能 申请人:重庆理工大学