专利名称：降解乐果、氯苯胺灵和敌稗的酰胺酶基因dimtH及其编码的蛋白质及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及降解乐果、氯苯胺灵和敌稗的酰胺酶基因dimtH及其编码的蛋白质及其应用。
背景技术：
我国人多地少，大量使用化学农药是保证作物高产稳产的必要措施，但同时也带来严重污染。据中科院土壤所检测数据表明，由于主施农药的难降解性，导致土壤和农作物残留率较高，如目前在长三角和珠三角农田土壤检出率达90%以上，受农药污染的农产品更是如此，如国际绿色和平组织2009年检测结果表明，我国90%农产品检出农药残留， 66%的样品残留至少5种以上农药，2010年4月份发生的青岛毒韭菜事件就是有机磷杀虫剂污染导致的，造成了恶劣影响。此外我国每年除草剂药害面积达3000万亩，其中严重药害面积达到500万亩，每年造成几十亿元的损失。微生物修复技术是一种新型原位生物修复技术，具有效果好，费用低，无二次污染，适合大面积面源污染修复等优点，是土壤有机污染物修复技术的主流和发展方向。杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗等是含酰胺键的农药，在我国使用广泛，目前能降解杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗这几种农药的降解性微生物菌株已经有报道， 但能降解这几种农药的降解基因还未见报道。获得杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗等含酰胺键农药的降解基因在治理农药残留，消除其药害技术研发中具有以下作用和功能， (一)通过现代生物技术将降解基因导入作物构建相应的除草剂抗性转基因作物，(二)通过现代微生物发酵技术将降解菌株和基因制成降解菌剂或酶制剂将土壤中农药残留降解。 此外降解基因还可用于有用化工产品及药物合成的生物转化。因此降解基因在消除该类除草剂药害及生物转化领域中具有非常重要的理论和应用价值。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供降解乐果、氯苯胺灵和敌稗的酰胺酶基因dimtH及其编码的蛋白质及其应用。该酰胺酶基因可用于构建降解杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗的转基因作物，土壤、水体中杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗残留的去除。本发明的目的可通过如下技术方案实现副球菌Dimd-2 (Paracoccus sp.)，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 2011234，保藏日期为2011年7月4日。一种酰胺酶基因dimtH，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。本发明酰胺酶基因dimtH克隆自筛选得到的一株能够降解乐果、氯苯胺灵和敌稗的副球菌Dimd-2 (Paracoccus sp.)。菌株Dimd_2保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2011234，保藏日期为2011年7月4日，质谱分析结果表明菌株Dimd-2的粗酶液可以把杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗的酰胺键断裂而降解这些靶标农药。克隆降解乐果、氯苯胺灵和敌稗的酰胺酶基因的采取的策略为鸟枪法(见图1)， 采用一种含酰胺键化合物对乙酰氨基酚作为目标酰胺酶的筛选标记，对乙酰氨基酚(无色)在酰胺酶催化下其酰胺键断裂生成褐色的对氨基苯酚。首先提取菌株Dimd-2(CCTCC M 2011234)的总DNA，总DNA采用Sau3AI部分酶切后和BamHI用酶切的质粒pUC118酶连，酶连产物转化大肠杆菌感受态细胞构建菌株Dimd-2的总DNA文库，把构建好的文库转化到大肠杆菌DH5ci中，含有能降解乐果、氯苯胺灵和敌稗的酰胺酶基因的克隆子菌落能在含有乙酰氨基酚的LB平板上产生褐色色素。利用这种克隆方法可以对文库进行高通量的筛选。用上面的策略筛选鸟枪法构建的基因文库获得一个能在加入IOOppm乙酰氨基酚的LB平板上产生褐色色素的克隆子，进一步的降解实验表明该阳性克隆子能降解乐果、氯苯胺灵和敌稗。测序结果表明该阳性克隆子含有2，5^bp，其中包含有12个潜在的ORF(大于150bp)，对这些潜在的ORF分别进行亚克隆和序列比对分析，最后确定编码目标酰胺酶的基因的大小为13%bp，命名为dimtH。这是首次克隆到能降解乐果、氯苯胺灵和敌稗的酰胺酶基因。所述的酰胺酶基因dimtH所编码的酰胺酶DimtH，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。含有所述的酰胺酶基因dimtH的重组表达载体。优选将权利要求1所述的酰胺酶基因dimtH插入pET49a(+)的NdeI和EcoRI位点之间所得。含有所述的酰胺酶基因dimtH的基因工程菌。所述的基因工程菌的出发菌株为大肠杆菌BL21 (DE3)。所述酰胺酶基因dimtH在构建降解杀虫剂乐果、除草剂氯苯胺灵或敌稗的转基因作物中的应用。所述酰胺酶基因dimtH在去除水体中杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗残留中的应用。所述酰胺酶DimtH在降解杀虫剂乐果、除草剂氯苯胺灵或敌稗中的应用。所述酰胺酶DimtH在去除水体中杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗残留中的应用。有益效果1.本发明用鸟枪法成功的从菌株Dimd-2 (CCTCC M 2011234)中克隆出酰胺酶基因dimtH。在GenBank比对结果表明该基因为一个新的基因，全长(从起始密码子到终止密码子)为13%bp，编码465个氨基酸。2.本发明酰胺酶基因dimtH能在内完全降解100mg/L的乐果、氯苯胺灵和敌稗。dimtH可用于构建抗除草剂氯苯胺灵和敌稗的转基因作物，也可用于土壤、水体中杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵和敌稗的去除及药物合成的生物转化，具有非常重要的理论和应用价值。
图1酰胺酶基因dimtH克隆的策略图。图2酰胺酶基因dimtH在BL21(pET_29a(+))中表达策略图。
图3酰胺酶基因dimtH蛋白电泳图谱；A 蛋白 marker ；B 纯化的 DimtH 蛋白；C =IPTG 诱导的 BL21 (DimtH)粗酶液；D 未诱导的BL21。图4DimtH催化的乐果降解产物GC/MS图谱；A 乐果的酶降解反应液二氯甲烷提取物的GC图谱；B 保留时间为7. 51min的物质一级质谱图；C 保留时间为6. 96min的物质一级质谱图。图5DimtH催化的敌稗降解产物GC/MS图谱；A 敌稗的酶降解反应液二氯甲烷提取物的GC图谱；B 保留时间为8. 88min的物质一级质谱图；C 保留时间为6. 37min的物质一级质谱图。 图6DimtH催化的氯苯胺灵降解产物GC/MS图谱；A 氯苯胺灵的酶降解反应液二氯甲烷提取物的GC图谱；B 保留时间为5. 99min的物质一级质谱图；C 保留时间为4. 03min的物质一级质谱图。图7胺酶DimtH降解乐果的生化反应途径。图8胺酶DimtH降解敌稗的生化反应途径。图9胺酶DimtH降解氯苯胺灵的生化反应途径。生物材料保藏信息副球菌Dimd-2 (Paracoccus sp.)，保存在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地点中国武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2011234，保藏日期为2011年7月4日。
具体实施例方式实施例1(1)酰胺类农药降解菌Dimd-2 (CCTCC M 2011234)的分离用来富集酰胺类农药降解菌株的富集基质取自扬州农药厂农药废水生化处理池的活性污泥，取活性污泥5. Og加入IOOml基础盐培养基中，加入50mg -Γ1的氟铃脲，30°C， 180r .min-1培养7d天，以5%的接种量转接到相同的培养基中，连续转接3次，梯度稀释富集液，取10_4 10_7稀释度的富集液各0. ImL涂布于加有IOOmg · Γ1氟铃脲的固体培养基平板上，30°C培养4d后，挑取长出的单菌落接种于含IOOmg化―1各种酰胺类农药(氟铃脲、 乐果、敌稗和氯苯胺灵)的培养基中，SOtMSOi^mirT1摇床培养5d，验证其降解效果。基础盐培养基配方为5. 0 葡萄糖，1. ONH4NO3,1. ONaCl，1. 5K2HP04,0. 5KH2P04，0. 2MgS04 · 7H20. pH 7. 0.固体培养基加15. Og琼脂。降解效果的验证方法在培养液中加入等体积的二氯甲烷进行全量提取，剧烈振荡后静置分层，然后取Iml下层二氯甲烷挥发完全后，加入ImL甲醇溶解(色谱纯)， 用滤膜(孔径0.22μπι)过滤。采用高效液相色谱测定提取液中氟铃脲含量，液相色谱条件流动相为甲醇水(80 20，V/V), Zorbax C218 ODS Spherex 反相柱(5 μ m， 4. 6mmX 250mm, Agilent, USA)，柱温为室温，紫外检测器，测定波长230nm，进样量20 μ L，流速为0. SmI^min-I。外标法按峰面积定量。采用气相色谱检测提取液中乐果、敌稗和氯苯胺灵的含量，检测方法柱型BD-5MS石英毛细管柱(15mX0.25mmX0.25ym)；样品进样量2μ L ；分流比30 ；载气氦气；载气流速lml/min ；进样口温度为230°C，柱温为200°C。
从富集液中，分离到1株酰胺类农药降解菌，命名为Dimd-2，该菌在7d内对 IOOmg · L-I的氟铃脲、乐果、敌稗和氯苯胺灵的降解率均达到80%以上。(2)酰胺类农药降解菌Dimd-2的鉴定及生物学特性菌株形态及生理生化特性测定参照文献常见细菌系统鉴定手册(东秀珠主编，北京，科学出版社，2001)进行。菌株Dimd-2属革兰氏阴性菌，菌落黄色，边缘整齐，菌落圆形并突起，湿润光滑， 不透明，易挑取；菌体球状，没有观察到鞭毛。氧化酶、氧化酶和硝酸盐还原阳性，不能水解淀粉，不产硫化氢，明胶液化、VP、甲基红和脲酶阴性。能利用L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-甘露糖和D-果糖产酸，能同化D-葡萄糖、D-甘露糖和D-山梨醇等碳源，但不能同化D-木糖。16S rRNA基因序列系统发育分析菌株总DNA的提取采用高盐法，并以总DNA作为模板，进行16S rRNA基因序列的扩增。用于扩增反应的引物为一对通用引物，上游引物 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，(SEQ ID No. 5)，下游引物5，-TACCTTGTTACGACTT_3，(SEQ ID No. 6)。25 μ L PCR 反应体系为模板 1 μ L，dNTP Q5mmol/L) 2 μ L，引物(lmmol/L)各 1 μ L， 10 X Taq 缓冲液 2. 5 μ L，Mg2+ (25mmol/L) 1. 5 μ L，Taq 酶(5U/ μ L) 0. 3 μ L，超纯水 15. 7 μ L。 聚合酶链式反应条件95°C预变性5min ；94°C变性0. 5min，52°C退火lmin，72°C延伸lmin， 循环30次；72°C延伸lOmin。采用PCR回收试剂盒(AXYGEN公司)回收16S rDNA的基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小(1. 5kb左右)，TA克隆后进行测序(由BI0AISA 公司完成)。测序结果通过在线分析，与RDP数据库(https://rdp.cme.msu.edu/)中的模式菌株16S rRNA基因序列进行相似性比较。结果显示菌株Dimd-2与副球菌属同源性最高，与Paracoccus aminovoransJCM 7685 (T)的同源性达到99. 2 %，与副球菌属模式种 Paracoccus denitrificans DSM 413 (T)的同源性达到97. 8%。结合生理生化特征将该菌鉴定为副球菌属(Paracoccus sp.)。将该菌株送交位于中国武汉，武汉大学的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC M 2011234，保藏日期为2011年7月 4曰。实施例2酰胺酶基因dimtH的克隆(1)细菌基因组总DNA的提取菌株Dimd-2 (CCTCC M 2011234)在LB培养基中大量培养后，采用CTAB法提取高纯度、大片段的Dimd-2的基因组总DNA，溶于TE缓冲液(pH8. 0)中，置于_20°C保藏，具体方法参考F ·奥斯伯等编的《精编分子生物学实验指南》。(2) pUCl 18 (BamHI)购买于宝生物工程(大连)有限公司。(3)总 DNA 的酶切 Paracoccus sp. Dimd-2 总 DNA 采用 Sau3AI 部分酶切。(4)DNA 的回收酶切后的总DNA通过电泳(TAE缓冲液)进行纯化，采用axygen biosciences (China)回收试剂盒进行回收，回收的 DNA溶于 10mmol/L 的 iTris 'HCl (pH8. 0) 中，置于-20°C保藏。(5)酶连建立如下反应体系ρυ0118(5α ΗΙ)0.1昭总DNA片段0.1 μ§IOx连接酶缓冲液Ιμ Τ4 DNA连接酶0. 5 μ 加双蒸水至10 μ 16°C温育 12 小时。(6)转化及筛选采用一种含酰胺键化合物对乙酰氨基酚作为目标酰胺酶的筛选标记，对乙酰氨基酚(无色)在酰胺酶催化下其酰胺键断裂生成褐色的对氨基苯酚。取10 μ 1酶连产物转化 200μ 1大肠杆菌DH5a感受态细胞(TaKaRiCode :D9057)，具体方法参照F.奥斯伯等编的 《精编分子生物学实验指南》P23。涂布含有100mg/kg氨苄青霉素和100mg/kg对乙酰氨基酚的LB平板，培养24h后挑选产生褐色色素的克隆子，进一步验证克隆子能否降解乐果，克隆子对乐果的降解试验方法见实施例1中(1)酰胺类农药降解菌的分离。(7)基因核苷酸序列测定将(6)中获得的能降解乐果、氯苯胺灵和敌稗的阳性克隆子委托上海英骏生物技术有限公司进行序列测定，酰胺酶基因dimtH的核苷酸序列为SEQ IDN0. 1，根据酰胺酶基因dimtH核苷酸序列所推到的465个氨基酸序列为SEQ ID N0. 2。实施例3酰胺酶基因dimtH在BL21 (pET_29a(+))中的高效表达(策略图见图2)(1)酰胺酶基因dimtH的PCR扩增以 ιΗ 向引物5，-TCTGGACATATGATACCGAGACTGACCAACG-3，(SEQ ID N0. 3)和反向引物5’ -TCTGGAGAATTCGCCTTCCATAAGAGCGCCGATAGC-3，(SEQ ID N0. 4)为引物，用 PCR 从 Paracoccus sp. Dimd-2总DNA中扩增出酰胺酶基因dimtH序列。扩增体系
Primer starM (5υ/μ1)0.5 μ 5 χ PCR Buffer II (Mg2+Plus)10 μ dNTP Mixture(各 2.5mM)5 μ Dimd-2 总 DNAIOng正向引物(20μΜ)Ιμ 反向引物(20μΜ)Ιμ 灭菌蒸馏水至50μ1PCR扩增程序a. 95°C 变性 3min ；b. 95°C变性 1. 5min，53°C退火 0. 5min，72°C延伸 1. 5min，进行 25 个循环；c. 72°C延伸lOmin，冷却到室温。(2) PCR 产物用 NdeI 和 EcoRI 双酶切。
酶切体系
权利要求
1.副球菌Dimd-2(ParaC0CCuSsp.)，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC M 2011234，保藏日期为2011年7月4日。
2.一种酰胺酶基因dimtH，其核苷酸序列为SEQ ID NO. 1。
3.权利要求2所述的酰胺酶基因dimtH所编码的酰胺酶DimtH，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
4.含有权利要求2所述的酰胺酶基因dimtH的重组表达载体。
5.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于是将权利要求2所述的酰胺酶基因dimtH插入pET-29a(+)的NdeI和EcoRI位点之间所得。
6.含有权利要求2所述的酰胺酶基因dimtH的基因工程菌，所述的基因工程菌的出发菌株优选大肠杆菌BL21 (DE3)。
7.权利要求2所述酰胺酶基因dimtH在构建降解杀虫剂乐果、除草剂氯苯胺灵或敌稗的转基因作物中的应用。
8.权利要求2所述酰胺酶基因dimtH在去除水体中杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗残留中的应用。
9.权利要求3所述酰胺酶DimtH在降解杀虫剂乐果、除草剂氯苯胺灵或敌稗中的应用。
10.权利要求3所述酰胺酶DimtH在去除水体中杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗残留中的应用。
全文摘要
本发明属于应用环境微生物和农业领域，涉及降解乐果、氯苯胺灵和敌稗的酰胺酶基因dimtH及其编码的蛋白质及其应用。本发明降解乐果、氯苯胺灵和敌稗的酰胺酶基因dimtH全长为1395bp，序列如SEQ ID NO.1所示，其编码产物酰胺酶DimtH含465个氨基酸，序列为SEQ ID NO.2。DimtH能降解杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗。酰胺酶基因dimtH可用于构建可降解杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗的转基因作物，也可用于土壤、水体中杀虫剂乐果和除草剂氯苯胺灵、敌稗的残留的去除及药物合成的生物转化，具有非常重要的理论和应用价值。
文档编号C02F3/00GK102268396SQ20111020838
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月25日 优先权日2011年7月25日
发明者何健, 张隽, 李顺鹏, 杭宝剑, 殷金岗 申请人:南京农业大学