专利名称：一种海洋有机物降解盐单胞菌菌株ghmc414及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种海洋有机物降解盐单胞菌菌株 (Halomonas sp.)及其在处理有机物污染海水中的应用。
背景技术：
近年来，在海水网箱养殖产业飞速发展的同时，养殖“自身污染”问题日益凸现出来，其中养殖过程产生的有机物污染物常常会引发海水网箱养殖的水体发臭、沉积环境恶化，导致水中溶解氧降低，养殖鱼类死亡，水体生态平衡破坏。海水网箱养殖系统作为一种高密度、高投饵的人工养殖生态系统，影响养殖环境最根本的原因在于养殖过程中产生的大量残饵、粪便及死亡动植物残骸等有机物的沉积。 目前的物理和化学去除有机污染物方法都存有一定的局限性。其中物理方法存在效率低下，成本高的缺点；化学方法虽然见效快，但常引起二次污染。为达到对有机污染物快速、高效去除，本发明从海水养殖环境沉积物中富集分离纯化获得一株微生物，并用于对有机物污染的有效治理。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种海洋有机物降解盐单胞菌属菌株，该菌株具有高效有机物降解能力，能快速有效地去除海水环境中的有机物。本发明的第二个目的在于提供上述海洋有机物降解盐单胞菌菌株在处理海水环境中有机物污染的应用。本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的一种海洋有机物降解盐单胞菌菌株，该菌株属于盐单胞菌属(Halomonas sp.)，保藏名称盐单胞菌GHMC414，保藏单位中国典型培养物保藏中心，地址湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，保藏日期2009年8月沘日，保藏号CCTCC NO :M209183。所述海洋有机物降解盐单胞菌菌株的筛选分离鉴定过程为取海水网箱养殖场区的沉积物，在实验室利用选择培养基培养后，分离纯化菌株，根据菌株对饵料有机物降解能力的强弱，最终筛选出一株对饵料有机物有较强降解能力的菌株，编号为GHMC414，然后根据菌株的菌落形态特征、培养特征和生理生化特征，及其16SrDNA基因序列经与Genbank中已登陆的基因序列进行对比分析发现，菌株GHMC414经鉴定为盐单胞菌属，命名为盐单胞菌(Halomonas sp.)GHMC414。本发明的第二个目的在于提供上述海洋有机物降解盐单胞菌菌株在处理有机物污染海水中的应用。在处理有机物污染海水中的具体过程为取经上述分离纯化的盐单胞菌 (Halomonas sp.)GHMC414单菌落，于活化扩大培养基中培养40-4他，按海水与菌液体积比为40-60 1，将盐单胞菌(Halomonas sp.)GHMC414接种于含饵料有机物的海水中， 25-28°C恒温振荡培养l-7d。
上述活化扩大培养基的组成优选为蛋白胨5. 0g，酵母膏1. 0g，磷酸高铁0. Ig,陈海水 IOOOmL, pH 7. 6-8. 2，121°C灭菌 20min。本发明与现有技术相比具有以下优点本发明从海水网箱养殖区沉积物中筛选得到的新菌株，对饵料有机物有较强的降解能力，在l-5d内对饵料有机物的COD去除率达 30. 1 45. 3%。
图1是菌株GHMC414的菌株电镜图片；图2是菌株GHMC414的PCR产物琼脂糖电泳图；图3是投加菌株GHMC414的高浓度饵料有机物海水中的可生化降解性(BOD/ COD0)；图4是投加菌株GHMC414的高浓度饵料有机物海水中的生化耗氧量(BOD)变化图。图5是投加菌株GHMC414的高浓度饵料有机物海水中的化学耗氧量(COD)变化图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。实施例1海水有机物降解菌株的筛选方法一、材料准备1、菌源和实验废水(1)菌源有20多年养殖历史的深圳市大鹏澳海水鱼类网箱养殖场区的沉积物。(2)实验废水(含高浓度饵料有机物海水)杂鱼糜5g，陈海水lOOOmL，pH 7. 6 8. 2，121°C 灭菌 20min。2、培养基(1)选择培养基杂鱼糜20g,陈海水IOOOmL, pH 7. 6 8. 2，121°C灭菌20min。(2)分离及斜面培养基蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高铁0. lg，琼脂粉20g，陈海水 IOOOmL, pH 7. 6 8. 2。(3)活化扩大培养基蛋白胨5g，酵母膏lg，磷酸高铁0. Ig,陈海水lOOOmL，pH 7. 6 8. 2。3、实验仪器和设备美国HACH BOD Trak 测定仪；广东海利电磁式空气压缩机AC0-009E ；苏州安泰超净工作台SW-CJ-IBU ；上海精宏生化培养箱SHP-150 ；苏州欧倍振荡培养箱0BS-2F ；德国HYDRO-BIOS-KIEL 采泥器；日本HIRAYAMA高压灭菌器HVN-85 ；日立H-7650透射电子显微镜；
PC818 型 PCR 仪；电泳仪及电泳槽；加热板及滴定仪；凝胶紫外观测仪等。二、菌株的分离与筛选1、菌株的富集取大鹏澳海水鱼类网箱养殖场沉积物表层以下5cm处的沉积物放入采样袋，再放入0°C冰盒中带回实验室。取250g沉积物加到2L的富集瓶中，加入750mL灭选择培养基， 并加入适量的纤维棉，在室温条件下连续曝气富集培养2个月，中间据情况不定期添加灭菌海水和选择培养基。2、有机物降解细菌的分离纯化挑选并直接冲洗细菌附着量较大的纤维棉，得到富集菌液，适当稀释，均勻涂布于分离培养基平板上培养3d，待菌落长出后，挑取形态各异的单菌落，在分离培养基平板上进行划线分离，直至得到纯的单菌落。将分离纯化的细菌接种至斜面培养基中并于冰箱4°C保存。3、有机物降解细菌的筛选通过用BOD及CODfc值来衡量菌株对饵料有机物的利用能力，以有机物的可生化降解性(BOD5ADDci)来表示5d时间里细菌利用饵料有机物的降解能力。取分离纯化得到的菌株于活化扩大培养基中2548°C培养40-4他，按海水与菌液体积比40-60 1，接种到含高浓度饵料有机物的海水中，取不接种菌液的饵料有机物海水作为空白对照，2518°C温度振荡培养，反应时间l-5d。经过筛选获得一株编号为GHMC414的菌株，即海洋有机物降解菌株GHMC414。实施例2海洋有机物降解菌株GHMC414的鉴定1、对海洋有机物降解菌株GHMC414的鉴定对海洋有机物降解菌株GHMC414进行了生理生化的鉴定以及16S rDNA分子的鉴定，从分子水平，并结合细菌形态学特征及生理生化特性分析确定菌株的种属。16S rDNA序列分析主要按照以下步骤①细菌核DNA的提取1)用高压灭菌的牙签挑单菌落接种于扩大培养基内培养过夜，取1.5mL菌液于 Eppendorf管内，8000rpm室温离心5min，彻底除去上清。2)加STE缓冲液1. 5mL洗涤一次，离心弃上清，再加入0. 6mLTE溶液，重悬细菌。3)力Π 30 μ L10mg/mL 的溶菌酶，37°C水浴 45min。4)力卩65yL10%的SDS，20mg/mL的蛋白酶K3yL，50°C水浴2h，至溶液变清。5)加入等体积酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白质为止。6)在上清液中加入1/10体积的3M的NaAc (pH5. 2)。7)加入等体积的异丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒缠绕挑出DNA细丝，再用70%的乙醇洗涤一次，自然晾干，并将DNA溶于100 μ LTE溶液中。8)加入终浓度为 50μ g/mL 的 foiase，37°C，30min，去除 RNA，_20°C保存备用。②16S rDNA基因的PCR扩增
Pl :27F(5' -AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3')P2 :1492R(5' -AAG TCG TAA CAA GGT AAC C_3')在50 μ L的反应体积中，加入1 μ L模板DNA(0. lug)，0. 5 μ LPl和Ρ2 (终浓度为 0. 5 μ Μ), 1 μ L dNTP (每种 NTPO. 2mM)，0· 5 μ LTaq 聚合酶(2U)禾口 5 μ LlO X PCR 缓冲液。PCR 扩增条件为94°C预变性5min，在94°C变性30s，61_65°C退火30s，72°C延伸lmin，循环30 次；最后72°C终延伸IOmin0③PCR产物的回收将PCR产物以琼脂糖凝胶进行电泳后，在紫外灯下切取含欲回收片段的凝胶， 放入1. 5ml离心管中加2倍体积TE，65°C水浴IOmin后加等体积水饱和酚抽提一次离心后取上层水相再用酚-氯仿-异戊醇抽提一次，收集上清加0. 1倍体积的lOmol/L乙酸铵和 2倍体积无水乙醇沉淀，离心，用70%乙醇洗沉淀一次，风干后溶于适量灭菌双蒸水。①16S rDNA的部分序列测定和分析P-f :CACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC ；P-r :GGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。力口入 1 μ L 模板 DNA ( < 0. 1 μ g)，PCR 扩增 30 个循环(94 "C lmin, 55 "C 30s, 72 V 2min)。采用ABI PRISM测序试剂盒中染料终止剂终止反应。然后，在 AppliedBiosystem373ADNA测序仪上测序。测得的16S rDNA序列采用BLAST软件与GenBank 数据库比较分析，最终从分子水平上确定该菌的种属。2、16S rDNA 序列测定本发明采用对16S rDNA序列测定和分析的方法对细菌进行分子水平的鉴定。以细菌的核DNA为模板，以16S rDNA基因的PCR扩增的通用引物为引物，进行PCR扩增，得到长度为1512bp的扩增带用琼脂糖凝胶电泳检测，如图2所示。PCR产物经纯化后，测定
其全序列。
AGAGTTTGAT CCTGGCTCAGATTGAACGCT GGCGGCAGGCCTMCACATGCMGTCGAGC60
GGAMCGATGGAAGCTTGCTTCCAGGCGTC GAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCATGGGA120
ATCTGCCCGATAGTGGGGGATMCCTGGGGAMCCCAGGCTAATACCGCATACGTCCTAC180
GGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTATCGGATGAGCCCATGTCGGATTAGCT240
TGTTGGTGAGGTMTGGCTCACCMGGCGACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCA300
GCCACATCGGGACTGAGACACGGCCCGMCTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGMTATTG360
GACMTGGGCGAMGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGMGMGGCCCTCGGGTTGT420
AMGCACTTTCAGTGGGGMGAAAGCCTCGGGATTMTACTTCCGAGGMGGACATCACC480
CACAGMGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTMTACGGAGGGTGCGAGC540
GTTMTCGGAATTACTGGGCGTAMGCGCGCGTAGGCGGTCTGATCAGCCGGTTGTGAAA600
GCCCCGGGCTCAACCTGGGAACGGCATCCGGMCTGTCAGGCTAGAGTGCAGGAGAGGAA660
GGTAGMTTCCCGGTGTAGCGGTGAMTGCGTAGAGATCG GGAGGAATACCAGTGGCGAA720
GGCGGCCTTCTGGACTGACACTGACGCTGAGGTGCGAMGCGTGGGTAGCAMCAGGATT780
AGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAMCGATGTCGACTAGCCGTTGGGGTCCTTGAGACC840
TTTGTGGCGCAGTTMCGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAA900
CTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACMGCGGTGGAGCATGTGGTTTMTTCGATGCAA960
CGCGMGMCCTTACCTACCCTTGACATCGTGCGAACTTGGTAGAGATACCTTGGTGCCT1020
TCGGGMCGCACAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAMTGTTGGG1080
TTAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCCTATTTGCCAGCGATTCGGTCGGGMCTC1140
TAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCMGTCATCATGGCC1200
CTTACGGGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGGGTTGCAAGACCGCGA1260
GGTGGAGCTAATCCCAGAMGCTGTTCTCAGTCCGGATCGGAGTCTGCMCTCGACTCCG1320
TGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGMTACGTTCCCGGGCC1380
TTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGACTGCACCAGAAGTGGTTAGCCTAACT1440
TCGGAGGGCGATCACCACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGMGTCGTAACMGGTMCC1499实施例3海洋有机物降解菌株GHMC414菌落形态、生理和生化特征海洋有机物降解菌株GHMC414菌落形态、生理和生化特征见表1_1 ；细胞形态见图 1。表1-1海洋有机物降解菌株GHMC414的菌落形态特征以及主要的生理生化特征
权利要求
1.一种海洋有机物降解盐单胞菌菌株，其特征在于该菌株属于盐单胞菌菌属 (Halomonas sp.)，保藏名称盐单胞菌GHMC414，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2009年8月28日，保藏号CCTCC NO :M209183。
2.权利要求1所述的海洋有机物降解盐单胞菌菌株在处理受有机物污染海水中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的海洋有机物降解盐单胞菌菌株处理受有机物污染海水的具体过程为取经分离纯化的海洋有机物降解盐单胞菌(Halomonas sp.) GHMC414单菌落，于活化扩大培养基中培养40-4 ，按海水与菌液体积比为40-60 1， 将海洋有机物降解盐单胞菌(Halomonas sp.)GHMC414接种于含高浓度饵料有机物海水中， 25-28°C恒温振荡培养l-7d。
全文摘要
本发明公开了一种海洋有机物降解盐单胞菌菌株，该菌株属于盐单胞菌属(Halomonas sp.)，保藏名称盐单胞菌GHMC414，保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2009年8月28日，保藏号CCTCC NOM209183。该菌株具有高效有机物降解能力，能快速有效的去除受有机物污染海水中的有机物，并且对海水养殖生物没有毒害致病作用。本发明对去除海水养殖环境中高浓度有机物污染具有安全、环保、高效的特点。
文档编号C02F3/34GK102168031SQ20101052482
公开日2011年8月31日 申请日期2010年10月29日 优先权日2010年10月29日
发明者古小莉, 孟霞, 廖秀丽, 黄洪辉, 齐占会 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所