专利名称：：一株烟曲霉及其降解咪唑乙烟酸的应用的利记博彩app
技术领域：
：本发明涉及一株烟曲霉及其应用。
背景技术：
：咪唑乙烟酸，是20世纪80年代由美国氰胺(现为BASF)公司开发的咪唑啉酮类除草剂，是乙酰乳酸合成酶(ALQ或乙酸羟酸合成酶(AHAs)抑制剂。因其具有杀草谱广、选择性强、活性高、用量低、价格低廉、药效良好等优势，被广泛使用，目前已经成为大豆田中最优秀的除草剂品种之一。保守估计，每年仅在黑龙江省咪唑乙烟酸单剂年销售约3830t，使用面积为1.33xl06hl06hm2(耿贵，黑龙江省除草剂药害、面源污染状况及预防对策，中国农学通报第M卷增刊2008年11月)。咪唑乙烟酸的推荐用量为75-100g·!πΓ2(有效成分计)，在土壤中不易降解、挥发和光解，其半衰期长，残留量大。如黑河地区土壤咪唑乙烟酸残留含量达38μg·!^—1。研究表明微量咪唑乙烟酸即可对敏感作物造成药害，土壤中咪唑乙烟酸含量22μg-kg-1对水稻敏感，10μg·kg-1对马铃薯敏感，2μg·kg-1对甜菜敏感，7μg·kg—1对油菜敏感，8μg·kg—1对番茄敏感，2μg·kg—1对洋葱敏感，17μg·kg—1对甘蓝敏感。施药12个月内不可种植玉米、小麦、大麦、烟草；施药18个月内不可种植向日葵；施药M个月内不可种植水稻、高粱、谷子；施药36个月内不可种植马铃薯、南瓜、西瓜、洋葱、番茄；施药后48个月内不可种植甜菜、油菜、亚麻(苏少泉.1998.长残留除草剂对后茬作物安全性问题[J].农药.37(12)；耿贵，黑龙江省除草剂药害、面源污染状况及预防对策，中国农学通报第M卷增刊2008年11月)。Mark等人先后证明了施用咪唑乙烟酸后，对玉米、高粱、水稻、棉花、甜菜及马铃薯等作物产生不同程度的药害而造成其减产甚至绝收(MarkΜ.ect.1989.Availabilityandpersistenceofimazaquin,imazethapyrandclomazoneinsoi1[J].WeedScience.37(3)；CurranW.S.1992.Effectsoftillageandapplicationmethodonclomazone,imazaquinandimazethapypersistence[J].WeedScience.40(3)；陈.1，杨绍义.1992.普施特在土壤中活性的研究[J].杂草科学.(1)；MoyerJ.R.ect.1996.ImidazolinoneeffectsonfollowingrotationalcropsinSouthernAlberta.WeedTechnology.10(1)；0'SullivanJ.1998.EffectofimazethapyrandimazamoxsoilresiduesonseveralvegetablecropsgrowninOntario[J].Canadianjournalofplantscience.78(4)；苏少泉.1998.长残留除草剂对后茬作物安全性问题[J].农药.37(12)；黄春艳，陈铁保，王宇，黄元炬，丛林，朴德万，孙宝宏.2005.几种长残留除草剂对后茬作物甜菜的影响.中国糖料(3)；赵云和，张子丰，孙利.2006.咪草烟土壤残留对后茬水稻的影响.农药.45(3)；黄春艳.2009.黑龙江省农田草害发生防治现状、问题和建议.黑龙江农业科学(3))。由此可见，咪唑乙烟酸的残留问题已成为制约种植业结构调整以及农业可持续发展的严重障碍。所以关于如何解决咪唑乙烟酸残留的问题，如何使其能更好的服务于农业生产，己成为亟待解决的问题。研究证明微生物降解是土壤中残留咪唑乙烟酸的主要降解途径(苏少泉.1998.长残留除草剂对后茬作物安全性问题[J].农药.37(12))，但目前关于咪唑乙烟酸的生物降解菌研究较少，且主要集中在细菌方面。Wang等报道了从土壤中分离得到节细菌属细菌WffX-I对咪唑乙烟酸有一定降解作用(WangX，LiuX，WangH,etal.2007.Utilizationanddegradationofimazaquinbyanaturallyoccurringisolateofarthrobactercrystallopoietes[J]·Chemospher.67(11))；庞福德通过富集得到丙酸杆菌属、海球菌属和酸单胞杆菌属3株细菌对咪唑乙烟酸具有显著的降解作用，90d时降解率分别为71.38%,67.11%和80.11%(庞福德.2007.咪唑乙烟酸降解细菌的筛选及降解特性的研究.东北农业大学农学硕士学位论文)；丁伟等分离到1株产碱菌属细菌BH-I可高效降解咪唑乙烟酸(丁伟，白鹤，程茁等.2008.咪唑乙烟酸降解菌的分离、鉴定及其降解特性研究[J].环境科学.29(5))；郑玉莲等从咪唑乙烟酸生产厂的污泥和长期施用咪唑乙烟酸的土壤中筛选获得了4株能高效降解咪唑乙烟酸的细菌zx2、zx5、zx6和zx7，它们都能以咪唑乙烟酸为唯一碳源生长，且对咪唑乙烟酸的降解率均在80%以上，其中的zx2和zx7是芽孢杆菌属，zx5是产碱杆菌科，zx6是无色杆菌属(郑玉莲，许景钢，李淑芹，曹知平.2009.普施特优势降解菌的筛选与鉴定[J].东北农业大学学报.40(6))。
发明内容本发明的目的在于提供一株烟曲霉，该烟曲霉能够有效降解咪唑乙烟酸，丰富了咪唑乙烟酸降解菌库，提供了解决咪唑乙烟酸残留药害问题的技术支持。本发明是通过以下技术方案来实现的一株烟曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2，其分类命名是烟曲霉(Aspergillusfumigatus)，其微生物保藏号是CGMCCNo.3859，保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏时间是2010年5月20日。本发明的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2是从黑龙江省嫩江某农场长期施用咪唑乙烟酸的大豆田土壤中分离得到，具体分离方法为从黑龙江省嫩江某农场长期施用咪唑乙烟酸的大豆田中取回土壤，将在多点取得的土壤在无菌操作台内混合，称取2g，投入装有IOOmL蒸馏水的250mL三角瓶中，无菌封口膜封口，在200r^mirT1的转速下振荡20min，适当稀释后得到稀释液，滴加1滴该稀释液到含有咪唑乙烟酸的马丁氏培养基平板上，用三角玻璃棒涂平，倒置培养，选择长势良好的菌株，在马丁氏培养基平板上划线分离，直到获得纯菌，即为耐受咪唑乙烟酸的真菌。将分离纯化的耐受咪唑乙烟酸的真菌制作成孢子悬液(IO6CFU·mL—1)，按照2%(ν/ν)的量分别加到咪唑乙烟酸浓度为200mg·Γ1的基础盐培养液中，对照样品为咪唑乙烟酸浓度为20(^.171的基础盐培养液，在^°C，140r.mirT1摇床振荡培养，筛选出降解咪唑乙烟酸能力强的真菌LZ2。该烟曲霉的鉴定结果具体为(1)咪唑乙烟酸降解菌LZ2的培养特征菌落直径2!Bern，正面呈乳白色，致密绒毛状，菌丛高约1mm，菌落背面中央呈黄色，四周呈白色。(2)咪唑乙烟酸降解菌LZ2的形态特征分生孢子头为球形或半球形，直径3μm左右，串生于孢子梗顶端，呈不同程度的浅灰色。(3)提取咪唑乙烟酸降解菌LZ2的DNA，由上海生工生物工程技术服务有限公司对提取的DNA进行扩增及序列测定。所得测序结果在通过BLAST程序与GeneBank中核酸数据进行序列搜索比对后，选择亲缘关系较近的菌株作为参比菌株，用MEGA4.0软件构建系统发育树。LZ2与数据库中同源性较高的14个真菌进行比较，其18SrDNA序列与烟曲霉(Aspergillus)的14个真菌都有较高的序列同源性，相似度也都在都达到99%。因此，结合LZ2培养特征和形态特征将LZ2分类为烟曲霉。本发明的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859能以咪唑乙烟酸为唯一碳源生长，并在含200mg·Γ1咪唑乙烟酸的基础盐培养基中培养8天，降解率可达82.91%。为治理咪唑乙烟酸污染土壤和水体提供技术支持。本发明的烟曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859能在含IOOg·kg-1咪唑乙烟酸的土壤中培养60天，可使咪唑乙烟酸的降解率达76.84%，远高于自然土壤中咪唑乙烟酸降解率，且使咪唑乙烟酸在土壤中降解的半衰期由自然降解的75.9天提前到30.9天，提前了48.6天。说明本发明烟曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859能有效加快土壤中咪唑乙烟酸的降解。图1为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859的菌落形态图；图2为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859的扫描电镜图；(X5000)；图3为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859的系统发育树；图4为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859降解咪唑乙烟酸的曲线图；图5为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859对在土壤中的咪唑乙烟酸降解后咪唑乙烟酸的残留量随培养时间的变化图；图6为烟曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2CGMCCNo.3859在土壤中对咪唑乙烟酸的降解效果图。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1本发明烟曲霉LZ2的分离1、菌株的分离从黑龙江省嫩江某农场长期施用咪唑乙烟酸的大豆田中取回土壤，将这些土壤在无菌操作台内混合，称取2g，投入装有IOOmL蒸馏水的250mL三角瓶中，无菌封口膜封口，在200r·miiT1的转速下振荡20min，适当稀释后得到稀释液，滴加1滴稀释液到含有咪唑乙烟酸的马丁氏培养基平板上，用三角玻璃棒涂平，倒置培养于生化培养箱。7d后选择长势良好的菌株，分别在马丁氏培养基平板上划线分离，直到获得纯菌，即为耐受咪唑乙烟酸的真菌多株。制作上述耐受咪唑乙烟酸的真菌的孢子悬液(IO6CFU·mL—1)，按照2%(ν/ν)的量分别加到咪唑乙烟酸浓度为200mg·Γ1的基础盐培养液中，对照为不接菌的咪唑乙烟酸浓度为200mg·Γ1的基础盐培养液，280C，140r·mirT1摇床振荡培养，筛选出降解咪唑乙烟酸能力强的真菌LZ2。2、菌株的鉴定(1)咪唑乙烟酸降解菌LZ2的培养特征菌落直径2!Bern，正面呈乳白色，致密绒毛状，菌丛高约1mm，菌落背面中央呈黄色，四周呈白色。如图1所示。(2)咪唑乙烟酸降解菌LZ2的形态特征分生孢子头为球形或半球形，直径3μm左右，串生于孢子梗顶端，呈不同程度的浅灰色。如图2所示。(3)提取咪唑乙烟酸降解菌LZ2的DNA，由上海生工生物工程技术服务有限公司对提取的DNA进行扩增及序列测定。所得测序结果在通过BLAST程序与GeneBank中核酸数据进行序列搜索比对后，选择亲缘关系较近的菌株作为参比菌株，用MEGA4.0软件构建系统发育树。如图3所示。LZ2与数据库中同源性较高的14个真菌进行比较，其18SrDNA序列与烟曲霉(Aspergillus)的14个真菌都有较高的序列同源性，相似度也都在都达到99%。因此，结合LZ2培养特征和形态特征将LZ2分类为烟曲霉。实施例2本发明烟曲霉LZ2降解咪唑乙烟酸的应用1、烟曲霉LZ2降解咪唑乙烟酸的实验按照2%(ν/ν)的量将LZ2的孢子悬液(IO6CFU·mL—1)加到咪唑乙烟酸浓度为200mg·厂1的基础盐培养液中，对照样品为咪唑乙烟酸浓度为200mg·厂1的基础盐培养液，在^°C，140r^irT1摇床振荡培养。每天取样测定咪唑乙烟酸含量并用干重法测定菌体生长量。如图4所示。由图4可以看出，LZ2的延滞期为3d，在此期间，LZ2对咪唑乙烟酸的降解作用很微弱；LZ2的对数生长期为第37d，这时菌株快速生长、代谢旺盛，咪唑乙烟酸的降解率也不断提高；第7d之后生长量缓慢下降，咪唑乙烟酸的降解率趋于平稳，变化不大。在第8d时LZ2的生长量和咪唑乙烟酸的降解率均接近最大值，菌体干重为83.5mg,咪唑乙烟酸降解率达81.3%。2、烟曲霉LZ2在土壤中降解咪唑乙烟酸的实验试验分为3组，每组做15个样品，每个样品用土100g，试验设3次重复。3个组分别为1)空白组，不加咪唑乙烟酸的土壤100g，不加菌，只施入与LZ2处理组等体积的生理盐水；2)自然降解组，加有咪唑乙烟酸的土壤IOOg(按每kg干土加IOOyg咪唑乙烟酸的比例加入)和LZ2处理组等体积的生理盐水，不加菌；3)LZ2处理组，加有咪唑乙烟酸的土壤IOOg(按每kg干土加IOOyg·咪唑乙烟酸的比例加入)并加入LZ2孢子悬液以及与以上两组等体积的生理盐水，菌体终浓度为2.OXIO7CFU·g—1干土。调节土壤含水量为40%，记录上述3组中调节含水量后的土样总重量。每天称量，加水补足，以保持土壤的含水量不变，置于恒温培养箱中培养，分别在培养后的第1，7，15，30，60天后取样，用生物测定法测定各组土壤中咪唑乙烟酸的残留量(如图5所示)，以空白组为基础，求出自然降解组和LZ2处理组中咪唑乙烟酸的降解率，结果如图6所示。由图5可以看出，咪唑乙烟酸在土壤中的残留量与时间符合一级动力学方程，自然降解组的咪唑乙烟酸在土壤中的自然降解动态方程为y=100.66e-°_°°88x，R2=0.9908，半衰期T172=79.5天；LZ2处理组的咪唑乙烟酸在土壤中的降解动态方程为y=103.05e_°_°234x，R2=0.9653，半衰期T1/2=30.9天；较自然降解组的半衰期提前48.6天。由图6可以看出，烟曲霉LZ2在含100μg-kg"1咪唑乙烟酸的土壤中培养60天，可使咪唑乙烟酸的降解率达76.84%，远高于自然土壤中咪唑乙烟酸降解率。说明LZ2能有效加快土壤中咪唑乙烟酸的降解。以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。权利要求1.烟曲霉AspergillusfumigatusLZ2，其保藏号为CGMCCNo.3859。2.烟曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859在降解咪唑乙烟酸中的应用。3.烟曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859在生物净化受咪唑乙烟酸污染的土壤或水体中的应用。全文摘要本发明涉及一种烟曲霉及其应用。本发明烟曲霉(Aspergillusfumigatus)LZ2的保藏号为CGMCCNo.3859。本发明烟曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859能以咪唑乙烟酸为唯一碳源生长，并且其在含200mg·L-1咪唑乙烟酸的基础盐培养基中培养8天，可使咪唑乙烟酸的降解率达82.91％，为治理咪唑乙烟酸污染土壤和水体提供技术支持。同时该烟曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859在含100μg·kg-1咪唑乙烟酸的土壤中培养60天，可使咪唑乙烟酸的降解率达76.84％，远高于自然土壤中咪唑乙烟酸降解率，且使咪唑乙烟酸在土壤中降解的半衰期由自然降解的75.9天提前到30.9天，提前了48.6天。本发明烟曲霉AspergillusfumigatusLZ2CGMCCNo.3859能有效加快土壤中咪唑乙烟酸的降解。文档编号C02F3/34GK102329734SQ201010223818公开日2012年1月25日申请日期2010年7月12日优先权日2010年7月12日发明者曹知平,李淑芹,许井钢申请人:东北农业大学