专利名称：一种酵母菌及其在蔬菜腌制废水弱碱化处理中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于环境微生物技术领域，具体涉及一株假丝酵母菌
G70(C"wfefe //^wwe朋ge"w:y)，保藏编号为CGMCC No.3000。本发 明还涉及假丝酵母菌G70(Ow^V^ Aa/mwe朋ge"w'》在蔬菜腌制废水 处理中的用途。
背景技术：
腌制蔬菜在我国民众的饮食中有着不可取代的地位，流传久远而 广泛。随着工业化的发展，腌制蔬菜产业有了长足的发展，有了像榨 菜、东北泡菜这样一批畅销全国的产品；而产业规模的扩大，更是让 腌制蔬菜产业成为了一些地方的支柱产业，重庆涪陵区搾菜产业链年 产值达20多亿元，浙江余姚市的搾菜产业年产值也在15亿元以上。
但是，蔬菜腌制会产生大量的高盐酸性有机废水，直接排放会造 成严重的环境污染； 一是导致接纳水系的富营养化，导致水体变黑发 臭；二是破坏农田土壤结构，使土壤碱性增导致土质硬化、板块化； 三是腌制废水自身会散发出难闻的异味，严重影响周围居民生活环 境。
目前，我国蔬菜腌制处理中遇到的问题包括以下几个方面一，废水含盐量高，传统的活性污泥法处理效果很差，而费用较高的物化 处理方法又很难被利润微薄的生产企业接受；二，生产企业数量众多 且规模普遍较小，加之分布零散，不利于采用先进技术对废水进行集 中的大规模处理。以榨菜为例，只有涪陵地区的少数几家龙头企业实 现了对榨菜腌制液的处理和资源回收。
嗜(耐)盐菌的生理特性使其能够适应高盐的生长环境，己有研 究结果表明嗜(耐)盐菌在处理高盐污水方面具有很大的优势和潜力。 目前，蔬菜腌制废水的处理研究也已经转向了嗜(耐)盐菌的工程利 用，并在理论研究和工艺设计上取得了一些重大突破。但是，由于蔬 菜腌制废水中含有较多的有机酸，废水偏酸性且pH波动较大，不利 于嗜(耐)盐菌的生长，使得微生物处理系统无法稳定、有效地运行。
现有普遍通过添加化学药剂来调节蔬菜腌制废水的pH，但这种方法
存在以下两个问题 一是成本高，因为蔬菜腌制废水中含有较多的有 机酸，酸度大，需要投加大量的药剂才能将废水pH调节至中性；二 是产生了额外的污染，化学药剂的大量使用不仅增加了废水中的污染 物量，而且会产生大量的污泥，这些污泥如果处理不当会造成二次污 染。因此，迫切需要发展一种经济可行的新方法来对蔬菜腌制废水进 行弱碱化处理。
酵母菌因其独特的细胞结构，对外部环境具有较强的适应能力， 具有较广的pH生长范围和高有机负荷耐受力；而有些被称为耐盐性 酵母或渗透耐性酵母的酵母菌更是能在较高盐浓度的环境中生长。己 有的石开究发现尺/w，gramyces ,ag77&、 Sacc/zarawji/cay cerev&z》e 、Ca"(i油w".to (Hang Y, D., Splittstoesser D. F., Landschoot R. L. (1972), Appl. Environ. Microbiol., 24 (6):励7-1008)和i Woto油n^ra(C.T. Shih, Y.D. Hang (1996)， Lebensm,Wiss. u,Techno., 29:570-572)不仅可
以在泡菜废水中生长，而且可以通过自身的代谢活动将泡菜废水的酸 度完全去除掉，同时对COD也有很好的去除效果。
因此，筛选合适的酵母菌，使其能够在对蔬菜腌制废水进行弱碱 化处理的同时去除废水的部分COD，将是大幅降低蔬菜腌制废水处 理成本的一种有效方式。
发明内容
本发明的一个目的在于克服目前用化学方法调节蔬菜腌制废水 pH的缺陷，提供一株既可以对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理又具有 较好的COD去除效果的酵母菌。
本发明所提供的对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理的酵母菌株是 假丝酵母菌 G70(Ga"^3b Afl/mwea"ge"w; , 或简写为 C. ^/mwe朋ge附外该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.3000，保藏日期为2009年4 月2曰。
假丝酵母菌G70从浙江慈溪某榨菜厂污水排放口泥样中分离得
到。富集和分离培养基均为榨菜废水，将榨菜废水过滤、12rc灭菌
30min即可，pH4.6，盐度3.5%(以NaCl计)，固体培养基加6%的琼 脂；置于培养箱3(TC培养。在液体培养基里，假丝酵母菌G70形成沉淀；在固体培养基里，该菌菌落呈米黄色，圆形，表面突起，不湿
润，直径约2mm;细胞显微镜下(01ympus,BX40)该菌株呈现运动 性，形态为椭圆形居多(3-5nmx2-3pm)， 一端芽殖(见图l)。 经生物学特性研究，假丝酵母菌G70具有如下的生理特征
1) 兼性好氧；
2) 温度生长范围为15-40°C，最适为25-30°C;
3) pH生长范围为3-10，最适为4-5;
4) 盐度生长范围(以NaCl计)为0-10%，最适为0-2%。 对假丝酵母菌G70的26S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，
发现与已知假丝酵母菌C朋^/a Aa/wwe朋gm^ NBRC 101967T的 26S rRNA基因序列相似性大于99.2%，假丝酵母菌G70的26S rRNA 基因序列如SEQIDNO.l所示。
假丝酵母菌G70可在液体发酵培养基如麦芽浸出粉培养基和察 氏培养基上培养，优选麦芽浸出粉培养基，培养温度15-40°C;培养 后可在4-C下短期保藏，若要长期保藏，则使用甘油冷冻管或冷冻干 燥管保藏比较合适。上述麦芽浸出粉培养基的组成(w/V)为干麦 芽浸出粉0.3%、干酵母粉0.3%、蛋白胨0.5%、葡萄糖1%， pH约5.5， 溶剂为水，固体培养基加2%琼脂。
本发明的另一个目的是提供一种使用假丝酵母菌G70 (C.
CGMCC No.3000对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理 的方法，包括以下步骤
l)将假丝酵母菌G70接种于液体发酵培养基中(优选麦芽浸出粉液体培养基)进行活化培养，优选的培养条件为25-3(TC活化培养 18-24h;
2) 将活化培养好的假丝酵母菌G70按1-10% (v/v)的接种量转 接到蔬菜腌制废水中进行扩大培养，优选的培养条件为在25-3(TC培 养12陽24h;
3) 将扩大培养好的假丝酵母菌G70按照1-10% (v/v)的接种量 投加到蔬菜腌制废水处理池中，闷曝培养，至废水pH上升到7.0-8.0， 污泥沉降比为10-20%,完成污泥培养；
4) 根据实际工艺设计以连续进水或间歇进水方式对蔬菜腌制废 水进行好氧处理，完成对废水的弱碱化处理。具体工艺参数可根据后 续处理对废水pH的要求来设定。
上述方法步骤2)中，可先将活化培养好的假丝酵母菌G70按 1-10% (v/v)的接种量转接到蔬菜腌制废水中在25-3(TC进行适应性 培养12-18h，再将适应性培养好的假丝酵母菌G70按1-10% (v/v) 的接种量转接到蔬菜腌制废水进行扩大培养；扩大优选的培养条件为 在25-30。C培养12-24h。
扩大培养可根据实际需要进行多次重复，直至液体培养的假丝酵 母菌G70满足用量要求。
上述方法步骤3)中，假丝酵母菌G70按照1-10% (v/v)的接种 量可一次性投加完成，也可在一定时间内分批投加完成。
上述方法步骤4)中，所述的间歇进水方式具体可采用SBR工艺 对步骤3)中的蔬菜腌制废水进行处理，具体工艺参数例如处理周期、出水排水量、各段运行时问、温度等，可根据实际情况进行设定。
为保证假丝酵母菌G70的活性及处理效果，上述方法中蔬菜腌 制废水的pH应不小于3.0(优选pH范围为3.0-7.0，更优选为3.5-5.0)， 盐浓度以NaCl计应不大于10%。
本发明发现的假丝酵母菌G70 CGMCC No.3000是一株盐度耐受 能力强，pH生长范围广的菌株，生长代时短，菌体沉降性好；该菌 株可利用自身的生长代谢使蔬菜腌制废水的pH在较短时间内由酸性 上升至弱碱性，且能有效去除蔬菜腌制废水的部分COD。本发明提 供的蔬菜腌制废水弱碱化处理方法工艺简单，成本低廉，快速有效， 可应用于蔬菜腌制废水的预处理阶段，对蔬菜腌制废水进行弱碱化处 理。本发明大幅降低了蔬菜腌制废水的处理成本，有望在蔬菜腌制废 水处理方面发挥重大作用。
图1为假丝酵母菌G70 CGMCCNo.3000的显微镜照片，放大倍 数1000倍；图中黑点为酵母菌。
图2为假丝酵母菌G70 CGMCC No.3000生长曲线图，培养温度 为30°C。
具体实施方式
实施例1、假丝酵母菌G70的分离筛选将采自浙江慈溪某榨菜厂污水排放口泥样2g放在50ml经过滤的 搾菜废水中，加入玻璃珠振荡打散，取上清液5ml加入到50ml经过 滤的榨菜废水中，温度3(TC，转速160rpm，摇床富集培养4天。将 富集培养菌液用过滤、灭菌后的榨菜废水梯度稀释后涂布榨菜废水培 养基平板，3(TC静置培养4天；根据菌落形态挑取不同的单菌落接种 到过滤、灭菌后的榨菜废水中，温度3(TC,转速160rpm，摇床培养 48h，筛选可使搾菜废水碱化的菌株；将可使榨菜废水碱化的菌株进 行划线培养，得到单克隆，划线仍使用榨菜废水培养基平板。挑取单 克隆转接到过滤、灭菌后的榨菜废水中，温度30。C，转速160rpm， 摇床培养；待菌液生长至OD6。。为0.3-0.6时，按2。/。(v/v)的接种量转 接至装有300ml过滤除菌榨菜废水的锥形瓶中，温度30°C，转速 160rpm，摇床培养48h，每6h取一次样测定菌液pH和COD (菌液 6000rpm离心10min后收集上清，用连华科技的5B-3B型COD多元 速测仪测定)，筛选得到碱化效果和COD去除效果最好的菌株假丝酵 母菌G70 (CGMCCNo.3000)。
上述榨菜废水pH为4.6，盐度为3.5% (以NaCl计)，固体培养 基加6%琼脂；灭菌条件为121'C， O.lMPa， 30min。
实施例2、假丝酵母菌G70生长条件
1)生长温度范围用接种环挑取假丝酵母菌G70到麦芽浸出粉 培养基斜面(干麦芽浸出粉0.3%、干酵母粉0.3%、蛋白胨0.5%、葡 萄糖1%，琼脂2%， pH自然(约5.5))' 3CTC恒温静置培养24-36h，出现乳白色的菌体；用接种环从斜面上挑取生长良好的菌体接种到装
有麦芽浸出粉液体培养基(干麦芽浸出粉0.3%、干酵母粉0.3%、蛋 白胨0.5%、葡萄糖1%， pH自然(约5.5))的锥形瓶中，温度3(TC， 转速160rpm，摇床培养，待菌液生长至OD6o。为0.3-0.6时按2。/。(v/v) 的接种量转接至新鲜的麦芽浸出粉培养基，测定假丝酵母菌G70的 生长温度范围。温度梯度为10°C、 15°C、 20°C、 25°C、 30°C、 35°C、 4(TC和45'C，转速160ipm，摇床培养，用紫外分光光度计测定菌液 的OD6(X)。结果表明假丝酵母菌G70生长温度范围为15-40°C,最适 为25-30。C。
2) 生长盐浓度范围(以NaCl计)分别向配制好的麦芽浸出粉 液体培养基中加入不等量的NaCl，配制盐浓度梯度培养基，NaCl浓 度梯度(m/v)为0、 1%、 2%、 3%、 4%、 5%、 6%、 7°/。、 8%、 9%、 10%、 15%、 20%。将生长至对数期的假丝酵母菌G70按2。/。(v/v)的 接种量转接至盐浓度梯度培养基，温度30。C，转速160rpm，摇床培 养，用紫外分光光度计测定菌液的OD,。结果表明假丝酵母菌G70 的生长盐浓度范围(以NaCl计)为0-10%，最适为0-2%。
3) 生长pH范围分别向配制好的麦芽浸出粉液体培养基中加 入盐酸或NaOH调节其pH， pH梯度为2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10。将生长至对数期的假丝酵母菌G70按2。/。(v/v)的接种量转接至pH 梯度培养基，温度30。C，转速160rpm，摇床培养，用紫外分光光度 计测定菌液的OD,。结果表明假丝酵母菌G70的生长pH范围为 3—10，最适为4-5。将活化后的假丝酵母菌G70按2%(*)的接种量转接至麦芽浸出
粉培养基，温度30。C，转速160rpm，摇床培养，12小时可至对数生 长期(见图2)。
实施例3:假丝酵母菌G70的26S rRNA基因的PCR扩增与序列 测定
取新鲜菌液lml， 12000rpm离心lmin，弃上清；向沉淀中加入 lOO[il GTE溶液(25 mmol/LTris隱HCl (pH8.0) ， 10 mmol/L EDTA， 50 mmol/L葡萄糖)在旋涡混合器上振荡混匀至沉淀彻底分散；再加入 650plGTE溶液，振荡混匀。接着悬液中加入7.5^1的100mg/ml的溶 菌酶至终浓度为lmg/ml，混匀，37'C温浴30min;然后再向悬液中加 入7.5^1的10mg/ml的蛋白酶K至终浓度为0.1mg/ml，混匀，55°C 温浴lh，中间轻缓颠倒离心管数次。温浴结束后向溶液中加入等体 积(750^1)的苯酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心5min; 将上清移至新的离心管中，然后再用苯酚/氯仿/异戊醇溶液抽提一次； 取上清至新的离心管中(约500pl)，加入1/10体积的3M的NaAc (pH5.2)，混匀，加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20"静置30min 沉淀DNA，取出，4°C、 12000rpm离心10min;小心弃去上清液，用 lml的70%乙醇洗涤沉淀，4°C、 12000rpm离心5min，弃上清，将沉 淀放入55。C烘箱中数分钟除去乙醇；然后用5(^1含RNaseA (终浓 度50^g/ml)的TE (pH8.0)溶解，37。C温浴30min，除去RNA;即 可获得用于PCR的基因组DNA。扩增26S rRNA基因的一对通用引物如下
正向(NL1): 5，-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3， 反向(NL4): 5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3， 上述引物根据酿酒酵母(fecc/wramycas cewWw^) 26S rRNA 基因序列做位置参照点(O'Donnell K. "The Fungal Holomorph: Mitotic, Meiotic and Pleomorphic Speciation in Fungal Systematics," 1993, 225-233, CAB International, Wallingford， UK)。 PCR反应体系 (50 pi)为10xbuffer (Mg2+free) 5^1， Mg2+ (25mM) 3^1， IO^iM 引物各lpl， dNTP (lOmM) 0.5^1，模板DNA (50ng/pl) 1^1， Taq 酶(5U/pl) 0.5^1， MiliQ水38(il。 PCR反应条件为94。C预变性 5min; 94。C变性60s、 52。C退火45s、 72。C延伸75s; 35个循环后 72"C延伸5min。 PCR产物纯化与序列测定由北京诺赛基因组研究 中心有限公司完成。完成测定的26S rRNA基因部分片断有效长度 为538bp，与菌株OwG /c/a Afl/wwea"gem/s NBRC 1019677的26S rRNA序列相似性大于99.2%，。假丝酵母菌G70 CGMCC No. 3000 的26S rRNA序列如Seq ID No.l所示。
实施例4、假丝酵母菌G70弱碱化处理榨菜废水效果^E
按照实施例2的方法，用麦芽浸出粉体培养基将假丝酵母菌G70 培养至对数期，按照10%的接种量(v/v)转接到过滤除菌的榨菜废 水中进行适应性培养，温度30。C，转速160rpm，摇床培养18h。将 适应性培养好的假丝酵母菌G70按照2%的接种量(vAO转接到装有300ml过滤除菌搾菜废水中的锥形瓶中，温度30。C，转速160rpm， 摇床培养24h;设置两份空白对照，对照1所用样品为过滤除菌后的 搾菜废水，对照2所用样品为未过滤除菌的榨菜废水。实验结果表明， 摇床培养条件下，假丝酵母菌G70可在24h内使榨菜废水pH上升至 7.7左右，COD去除率为25-30%;对照样的pH和COD几乎没变化。
上述搾菜废水pH4.5，盐度3.5% (以NaCl计)。
实施例5、 SBR工艺下用假丝酵母菌G70弱碱化处理榨菜废水
按照实施例4的方法，将适应性培养好的假丝酵母菌G70按照 2%的接种量(v/v)转接到榨菜废水中进行扩大培养，温度3(TC，转 速160rpm，摇床培养18h;将扩大培养好的假丝酵母菌G70按照5% 的接种量(v/v)投加到有效容积为4L的自制SBR反应装置中，进 行闷曝处理，至废水pH上升到7左右，污泥沉降比为15%，完成污 泥培养。污泥培养完成后，启动SBR反应装置， 一个处理周期为18h， 包括进水0.5h，曝气反应14h，沉淀lh，出水0.5h，闲置2h;每次 出水排水量为有效容积的85% (3.6L)，保持污泥沉降比在15%。连 续运行两周，出水pH为6.7-7.3， COD去除率为30-35%。
上述榨菜废水pH4.5，盐度3.5% (以NaCl计)，环境温度为 23-30°C。实施例6、 SBR工艺下用假丝酵母菌G70弱碱化处理笋干腌制废水
按照实施例5的方法，将扩大培养好的假丝酵母菌G70投加到 有效容积为4L的自制SBR反应装置中，对笋干腌制废水进行弱碱化 处理， 一个处理周期为16h，包括进水0.5h，曝气反应14h，沉淀lh， 出水0.5h;每次出水排水量为有效容积的85% (3.6L)，保持污泥沉 降比在15%。连续运行两周，出水pH为7-7.5， COD去除率为35-45%。
上述笋干腌制废水pH为5-5.5，盐度2.8% (以NaCl计)，环境 28-33 。C。
实施例7、连续进水条件下用假丝酵母菌G70弱碱化处理榨菜废水
按照实施例5的方法，将扩大培养好的假丝酵母菌G70按照1% 的接种量(v/v)投加到有效容积为10立方的好氧处理池中，进行闷 曝处理，至废水pH上升到7左右，污泥沉降比为15%，完成污泥培 养。污泥培养完成后，开始连续进水处理，水力停留时间为16h，污 泥龄为14d。连续检测一个月，进水pH为3.5-5，盐度为3-4% (以 NaCl计)；出水pH为6.7-8,COD去除率为30-35%;环境温度25-35°C 。序列表
<110>浙江大学
<120> —种酵母菌及其在蔬菜腌制废水弱碱化处理中的应用
<160> 1
<170> Patentln version 3.3
<210〉 1
<211> 538
<212> DNA
<213> Cawcfe/a//wf/wmeflr"gem7、 <400> Seq ID No.l
GCGGCGAGTGAAGCGGCAAGAGCTCAGATTTGAMTCGTGTTTCGGCACGAGTTGTAGAG60
TGTAGGCGGGAGTGTCTGCGGCGGGCAGTGTCCMGTCCCTTGGAACAGGGCGCCACTGA120
GGGTGAGAGCCCCGTGGGACGCTGCGCAAAGCTTTGAGACCCTGCTGACGAGTCGAGTTG180
TTTGGGMTGCAGCTCCAAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATACTGGCGAGAG240
ACCGATAGCGAACMGTACTGTGAAGGAAAGATGA嵐GCACTTTGAAAAGAGAGTGAAA300
CAGCACGTGAAATTGTTGMAGGGAAGGGTATTGGGCCCGACATGGGGAGTGCGCACCGT360
TGCCTCTTGTAGGCGGCGCTCTGGGCGCTCTCTGGGCCAGCATCGGTTCTTGCTGCAGGA420
GAAGGGGTGCCGGAACGTGGCTCTTCGGAGTGTTACAGCCGGCGCCAGATGCTGCGTGCG480
GGGGACCGAGGGCTGCGACTTATGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCC538
权利要求
1、一种假丝酵母菌G70(Candida thaimueangensis)，菌种保藏编号为CGMCC No.3000。
2、 根据权利要求1所述的假丝酵母菌G70(Om&^ ^n7m^a"gm^)，其特征在于所述假丝酵母菌G70(Ow^'fib f/2az,附we朋gem/力的26S rRNA序列如S叫ID NO.l所示。
3、 一种使用权利要求1所述的假丝酵母菌G70(C朋A^ ^^7m^朋gera/力对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理的方法，包括以 下步骤1) 将假丝酵母菌G70接种于液体发酵培养基中进行活化培养；2) 将活化培养好的假丝酵母菌G70按1-10% (Wv)的接种量转接到蔬菜腌制废水中进行扩大培养；3) 将扩大培养好的假丝酵母菌G70按照1-10% (v/v)的接种量 投加到蔬菜腌制废水处理池中，闷曝培养，至废水pH上升到7.0-8.0， 污泥沉降比为10-20°/。，完成污泥培养；4) 根据实际工艺设计以连续进水或间歇进水方式对蔬菜腌制废 水进行好氧处理，完成对废水的弱碱化处理。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤l) 中的液体发酵培养基为麦芽浸出粉液体培养基。
5、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤l) 中培养条件为在25-3(TC培养18-24h。
6、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤2)中可先将活化培养好的假丝酵母菌G70按1-10。/。 (v/v)的接种量 转接到蔬菜腌制废水中在25-30。C进行适应性培养12-18h，再将适 应性培养好的假丝酵母菌070按1-10% (v/v)的接种量转接到蔬菜腌制废水进行扩大培养。
7、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤2) 中的扩大培养条件为在25-30'C培养12-24h。
8、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤2) 中，扩大培养可根据实际需要进行多次重复，直至液体培养的假 丝酵母菌G70满足用量要求。
9、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述步骤3) 中假丝酵母菌G70按照1-10% (v/v)的接种量可一次性投加完成， 也可在一定时间内分批投加完成。
10、 根据权利要求3-9任一项所述的方法，其特征在于所述 方法中蔬菜腌制废水的pH范围为3.0-7.0，盐浓度以NaCl计不大 于10%。
全文摘要
本发明提供了一株保藏编号为CGMCC No.3000，能对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理的假丝酵母菌G70(Candida thaimueangensis)及利用该菌株对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理的方法。假丝酵母菌G70(CGMCC No.3000)是一株盐度耐受能力强，pH生长范围广的菌株，该菌株可在较短的时间内使蔬菜腌制废水的pH由酸性上升至弱碱性并去除废水的部分COD，极大地降低了蔬菜腌制废水的处理成本；其培养方法简单，生长速度快，易沉降，可用于对蔬菜腌制废水进行弱碱化处理。该菌株在蔬菜腌制废水处理方面具有较好的应用前景。
文档编号C02F3/02GK101586084SQ200910098538
公开日2009年11月25日 申请日期2009年5月14日 优先权日2009年5月14日
发明者敏 吴, 勇 张, 刚 郑 申请人:浙江大学