专利名称：一种漆酶及其制备方法与专用生产菌株的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及微生物酶学领域，特别涉及一种漆酶及其制备方法与专用生产菌株。
背景技术：
漆醇(p-diphenol oxygen oxidoreductase, EC 1. 10. 3. 2.)是一禾中蓝色、含有多 个铜离子的酚氧化酶，能催化酚类物质的氧化还原反应。漆酶氧化的底物包括酚类及其衍 生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物等。目前通过不断研究，漆酶可氧化的非酚底 物范围还在不断扩大。漆酶(laccase)可降解木质素中的酚类和非酚类结构，在木质素的 生物降解中发挥着重要的作用；另外，由于木质素中的许多化学键普遍存在于芳香族化合 物中，而漆酶对木质素的降解又是氧化性的和非特异性的，这就使得漆酶也能降解芳香族 化合物。漆酶能把分子氧直接还原为水，在没有H2O2存在下，可催化有机污染物的氧化。漆 酶又能使木素类多酚物质以游离基方式进行氧化聚合，替代传统木材工业合成树脂胶粘剂 或其它化学品，用无污染、低能耗的酶学的方法取代污染严重的化学方法，把污染消除在源 头。因此，漆酶在生物技术和环境保护方面有着巨大的应用潜力。白腐菌能够产生漆酶、木质素过氧化物酶(LiP)和锰氧化物酶(MnP)等，是目前能 够将木质素彻底降解为二氧化碳和水的唯一生物。其产生的漆酶比木质素过氧化物酶和锰 过氧化物酶更具有热稳定性。因此，这一生物类群引起了世界生物学家的极大兴趣。白腐菌中的血红密孔菌被认为是研究漆酶的理想菌株。然而，现有已知的菌株其 漆酶活性较低。因此，漆酶的高产菌株的研究迫在眉睫。
发明内容
本发明的目的在于提供一种漆酶及其制备方法与专用生产菌株。本发明提供的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001，已于2009年03月 05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为中国北 京市朝阳区大屯路)，保藏号为CGMCC Na 2932。菌株MK2001是从海南腐木上分离，并且通过土豆汁培养基(PDA)筛选培养获得。 该菌是一种需氧菌，最适生长温度为30°C，发酵培养时分泌漆酶到培养基中。本发明的另一目的在于提供所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus) MK200ICGMCC Na 2932在制备漆酶中的应用。所述应用是将血红密孔菌(Pycnoporussanguineus) MK2001 CGMCC Na 2932 在有 氧及避光条件下发酵培养，发酵培养温度可为30 士 1°C。所述发酵培养用的发酵培养基包括碳源、氮源和无机组分。所述发酵培养基的碳源可包括但不限于以下一种或几种麦芽糖、蔗糖和葡萄糖， 所述碳源优选用麦芽糖。这三种糖作为碳源时菌株生长速度差别不大，但用麦芽糖作碳源 时，比蔗糖和葡萄糖作碳源时产生的漆酶活性高。所述发酵培养基的氮源可包括但不限于酒石酸铵；所述发酵培养基的无机组分包括硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钙和氯化钴。在实际应用中，还可加入营养成分如维生素B” B2, B6等。在培养基中加入小麦麸 皮，漆酶产量可以提高2-3倍。加入玉米粉，漆酶的产量会进一步得到提高。所述IL发酵培养基具体由下列物质组成，麦芽糖10-20g;酒石酸铵l_3g， KH2PO4 1. 32-1. 34g ；NaH2PO4 ‘ 12H20 0. 38-0. 4g ；MgSO4 ‘ 7H20 0. 4-0. 6g ；琥珀酸钠 (CH2COONa)2 · 6H20 1. 17-1. 19g ；FeSO4 · 7H20 0. 0314-0. 0316g ；CaCl2 · 2H20 0. 09-0. Ilg ； MnSO4 · H2O 0. 034-0. 036g ；CH3COONa · 3H20 0. 407-0. 409g ；CoCl2 · 6H20 0. 05-0. 07g ； ZnSO4 ·7Η20 0. 027-0. 029g ；CuSO4 ·5Η20 :0· 167-0. 169g ；小麦麸皮 7-8 克；玉米粉24_26g ； Tween—80 0.9-1.Iml ；VitaminBl 9. 5-10. 5 μ g ；VitaminB24. 5-5. 5 μ g；VitaminB6 4. 5-5. 5 μ g，其余为水。
所述发酵培养第3-5天向发酵培养基中加入2，5- 二甲基苯胺，所述2，5- 二甲基 苯胺的终浓度为10 μ M。发酵培养完成后，可用常规分离方法从培养基中分离出漆酶，包括以下步骤离心 分离、超滤浓缩、硫酸铵分级沉淀、离子交换柱、凝胶过滤柱和冷冻分离干燥技术。通过这些 步骤可以去除大部分的杂蛋白和几乎全部的色素。发酵培养ΜΚ2001 CGMCC Na 2932得到的漆酶也属于本发明保护的范围。本发明的另一目的在于提供所述ΜΚ2001 CGMCC Na 2932在酚类及其衍生物、芳胺 及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物降解中的应用，在造纸制浆生物漂白和废水处理中的应 用，在木材加工替代化学胶合剂中的应用，在染料降解中的应用或在土壤修复中的应用。本发明的又一目的在于提供本发明的漆酶在酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、 芳香羧酸及其衍生物降解中的应用，在造纸制浆生物漂白和废水处理中的应用，在木材加 工替代化学胶合剂中的应用，在染料降解中的应用或在土壤修复中的应用。本发明提供的漆酶制备方法简单方便，本发明所提供的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)ΜΚ2001 CGMCC Na 2932经发酵培养，得到的漆酶酶活可高达300U/ml。该漆酶 可广泛应用于酚类、芳胺、芳香羧酸及其衍生物的生物降解中；还可应用在造纸制浆生物漂 白、土壤修复、废水处理和染料降解中，并且还可以在木材加工中替代化学胶合剂。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例1、发酵培养血红密孔菌MK2001制备漆酶一、发酵培养血红密孔菌MK2001固体种子培养基含2g/100ml琼脂的麦芽汁培养基平板。发酵培养基麦芽糖15g，酒石酸铵 2g，KH2PO4 1. 33g，NaH2PO4 · 12H20 0. 39g， MgSO4 · 7H20 0. 5g,琥珀酸钠(CH2COONa) 2 · 6H20 1. 18g，FeSO4 · 7H20 0. 0315g, CaCl2 · 2H200. lg, MnSO4 · H2O 0. 035g, CH3COONa · 3H20 0. 408g, CoCl2 · 6H20 0. 06g, ZnSO4 · 7H20 0. 028g, CuSO4 · 5H20 0. 168g,小麦麸皮 7. 5g,玉米粉 25g, Tween-80 lml, VitaminB1 10 μ g, VitaminB2 5 μ g，VitaminB6 5 μ g，加水至 1L，然后经 8 磅高压湿热灭菌 30分钟。将MK2001接种至固体种子培养基，在30°C下培养6-8天。取菌落最边沿的菌块(直径lcm，10块)，接种到500ml三角瓶内的经高压湿热灭菌过的IOOml发酵 培养基上，在30°C和240rpm下摇床中暗培养，第四天加入诱导物2，5 二甲基苯胺(2， 5-Dimethy lani line)，使之终浓度为10 μ M，培养12天。收集发酵液，按照下述方法测定漆 酶活性，培养得到的漆酶活性为300U/ml。本发明中漆酶活力的测定是用2，2’ -连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) (英文简称 ABTS) {2,2' -azino-bis-[3-ethylthiazoline-6-sulphonate]}来测定的。一 个酶活力单位U的定义在下述条件下，每分钟内催化1 μ M底物的酶量。酶活力的计算公式为U = Α· V/(ε · L · Τ) ·
在以上的公式中，A表示紫外分光光度计吸收值的变化，V表示反应体系的体积 (单位:mL)，ε = 3. 6 X IO4M · cnT1 = 36 ( μ mo 1/ml) · cnT1，为氧化型 ABTS 的摩尔消光系 数，L为比色皿的光径(单位cm)，T为反应的时间(单位分钟)。本发明中酶活力测定条件为反应体积V = ImL,比色皿的光径L = O. 5cm,反应时 间T = 30秒，反应温度为30°C。其中ImL反应体系内含有的500 μ L的50mM的酒石酸缓冲 液(pH = 4)，390 μ L的水，100 μ L的500 μ M的ABTS，10 μ L的发酵液，选用波长为420nm。 如果发酵液含有漆酶活力太高，可适当稀释。二、提取漆酶1、制备粗漆酶制剂将步骤二收集到的发酵液进行离心，除去发酵沉淀物，取上清液真空抽滤，获得抽 滤液，然后将抽滤液经PLGC膜(10000D)超滤，进行初步浓缩。随后采用两步硫酸铵沉淀法 沉淀，第一步用35g/100ml的饱和硫酸铵4°C搅拌沉淀，IOOOOrpm离心1小时，弃沉淀，留上 清；第二步用第一步所得的上清液加80g/100ml的饱和硫酸铵4°C温和搅拌沉淀，4°C静至 2小时以上，然后IOOOOrpm离心1小时，弃上清，留沉淀。将第二步得到的沉淀用两倍体积 的IOOmM磷酸钾缓冲液(pH 5. 7)溶解，然后进行透析，透析液为IOmM的磷酸钾缓冲液(pH 是 5. 7)。2、分离纯化漆酶取上述步骤二中1得到的经透析过的粗酶浓缩液用于离子交换柱层析。离子 交换介质选用DEAE Sepharose F. F.，缓冲液为20mM的组氨酸缓冲液(pH6. 0)，洗脱液 为0. 1-0. 6M NaCl的组氨酸洗脱液，流速为ImL/分钟。凝胶过滤层析介质选用S印hadex G-100,洗脱液为水，流速为0. 5mL/分钟，然后将含漆酶的洗脱液冷冻干燥浓缩得漆 酶，-20°C低温保存。实施例2、菌株MK2001对水稻秸秆进行木质素降解预处理实验250ml三角瓶酶解作用体系包括漆酶1800U，水稻秸秆0. 4g，0. IM酒石酸缓冲液 15ml (pH4. 0)，补充无菌水至20mL。预处理温度为30°C，摇床转速150rpm/min，处理时间分 别为24小时、48小时、72小时。木质素测定方法为范氏法，实验重复3次，处理结果24小 时木质素降解33. 9%,48小时木质素降解了 54. 5%,72h小时木质素降解了 56. 3%。此实施例对水稻秸秆进行木质素降解预处理实验，实验结果表明MK2001漆酶可 有效降解水稻秸秆中木质素成分。所述菌株MK2001产生的漆酶用于纤维素乙醇工艺中农 作物秸秆的生物预处理，降解木质素组分，提高纤维素的利用率，达到生产纤维素乙醇的目 的。
实施例3、菌株MK2001对多环芳烃中的蒽和苯并[a]芘两类化合物降解处理实验分别取酶液各4. 5ml置于15ml具塞棕色试剂瓶中，加入0. 5ml蒽和苯并[a]芘的乙腈溶液，使反应体系的乙腈含量达到10% (体积百分比)，拧紧瓶塞，摇勻，置于暗室培养 24h(28°C)，然后加入5ml乙腈终止反应，此时乙腈含量为55% (体积百分比)。振荡Ih后 (28°C,15000rpm)高速离心，过0. 22 μ m滤膜，采用HPLC进行样品测定。对照用纯水代替酶 液，其它步骤相同。同时利用Trametesversicolor来源的漆酶(漆酶(Tv))作为一组处理 对照。本发明提供的P. sanguineus漆酶与漆酶(Ps)等同。实验作用体系为l)lmg/L蒽+lmg/L苯并[a]芘；2) lmg/L蒽+lmg/L苯并[a] 芘 +ZUmr1 漆酶(Ps) ；3) lmg/L 蒽 +lmg/L 苯并[a]芘 +ZUmr1 漆酶(Ps)+ImMABTS ；4) Img/ L 蒽 +lmg/L 苯并[a]芘 +ZUmr1 漆酶(Tv) ；5) lmg/L 蒽 +lmg/L 苯并[a]芘 +ZUmr1 漆 酶(Tv)+ImM ABTS。实验重复3次，实验结果表明在未添加ABTS时，酶活为ZUml—1的 P. sanguineusMK2001漆酶对lmg/L蒽和苯并[a]芘的降解率分别为16. 6%和6. 0%，显著 大于T. versicolor漆酶的2. 和0. 1%。当添加ImM ABTS时，P. sanguineus漆酶对蒽和 苯并[a]芘降解率显著增加，达到19. 8%和34. 4%，显著大于T. versicolor漆酶的7. 0% 和 27. 0%。实验结果表明不管是否存在ABTS，P. sanguineus漆酶与Τ. versicolor漆酶对蒽 和苯并[a]芘的降解效果相比，P. sanguineus漆酶具有更为强大的氧化能力；ABTS是漆酶 的底物又是提高漆酶氧化能力的调节物质，其存在可大大增加漆酶的转化效率。因此，菌株MK2001产生的漆酶可以用于整治废水和污染土壤，修复被多环芳烃、 联氯苯酚等污染物的污染。
权利要求
血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC № 2932。
2.权利要求1 所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC Na 2932 在制备漆酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用是将所述血红密孔菌 (Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC Na 2932 在有氧及避光条件下发酵培养。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养用的发酵培养基包括碳源、 氮源和无机组分。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述发酵培养基的碳源包括下述至少一 种物质麦芽糖、蔗糖和葡萄糖，优选为麦芽糖；所述发酵培养基的氮源包括酒石酸铵；所 述发酵培养基的无机组分包括硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硫酸铜、氯化钙和氯化 钴。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述IL发酵培养基由下列物质组 成，麦芽糖:10-20g ；酒石酸铵:l-3g, KH2PO4 1. 32-1. 34g ；NaH2PO4 · 12Η20 :0· 38-0. 4g ； MgSO4 · 7Η20 :0· 4-0. 6g ；琥珀酸钠(CH2COONa)2 ‘ 6H20 1. 17-1. 19g ；FeSO4 ‘ 7H20 0. 0314-0. 0316g ；CaCl2 · 2H20 0. 09-0. Ilg ；MnSO4 · H2O 0. 034-0. 036g ；CH3COONa · 3H20 0. 407-0. 409g ；CoCl2 · 6H20 0. 05-0. 07g ；ZnSO4 · 7H20 0. 027-0. 029g ；CuSO4 · 5H20 0. 167-0. 169g ；小麦麸皮 7-8 克；玉米粉24_26g ；Tween-80 0. 9-1. Iml ；VitaminB1 9. 5-10. 5μ g ；VitaminB2 4. 5-5. 5μ g ；VitaminB6 4. 5-5. 5 μ g,其余为水。
7.根据权利要求2-6任一所述的应用，其特征在于所述发酵培养第3-5天向发酵培 养基中加入2，5- 二甲基苯胺，所述2，5- 二甲基苯胺的终浓度为10 μ Μ。
8.—种漆酶，是发酵培养血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCCNa 2932 得到的。
9.权利要求1 所述血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus) MK2001 CGMCC Na 2932 在酚 类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物降解中的应用，在造纸制浆生物漂白 和废水处理中的应用，在木材加工替代化学胶合剂中的应用，在燃料降解中的应用或在土 壤修复中的应用。
10.权利要求8所述漆酶在酚类及其衍生物、芳胺及其衍生物、芳香羧酸及其衍生物降 解中的应用，在造纸制浆生物漂白和废水处理中的应用，在木材加工替代化学胶合剂中的 应用，在燃料降解中的应用或在土壤修复中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种漆酶及其生产方法与专用生产菌株，涉及微生物发酵工业领域。本发明所提供的菌株为血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001 CGMCC №2932。本发明所提供的漆酶，是发酵血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001CGMCC № 2932得到的。本发明所提供的血红密孔菌(Pycnoporus sanguineus)MK2001CGMCC № 2932经发酵培养，得到的发酵液漆酶酶活高达300U/ml，该漆酶可广泛应用于酚类、芳胺、芳香羧酸及其衍生物的生物降解，造纸制浆生物漂白、废水处理和染料降解中，并且还可以在木材加工中替代化学胶合剂。
文档编号B09C1/10GK101880632SQ20091008351
公开日2010年11月10日 申请日期2009年5月8日 优先权日2009年5月8日
发明者李伟, 郭林 申请人:中国科学院微生物研究所