专利名称：一株胶红酵母菌及其在降解丁草胺中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于生物修复技术领域，涉及一株胶红酵母菌及其在降解除草剂丁草胺中 的应用。
背景技术：
丁草胺(C17H26ClNO2)是一种高效内吸传导型酰胺类芽前除草剂，主要用于防除水 稻田稗草和旱田中的禾本科杂草，具有用量少、活性高，选择性强等特性，在我国广为生产 和应用，同时它在水体及土壤中的残留所引起的环境污染问题也将日趋严重。一方面，丁草 胺随水纵、横向淋溶与扩散，特别是随排灌水和降水流失，会造成地下水及江河污染；另一 方面，丁草胺对藻类、光合细菌、固氮细菌等许多微生物的生长有抑制作用，从而破坏了土 壤微生态平衡(Zager，1990 ；Lee, 1991)；再者，丁草胺对淡水鱼类和两栖动物的毒性很大 (Bushra et al,2002 ；卜宁等，2005 ；耿宝荣等，2005)；另外，丁草胺具有致突变性和遗传毒 性，通过食物链和生物富集等将毒性逐级传递，最终影响人类健康(Ou et al,2000 ；Wang et al，1987)。目前减轻甚至解除丁草胺在土壤中污染的途径主要靠光解和微生物降解(王一 茹等，1996)。与光解相比，微生物代谢在除草剂降解中具有针对性强、周期短、见效快的优 势。因此寻找丁草胺的高效降解菌株，对于丁草胺环境污染的生物修复具有重要的现实意 义。目前能够降解丁草胺的微生物资源以细菌居多，具代表性的有假单胞菌、芽孢杆菌，而 丝状真菌较少，酵母菌则更为少见。
发明内容
本发明的目的在于提供一株可有效降解丁草胺并能用于丁草胺污染水土治理的 胶红酵母菌。本发明的另一目的是提供一种由上述胶红酵母菌所制备的菌剂。本发明的目的是通过如下技术方案实现的本发明所提供的丁草胺降解菌株是胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa) Y-LCY-I，已于2009年09月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC) ”，其保藏号为CGMCCNo. 3270。地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生 物研究所，邮政编码100101。本发明所提供的胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)Y-LCY-1的菌剂，是由 此菌种与必要添加成分混合制得。上述的胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)Y-LCY-1在降解丁草胺中的应 用，特征在于该菌株可耐高浓度丁草胺生长，最高耐受浓度达IOOOmg · Γ1,当接种量为 5%, pH 6. 5，25°C时，在含IOOmg · L—1的丁草胺无机盐基础培养液中培养7天后，对丁草胺 降解率高达97. 6%，且对50 500mg · Γ1的丁草胺均具有良好的降解效果。本发明提供的菌株，丰富了丁草胺降解菌株的多样性，为解决丁草胺的残留污染问题提供了重要菌株资源，可应用于受丁草胺污染的水体及土壤的净化。所述的胶红酵母菌(Rhodotorulamucilaginose) Y-LCY-I,已于 2OO9 年 O9 月14日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为 CGMCCNo. 3270。
图1胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginose)Y-LCY-1在以丁草胺为唯一碳源及 能源，于25°C、pH为6. 5的条件下，对IOOmg · L—1 丁草胺连续7天的降解曲线图。图2胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginose) Y-LCY-1在以丁草胺为唯一碳源及 能源，于25°C、pH为6. 5的条件下，对不同浓度丁草胺连续7天的降解曲线图。
具体实施例方式实例1、胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginose) Y-LCY-1 CGMCCNo. 3270 的分离、
纯化及鉴定本发明提供的胶红酵母菌(Rhodotorulamucilaginose) Y-LCY-1 CGMCCNo. 3270， 是从哈尔滨郊区长期施用丁草胺的稻田土壤中分离筛选的，其具体分离和纯化过程如下取土样10g，置于50mL 丁草胺浓度为IOOmg · L—1基础无机盐培养液中，于28°C， 160rpm恒温摇床上培养，然后每隔一周以10 %的接种量接入新鲜的丁草胺无机盐培养液 中，并逐渐提高丁草胺用量，至培养液中丁草胺浓度达到IOOOmg ·厂1，如此驯化约三个月。 然后在丁草胺基础无机盐琼脂平板上用稀释涂布法分离，置于28°C培养3 5天，传代稳定 的菌落，纯化3 4次后得到纯菌株，将得到的纯化降解菌株分别回接于丁草胺基础培养液 中，验证其降解能力，通过气相色谱检测丁草胺的残留量，最终筛选出一株丁草胺高效降解 菌，转接于丁草胺麦氏琼脂斜面培养基中，培养48h后，置于4°C冰箱保存。所述的无机盐培养液是按下述比例配制的=K2HPO4 0. lg, MgSO4 · 7Η20 0. 2g， FeSO4 · 7H20 0. OOlg, (NH4)2SO4 0. lg, CaSO4 0. 04g 加入蒸馏水至 IOOOmL, pH 调至 6. 5。高 压蒸汽灭菌(121°C，20min)。所述的丁草胺基础无机盐琼脂培养基丁草胺浓度为500mg · Γ1的无机盐培液添 加1. 5 2% (W/V)的琼脂。所述的麦氏琼脂培养基是按下述比例配制的葡萄糖l.Og，KCl 1.8g，酵母膏 2. 5g，醋酸钠 8. 2g，蒸馏水 IOOOmL, pH 调至 6. 5，115°C灭菌 20min。所用的气相色谱检测条件为GC_14C型气相色谱仪，FID检测器；色谱柱为内涂 14%0V-1701大口径毛细管柱(30mX 0.53mm i. d.)；温度条件进样口 250°C，柱温225°C， 检测器250°C ；气体流量氮气lOOkpa，氢气50kpa，空气50kpa，尾吹IOOkpa ；不分流进样， 保留时间为3.9min。进样量1 μ L。根据样品定容体积和稀释倍数以及样品色谱峰和标样色谱峰的峰面积，利用外标 法计算培养液中丁草胺的浓度。计算公式CK=NX-^X-|^XCo
Vx ^o式中CX 培养液中丁草胺的浓度(mg ^lN:样品稀释倍数V。标样进样量(μ L)Vx 样品进样量(μ Sx 样品色谱峰峰面积S。标样色谱峰峰面积C。标样浓度mg · L—1)根据不接菌处理中丁草胺的浓度和接菌处理中丁草胺的浓度计算丁草胺的降解 率。计算公式 式中Χ% 丁草胺的生物降解率Cx 接菌处理培养液中丁草胺的浓度(mg · Γ1) Cck 未接菌对照培养液中丁草胺的浓度(mg · Γ1)分离得到的丁草胺降解菌株的形态特征和生长特点在麦氏琼脂培养基上，28°C 条件下培养3天，菌落特征为菌落圆形，表面凸起，边缘整齐，不透明，湿润，粘稠，橙红色。 菌株个体卵形或球形，大小为2. 0 5. 0 μ m，单一、成对，不形成子囊孢子或担孢子，在麦芽 汁上产生红色类胡萝卜素。最适生长温度为28°C，最适pH为6.5，可在4°C条件下生长。分离得到的丁草胺降解菌株部分生理生化特征如表1所示表1 丁草胺降解菌株Y-LCY-I生理生化特征 注+ 阳性_ 阴性ν 可变通过扩增该菌株的26Sr DNA D1/D2，得到长度573bp的26SrDNA D1/D2序列。提 交此序列，已由Genebank接收，登录号为FJ874772。通过Blast软件对Genebank上的其他 序列进行同源性比对，发现该序列与胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginose)部分模式菌 株的同源性高达100%。综合形态学特征观察、生理生化试验及26Sr DNA D1/D2序列分析结果可确定该菌 株为胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginose)，将其命名为Y-LCY-1。实例2 胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginose) Y-LCY-1 CGMCCNo. 3270 菌剂的 制备菌剂的具体制作工艺为将斜面培养基中保藏的菌种接种于含有IOOmg -L"1 丁草胺的无机盐培养基中活化 12h，然后将菌液(0D_= 1.0)按10% (V/V)的接种量转入装有150mL的YEPD液体培养基 的三角瓶中，培养基中丁草胺初始浓度为50mg化―1，封口膜封口，置于28°C恒温振荡培养箱 中以160rpm频率振荡培养3天，而后取出1/4培养液，再补加相同量的培养液，使培养基中 丁草胺胺初始浓度达到50mg · L—1，继续于恒温箱中培养3天，即为菌剂。获得的液体菌剂 可存放于密封无菌袋中，易于推广使用。
所述的YEPD液体培养基成分为酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加重蒸馏水 至 IOOOmL, pH 调至 6. 5，115°C湿热灭菌 20min。实例3 胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginose) Y-LCY-1 CGMCCNo. 3270 对丁草 胺的生物降解(1)胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginose)Y-LCY-1 CGMCCNo. 3270 对 IOOmg · Γ1 丁草胺降解能力的测定菌悬液制备无菌条件下挑取一环Y-LCY-I斜面保藏菌种，转接到麦氏培养基中， 置于28°C，160rpm恒温摇床振荡培养至最适菌龄，取一定量培养液，4000rpm离心lOmin，弃 上清，用0. 2mol · L—1磷酸缓冲液(pH = 7)洗涤去除菌体携带的营养物质(共3次)，收集 菌体，用缓冲液调菌体浓度，用分光光度计测定600nm下的吸光值OD6tltlnm,使OD6tltlnm在2. 0左 右ο按5%的接种量，将上述菌悬液接种于丁草胺基础无机盐培养基中，于pH 6.5， 25°C条件下，在160rpm恒温摇床振荡培养，丁草胺初始浓为IOOmg · L—1，培养1，2，3，4，5， 6，7天，分别定量取样21mL，加入少许无水硫酸钠，用重蒸石油醚10mL、5mL、5mL振荡萃取3 次，石油醚层经无水硫酸钠柱过滤，合并有机相，于40°C旋转蒸发浓缩至近干，待冷却至室 温，用丙酮定容至7mL。用气相色谱(GC-14C)测定丁草胺的残留浓度，绘制降解曲线，以不 加菌液的培养基作对照。上述每个处理3次重复，结果如图1所示。图1表明，随培养时间 的延长胶红酵母Y-LCY-I对丁草胺的降解能力逐渐增强，在含IOOmg ·厂1的丁草胺无机盐 基础培养液中培养7天后，丁草胺降解率高达97.6%，而对照中7天后丁草胺自然降解率低 于15%，说明该菌株对丁草胺具有相当强的降解能力。(2)胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginose) Y-LCY-1 CGMCCNo. 3270对不同浓度 丁草胺的耐受和降解能力考查将Y-LCY-I菌悬液(OD6tltlnm = 2. 0)按5%的接种量接种于含有不同浓度的丁草胺≤的无机盐液体培养液中，丁草胺的浓度分别为50mg · L—1，IOOmg · L—1，200mg · L—1，300mg · L—1， 500mg · L_1,800mg · Λ IOOOmg · Λ 1200mg · Γ1，25°C，160rpm，振荡培养一周。结果发现， 除1200mg · Γ1菌株没有生长外，在其他待试培养基中都不同程度的发生增殖，培养液均变 混浊。当菌株于丁草胺浓度为IOOOmg -Γ1的情况下生长3 7天时，发现培养液颜色渐变 为粉红色。并且在此浓度下OD_达到0.7302。结果表明，该菌株可以丁草胺为唯一碳源生 长，而且能够很好的耐受高浓度丁草胺。将Y-LCY-I菌悬液(OD6tltlnm = 2. 0)按5%的接种量接种于含有不同浓度的丁草胺 的无机盐液体培养液中，丁草胺的浓度分别为50mg · L—1，IOOmg · L—1，200mg · L—1，300mg · L—1， 400mg ·ΙΛ500π^化―1，以不接菌液的培养基为对照，在25°C，pH为6. 5时，160rpm连续培养 一周菌株对不同浓度丁草胺降解情况如图2所示。由图2可见，胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginose) Y-LCY-I在低丁草胺浓度时(200mg · Γ1)，降解效果显著，降解率均超过50%;在高丁草胺浓度时(≥300!^·!^)，降解能力下降。由此可知，丁草胺浓度超过一定 限度时对菌株的代谢有一定的抑制作用。上述结果显示，胶红酵母菌(Rhodotorulamuci laginose) Y-LCY-I CGMCCNo. 3270 在液体培养基中对丁草胺降解效果良好，具有修复丁草胺污染水体及土壤的巨大潜力。
权利要求
一株胶红酵母菌(Rhodotorula mucilaginosa)Y-LCY-1，该菌株已于2009年09月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.3270。
2.一种含有权利要求书1所述的胶红酵母菌(Rhodotorula muci laginosa) Y-LCY-I的 菌剂。
3.如权利要求1所述的一株胶红酵母菌(Rhodotorulamucilaginosa)Y-LCY-1在降解 丁草胺中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株丁草胺降解菌及其应用；该丁草胺降解菌为胶红酵母(Rhodotorula mucilaginose)Y-LCY-1，已于2009年09月14日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.3270；该菌株对丁草胺耐受能力达1000mg·L-1，当接种量为5％，pH 6.5，25℃时，在含100mg·L-1的丁草胺无机盐基础培养液中培养7天后，对丁草胺降解率高达97.6％，且对50～500mg·L-1的丁草胺均具有良好的降解效果；本发明提供的菌株，可应用于受丁草胺污染的水体及土壤的生物净化。
文档编号B09C1/10GK101845401SQ20091007325
公开日2010年9月29日 申请日期2009年11月24日 优先权日2009年11月24日
发明者孙晶, 张美超, 徐春红, 成小松, 李春艳, 熊明华, 臧海莲 申请人:东北农业大学