专利名称：一株赤红球菌及其在降解烃类化合物中的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体地说，涉及一株赤红球菌 / / o&coccus ru6er P14其保藏编号为CGMCC NO. 2343，该菌能浮起于油类物质， 经增殖培养后可降解含烃类化合物的油类物质。
背景技术：
随着经济的发展，人类对能源的需求也不断扩大，各国都加快了对油气资源的开 发利用，从沙漠到海洋、从无人区到人口稠密区，越来越多的油气井出现在全球各地。 石油是由上千种化学性质不同的物质组成的复杂混合物，主要包括饱和烃、芳香烃类 化合物、沥青质、树脂类等。石油的开采、冶炼、使用和运输过程的污染和遗漏事故， 以及含油废水的排放、污水灌溉，各种石油制品的挥发、不完全燃烧物飘落等引起一 系列石油污染问题。
石油及石油产品对水体的污染主要有海洋、江河湖泊、地下水污染。如在水面形 成油膜，阻碍了水体与大气之间的气体交换，油类粘附在鱼类、藻类和浮游生物上， 致使海洋生物死亡，并破坏海鸟生活环境，导致海鸟死亡和种群数量下降。石油污染 还会使水产品品质下降，造成经济损失。河流湖泊水体污染主要是受炼制石油产生的 废水以及石油产品造成的。在炼油工业中，有大量含油废水排出，由于排放量大，常 超出水体的自净能力，易形成油污染。另外，油轮洗舱水以及船舶在水域中航行时所 产生的主要污染物油污，也会对水域造成污染。这些污染使河流、湖泊水体以及底泥 的物理、化学性质或生物群落组成发生变化，从而降低了水体的使用价值，甚至危害 到人的健康。
生物修复技术是20世纪80年代以来出现和发展的清除和治理环境污染的生物工 程技术，其主要利用生物特有的分解有毒有害物质的能力，去除污染环境如土壤中的 污染物，达到清除环境污染的目的。在该技术的萌芽阶段，主要应用于环境中石油烃污染的治理，并取得成功。实践结果表明生物修复技术是可行的、有效的和优越的，此 后该技术被不断扩大应用于环境中其他污染类型的治理。
虽然生物降解被誉为时既环保又彻底的油污清除方法，但是在实际操作中由于菌种 无法在污染现场有效发挥作用，而可操作行不强。主要原因如下首先是油类物质大多 比水轻，在污染地浮在水层表面，所泄漏油类物质会迅速扩散而导致污染区域扩大，这 给微生物降解油类污染物带来了非常大的影响。其次，在生物降解过程中，生物量由于 受水体稀释，导致有效作用的生物量减少，从而导致降解效率降低，同时也提高了修复 环境的成本。
红球菌是一类好氧、革兰氏阳性菌，由于这类菌能代谢多种有机污染物，如芳香烃 类，类固醇、氯化酚醛塑料、煤和石油等等。因此红球菌在环境生物修复方面具有广阔 的应用前景。现在红球菌已经应用于褐煤、高硫煤和石油的处理，降低重油的黏度和提 高石油的回收利用率等等。油类污染物中，对环境危害最大的是其中的烃类化合物类物 质，目前却较少有文献报道红球菌对烃类化合物、尤其是高分子量烃类化合物的降解作 用。
发明内容
本发明的目的在于针对石油污染对环境造成的危害，提供了一株赤红球菌 ^^c/ococcm sa ，该菌能降解烃类化合物，可用于治理石油污染的生物修复技术。该 菌具有浮起于油类物质的特性，能以油类物质作为唯一碳源生长。
本发明提供的赤红球菌i Aorfococcus印.，于2008年1月16日保藏于"中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心'，其保藏编号为CGMCCN0.2343，保藏单位地址 为北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
本发明的赤红球菌P14，在2216E平板上培养2天，菌落特征为菌落为圆形、干 燥、不透明，表面凸起，边缘整齐，颜色橙红；细胞形态特征幼龄细胞为杆状，菌体长 度差异较大，显示多态性，无规则排列，培养时间增长后变为球形，革兰氏染色阳性； 生理生化特征具有VP阳性，不产芽孢或孢子，氧化酶阴性，接触酶阴性，还原硝酸盐， 可利用下列物质作为碳源环糊精、D-果糖、D-甘露糖、糊精、D-洛酮糖、核糖、a-D-葡萄糖、D-阿拉伯糖、D-甘露醇、吐温40、吐温80、 L-乳酸、醋酸、丙酸、a-酮戊酸、 a-羟基丁酸、6-0-D吡喃葡萄糖酰、丙酮酸、Bfi-羟基丁酸、琥珀酸单甲基酯、丙酮酸甲 酯。本发明的平板及电镜照片分别如图l，图2所示。采用菌落PCR方法，直接取单菌落裂解液作为模板进行PCR。利用PCR扩增16S rDNA的引物为一对通用引物，27f: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， ， 1492R: 5，-GGTTACCTTGTTACGACT-3，。 PCR反应条件为:94°C 3min; 94°C 30s， 55°C 30s， 72 °C 2min， 30个循环；72°C 10min。将PCR扩增产物纯化后连接T载体(上海Sangon TA克隆试剂盒)，测序结果与Genbank上的序列进行Blast分析，序列长度为1500bp， 在Genbank中登录号为EF634456,本发明与赤红球菌具有很大的同源性；其16S rDNA 序列为
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将该序列与Genbank中序列进行比对，选取相似的菌株，用Flip软件构建系统 进化树，所构建的树状图如图4所示。
本发明的赤红球菌P14，能以油类物质为唯一碳源生长，其培养基的组成为 (NH4)2S04， l.Og; Na2HP04， 0.8 g; KH2P04， 0.2g; MgS04-7H20， 0.2g; CaCl2.2H20， O.lg; FeCl3.6H205mg; (NH4)6Mo7024'4H20， lmg;蒸馏水1000ml;油类40ml; pH7.0， 12rC灭菌30min。本发明的赤红球菌P14，能以多环芳烃为唯一碳源生长，其培养基的组成为
(NH4)2S04， l.Og; Na2HP04， 0.8 g; KH2P04， 0.2 g; MgS04-7H20， 0.2 g; CaCl2-2H20， 0.1 g; FeCl3'6H205mg; (NH4)6Mo7024'4H20， lmg;蒸馏水1000ml;多环芳烃50mg; pH7.0， 12rC灭菌30min。
本发明还提供赤红球菌P14在降解烃类化合物中应用，特别是在降解烃类中的多 环芳烃中的应用，本发明的菌株由于能降解烃类化合物特，因此能应用于在含油废 水的生物处理和/或石油污染土壤的生物修复。
本发明菌株可以在营养培养基，如2216E、 LB、普通牛肉汁中培养，也可以在以 油类物质如原油、柴油、石蜡为唯一碳源的基础培养基中生长，还可以在以多环芳烃 如菲、芘、苯并芘为唯一碳源的基础培养基中生长，菌株在25'C-35'C之间均可进行 好氧生长，最适生长温度为3(TC。
本发明菌株具有油类物质浮起的特性。在2216E培养基中培养菌株P14至0D为 0.8，收集菌体，用液体无机盐培养基洗涤三次后接种于含不同油类为碳源的无机盐 培养基的试管中，培养10天后，菌株P14可以浮起至油层、并迅速增殖，在无机盐 培养液和上层油类物质的临界面出现炮状隆起，同时上层油类物质出现桔红色(见图 5);水油界面菌体数量最多，底层的菌体数量最低(见图6)。此外，在含4%原油 的无机盐培养液接种P14菌株12h后，出现原油凝集现象；而对照组(4%原油+无 机盐培养液，未接种菌株)则没有变化(见图7)。
本发明菌株具有降解油类物质的特性。在2216E培养基中培养菌株P14至0D为 0.8，收集菌体，用液体无机盐培养基洗涤三次后接种至含不同油类为碳源的无机盐 培养基的三角瓶中(培养基的配方同实施例4) ， 30°C、摇床培养(150rpm)，分别 培养15天、30天。对照未接种的平行样，以石油醚萃取培养液，称重法测定剩余油 类物质的含量。菌株培养15天对柴油、石蜡的降解率分别为17.8%和25%。菌株30 天对柴油、石蜡的降解率分别为29.5%和22.5%。该菌对柴油、石蜡的降解率图分别 如图8、 4-2所示。
本发明菌株具有降解烃类化合物的能力。在2216E培养基中培养菌株P14至0D 为0.8，收集菌体，用液体无机盐培养基洗涤三次后接种至含不同多环芳烃为碳源的 无机盐培养基三角瓶中，3(TC摇床培养(150rpm)培养30天，通过HPLC分析多环芳 烃的降解率，结果如图5所示。图10结果表明，菌株P14经过30天的培养，对50mg/L菲的降解率可以达到43%;而对50mg/L的芘、苯并芘，经过30天的培养，降解率分 别可以达到34%、 30% (图ll、 5-3)。
图1为菌株朋w/ococcus r"6ar P14 CGMCC NO. 2343的平板生长情况图；及电镜 照片。
图2为本发明菌株P14电镜照片。 图3为本发明菌株P14的16S rDNA序列图。 图4为本发明菌株P14的系统进化树图。
图5为菌株y / ot/ococcws rWer P14 CGMCC NO. 2343浮起于油类物质实物图。其 中A:无机盐/石蜡/P14， B:无机盐/柴油/P14， C:无机盐/植物油，D:无机盐/植物 油/P14， E:无机盐/液体石蜡，F:无机盐/液体石蜡/金黄色葡萄球菌，G:无机盐/ 液体石蜡/P14。
图6为在含4%油(柴油或液体石蜡)的无机盐培养液中的菌株P14分布情况， 右图为采用液体石蜡培养菌株P14的情况，从试管上方向下方开始标注液面的深度为 1、 2、 5、 10cm。
图7为本发明菌株P14使原油凝集实物图，其中A、D、E培养基中接种菌株P14，
培养12h; B、 C未接种菌株。
图8为本发明菌株P14对柴油(4%)的降解，经过15天和30天增值培养后的该 菌对柴油的降解率。
图9本发明菌株对石蜡(4%)的降解，经过15天和30天增值培养后的该菌对石 蜡的降解率。
图10为本发明菌株P14经过30天的培养，对50mg/L的菲的降解率。 图11为本发明菌株P14经过30天的培养，对50mg/L的芘的降解率。 图12为本发明菌株P14经过30天的培养，对50mg/L的苯并芘的降解率。 具体的实施方式
为了更好地理解本发明，通过以下实施实例予以更好地说明，但并非对本发明的限定。
实施例h本发明提供的菌株处ot/ococcws ra6er P14 CGMCC N0. 2343的分离筛选
样品来自于厦门海域表层沉积物，称取5g海底淤泥，加50ml无菌水振荡2h，静 置30min后吸取上层清亮液体至富集培养基即无机盐加多环芳烃培养基中(培养基的组成(NH4)2S04， 1. 0g; Na2HP04， 0. 8 g; KH2P04， 0. 2 g; MgS04 7H20， 0. 2 g; CaCl2 2H20， 0.1 g; FeCl3 6H205mg; (NH4)6Mo7024 4H20， lmg;蒸馏水1000ml;多环芳烃50mg; pH 7. 0， 121。C灭菌30min)，培养15d后，转接1ml至含有50mg/l多环芳烃无机盐培 养液培养一周，转接至新鲜的含有50mg/l多环芳烃无机盐培养液。重复三次后，在
2216E培养基上划线分离，(培养基的组成为酵母浸膏lg;蛋白胨5g;磷酸高铁
O.Olg;陈海水1000ml; pH7.6-7.8， 12rC灭菌30min)挑取单菌落划线分离三次后， 将降解菌株用20%甘油冷冻保存。
得到的纯降解菌株接种于2216E液体培养基中培养至0D = 0. 8，离心收集菌体， 无机盐培养基洗涤三次去除残余2216E碳源对降解实验的影响，吸取等量菌液于无机 盐加多环芳烃培养基中，3(TC培养30天后，以二氯甲烷萃取培养液，HPLC方法检测 多环芳烃剩余含量。分离得到一株对多环芳烃，包括菲、芘、苯并芘均具有较高降解 率的菌株，即A%o^coccus r"Mer P14 CGMCC NO. 2343。
实施例2:本发明提供的菌株/P/ oofecocciA9 r"6er P14 CGMCC NO. 2343的16S rDNA 基因的PCR扩增和序列测定 采用菌落PCR方法，直接取单菌落裂解液作为模板进行PCR。扩增16S rDNA的 PCR引物为 一 对通用引物，27f : 5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3， ， 1492R : 5， 一 GGTTACCTTGTTACGACT — 3'。 PCR反应条件为94。C 3min ; 94°C 30s， 55°C 30s， 72 °C 2min， 30个循环；72°C 10min。将PCR扩增产物纯化后连接T载体(上海Sangon TA克隆试剂盒)，送上海英骏生物技术有限公司测序。测序结果与Genbank上的序 列进行Blast分析。序列长度约为1500bp，在Genbank中登录号为EF634456,本发 明菌株与赤红球菌具有很大的同源性。
实施例3:本发明提供的菌株欣odococc"s r"6er P14 CGMCC NO. 2343浮起于油类物 质的特性
在2216E培养基中培养/ 力oc/ococc^ rWer P14 CGMCC NO. 2343至0D为0. 8,收 集菌体，用MSM洗涤三次后接种至含4%灭菌过的柴油或者石蜡的50ml无机盐培养液 中(一批培养液置于长12cm，直径4.5cm的试管中，另一批置于150ml三角瓶中)， 3CTC、 150rpm培养10天。对照未接种的平行样，观察培养基表层浮起的油类物质的 变化，对于试管培养样品，静置过夜后吸取各层培养液10ul梯度稀释为10—3、 10"、 10—9，取50pl各个稀释液涂布培养于2216E平板。3(TC培养48h后计数菌落数量。
9实施例4:本发明提供的菌株朋w/ococc"s rWer P14 CGMCC NO. 2343对油类物质的 降解
在2216E培养基中培养飾dococ面/7;6er P14 CGMCC NO. 2343至0D为0. 8，收 集菌体，用液体无机盐培养基洗涤三次后接种至含不同油类为碳源的无机盐培养基的 三角瓶中(培养基的配方同实施例4) ， 30°C、摇床培养(150rpm)培养10天。对照 未接种的平行样，以石油醚萃取培养液，称重法测定剩余油类物质的含量；结果如图 4所示。图8表明，菌株15天、30天对柴油的降解率分别为17.8%、 22.5%;图9表 明，菌株15天、30天对石蜡的降解率分别为25%、 29.5%;
实施例5:本发明提供的菌株朋oc/ococciAs ra6er P14 CGMCC N0. 2343对多环芳烃的 降解作用
取本发明菌株的新鲜斜面菌种，用接种环接种于2216E液体培养基中培养至 0D0.8,离心收集菌体，无机盐培养基洗涤三次去除残余2216E碳源对降解实验的影 响，吸取等量菌液于装有20ml含不同芳香烃为碳源的无机盐培养基三角瓶中，3(TC 摇床培养(150rpm)培养30天，测定菌的生长量(LgCFU/ml)和多环芳烃的降解(HPLC); 结果如图5所示。图10表明，对50mg/L的菲，经过30天的培养，降解率可以达到 43%;图11表明，对50mg/L的芘，经过30天的培养，降解率可以达到34%;图12 表明，对50mg/L的苯并芘，经过30天的培养，降解率可以达到30%。
权利要求
1.一株具有降解烃类化合物的赤红球菌Rhodococcus ruber P14，其保藏编号为CGMCC NO.2343。
2. 根据权利要求1所述的赤红球菌P14，其特征在于其16SrDNA的核苷酸序列如 下agagtttgatcctggctcagga_cgaacgctggcggcgtgcc犯gtcgaac61g3tg肌gCCCagcttgctggggcg縦gggtgagtaacacgtgggtgatc121tgccctgcacttcgggat犯gcctgggaaactgggtct肌taccggatagg獄tcggga181tgcatgttccggggtgg咖ggttttccggtgC3gg3tgggcccgcggcctatcagcttg241ttggtggggtaacggcccacc卿gcgeicgacgggtagccggcctg聊gggcg腦ggc301cacactgggactgagacacggcccagactcCt￡lCggg￡lgg tggggaatgittgcai361c犯tgggcgcaeigcctgatgcagcgacgccgcgtgaggg3tgacggccttcgggttg他421acctctttcagtaccgacgaagcgc卿tgc3gaaga3gcaccggccaac481tacgtgccagcagccgcggtgtgcgagcgttgtCCgg83ttactgggcgt541犯agagctcgt3ggCggtttgtcgcgtcgtctgtgaaaacccgcagctcgactgcgggct601tgcaggcgatacgggcagact"tga_gta_ctgc鄉gg柳ctggaattcctggtgtagcgg661tgaaatgcgca_ga<t3tc3ggaggaacaccggtggcg卿gcgggtctctgggC3g"U3Ct721gacgctgaggagcga卿cgtgggt柳gaac恥gattagataccctggtagtccacgcc781g他acggtgggcgctaggtgtgggtttccttccacgggatccgtgccgt841ttaagcgccccgcctggggagtacggccgca恥gcta肌attgacggggg901cccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggg961tttgacatacaccggaccgccccagagatggggtttcccttgtggtcggtgtacaggtgg1021tgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaeigtcccgcaacgagcgcaa1081cccttgtcctgtgttgccagcacgtaatggtggggactcgcagg卿ctgccggggtc犯1141CtCggagg3￡lggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacac1201atgctecaatggccggtacagaigggctgcggtgg3gcgastcccttaaag1261ccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtg犯gtCgg3gtcgctagtaa1321tcgcagatcagcaacgctgcggtg88tax:gttcccgggccttgtacacaccgcccgtcac1381gtc3tgaa3gtcggtaacacccgaagccggtggcctaacccctcgtgggagggagccgtc1441g卿gtgggatcggcgattgggacg卿tcgt肌caaggtaaccaagactgg卿tctg。
3.根据权利要求1所述的赤红球菌P14，其特征在于在2216E平板上培养2天， 菌落特征为圆形、干燥、不透明，表面凸起，边缘整齐，颜色橙红；细胞形态 特征幼龄细胞为杆状，菌体长度差异较大，显示多态性，无规则排列，培养时间 增长后变为球形，革兰氏染色阳性；生理生化特征具有VP阳性，不产芽孢或孢 子，氧化酶阴性，接触酶阴性，还原硝酸盐。
4. 根据权利要求3所述的赤红球菌P14:其特征在于该菌能以油类物质为唯一碳 源生长，其培养基的组成为(NH4)2S04， l.Og; Na2HP04， 0.8 g; KH2P04， 0.2g; MgSO4'7H2O,0.2g; CaCl2'2H2O，0.1g; FeCl3.6H205mg; (NH4)6Mo7024.4H20， lmg; 蒸馏水1000ml;油类40ml; pH 7.0， 12rC灭菌30min。
5. 根据权利要求1所述的赤红球菌P14，其特征在于该菌能以多环芳烃为唯一碳源 生长，其培养基的组成为(NH4)2S04， l.Og; Na2HP04， 0.8 g; KH2P04， 0.2g; MgS04.7H20， 0.2g; CaCl2.2H20， O.lg; FeCl3.6H205mg; (NH4)6Mo7024.4H20， lmg;蒸馏水1000ml;多环芳烃50mg; pH 7.0， 12rC灭菌30min。
6. 权利要求1所述的赤红球菌P14在降解烃类化合物中应用。
7. 权利要求6所述的赤红球菌P14在降解烃类化合物中的多环芳烃的应用。
8. 权利要求1所述的赤红球菌P14在含油废水的生物处理和/或石油污染土壤的生 物修复中的应用。
全文摘要
本发明涉及一株赤红球菌Rhodococcus ruber P14 CGMCC NO.2343的菌株。本发明具有浮起于油类物质的特性；本发明能以油类物质作为唯一碳源和能源生长并降解油类物质；本发明能以多环芳烃作为唯一碳源和能源生长并降解菲、芘、苯并芘等烃类化合物。本发明菌株降解油类物质和烃类化合物，特别是多环芳烃的能力可应用于含油废水的生物处理和石油污染土壤的生物修复(生物整治)。
文档编号B09C1/10GK101580808SQ20081002812
公开日2009年11月18日 申请日期2008年5月15日 优先权日2008年5月15日
发明者伦镜盛, 宋小慧, 艳 徐, 忠 胡, 黄通旺 申请人:汕头大学