专利名称：一种降解亚硝酸盐的微生物以及分离、培养方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种能高效降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)MPF-906，已经于2006年3月3日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.1627；本发明也涉及巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627的分离方法、培养方法和应用，属于生物技术领域。
背景技术：
亚硝酸盐主要指亚硝酸钠和亚硝酸钾，是一种白色不透明结晶的化工产品，形状似食盐。亚硝酸盐是剧毒物质，成人摄入0.2-0.5克即可引起中毒，3克即可致死。亚硝基化合物广泛存在于腌制、腊制、发酵的食物中，如家庭制作的腌菜、腌肉、咸鱼、腊肉、熏肉、奶酪、酸菜，以及酱油、醋、啤酒等都有可能产生亚硝基化合物。
亚硝酸盐同时还是一种致癌物质，据研究，食道癌与患者摄入的亚硝酸盐量呈正相关性。亚硝酸盐还能够透过胎盘进入胎儿体内，对胎儿有致畸作用。6个月以内的婴儿对亚硝酸盐特别敏感，临床上患“高铁血红蛋白症”的婴儿即是食用亚硝酸盐浓度高的食品引起的，症状为缺氧，出现紫绀，甚至死亡，因此欧盟规定亚硝酸盐严禁用于婴儿食品。
另外由于环境中化肥施用、污水灌溉、垃圾粪便、工业含氮废弃物、燃料燃烧排放的含氮废气等在自然条件下，经降水淋溶分解后形成亚硝酸盐，流入河、湖并渗入地下，从而造成地表水和地下水的亚硝酸盐污染。
发明内容
为了减少亚硝酸盐对人类和环境的危害，本发明从烟草环境中筛选出一种能高效降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627，而且能耐受高达0.5％的烟碱。
本发明巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627的特征为杆状，有芽孢，革兰氏染色阳性，运动，葡萄糖发酵阳性，接触酶阳性，氧化酶阳性，甲基红试验阴性，V.P试验阴性，硝酸盐还原阳性，明胶液化阳性，吲哚试验阳性，石蕊牛奶试验产酸胨化，硫化氢产气试验阴性。在培养基上菌落粘稠湿润，表面光滑。最适生长温度25-30℃。
本发明还提供了降解亚硝酸盐之巨大芽孢杆菌的分离方法和培养方法。
本发明之分离能够降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌的方法包括下列步骤首先从烟草环境样品中分离出能够降解亚硝酸盐的微生物，筛选培养基为葡萄糖1-2％，蛋白胨0.1-0.3％，氯化钠0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.05-0.2％，硫酸镁0.01-0.02％，亚硝酸钠0.01-0.5％，pH 6.5-7.5；培养条件为30℃、转速120-240rpm培养。接着进行分离纯化和耐受亚硝酸盐能力实验，所用培养基与上述筛选培养基相同，获得能够降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌。
本发明之培养能够降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌的方法为将所述菌株在含有葡萄糖1-2％，蛋白胨0.1-0.3％，氯化钠0.1-0.5％，磷酸氢二钾0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.05-0.2％，硫酸镁0.01-0.02％，pH6.5-7.5的培养基中培养；培养条件为30℃、转速120-240rpm，培养时间为24h。
本发明还包括巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627在降解亚硝酸盐方面的应用，特别是在降低鱼池中亚硝酸盐的含量方面的应用。
有益效果该发明通过使用巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627来实现降解亚硝酸盐的目的，可以减少水中、土壤、烟草等环境中的亚硝酸盐含量，减少亚硝酸盐对人类和环境的危害。
保藏信息说明本发明巨大芽孢杆菌(B.megaterium)MPF-906，已经于2006年3月3日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.1627。
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627的分离从烟草环境中采废烟末样品，加入亚硝酸钠，加入100mL的无菌生理盐水，在30℃、转速120rpm培养36h。按照10倍稀释法制成10-1、10-2、10-3、…10-9的菌液于固体筛选培养基上划线，筛选培养基为葡萄糖1.5％，亚硝酸钠0.1％，磷酸氢二钾0.135％，磷酸二氢钾0.07％，硫酸镁0.02％，pH 7，琼脂2％。挑选单菌反复进行划线培养，直到得到纯的单菌，保存于牛肉膏蛋白胨斜面上保存备用。
挑选在筛选培养基上生长较快的8个菌株进行亚硝酸盐的降解实验。降解实验所用培养基为葡萄糖1.5％，亚硝酸钠0.015％，磷酸氢二钾0.135％，磷酸二氢钾0.07％，MgSO4·7H2O 0.02％，pH 7，250mL三角瓶装100mL培养基。培养条件为30℃、转速200rpm培养24h。然后测定培养基中亚硝酸盐含量。结果如表1。
表1
由表1中可以知道，菌株A1、H1、I2、T的降解率比较高，都达到了90％以上，而且这四株菌的培养菌落形态相似，可能是同一个种。
我们选择能力最好的菌株MPF-906培养鉴定，其特征为杆状，有芽孢，革兰氏染色呈阳性，运动，葡萄糖发酵阳性，接触酶阳性，氧化酶阳性，甲基红试验阴性，V.P试验阴性，硝酸盐还原阳性，明胶液化阳性，吲哚试验阳性，石蕊牛奶试验产酸胨化，硫化氢产气试验阴性。在培养基上菌落粘稠湿润，表面光滑。最适生长温度30℃。根据形态特征、生理生化实验，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》，初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillus.sp)，经过16sRNA鉴定为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。
实施例二巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627对亚硝酸盐的降解将本发明之巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627接种在下述培养基中葡萄糖1.5％，蛋白胨0.2％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.135％，磷酸二氢钾0.07％，硫酸镁0.02％，亚硝酸钠0.0138％，pH 7；培养条件为30℃、转速150rpm培养24h。然后测定培养基中亚硝酸盐含量。巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627可以将培养基中亚硝酸盐降解99.84％。
实施例三巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627耐受烟碱能力测验耐受烟碱能力测验所用的基本培养基如下葡萄糖1.5％，蛋白胨0.2％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.135％，磷酸二氢钾0.07％，硫酸镁0.02％，亚硝酸钠0.0138％，pH 7。通过分别在基本培养基中添加浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6％的烟碱，形成测验巨大芽孢杆菌耐受烟碱能力的系列培养基。将本发明之巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627分别接种在上述培养基中，接种量为4％，在30℃和150rpm转速下培养16h，以发酵液的OD600值表示巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627的生长量，并测定发酵液中亚硝酸盐的降解率。结果如表2所示。
表2
由表2可以知道，在烟碱含量为0.5％时，发酵液的OD600为1.086，此时菌数约为107/mL。当烟碱的含量为0.6％时，发酵液的OD600为0.102，微生物的生长明显受到抑制。
实施例四巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627降解烟草中亚硝酸盐的应用首先将本发明之巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627以4％的接种量接种在下列培养基组中葡萄糖1.5％，蛋白胨0.2％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.135％，磷酸二氢钾0.07％，硫酸镁0.02％，pH 7。在30℃和150rpm转速下培养20h获得种子菌液。按照6％比例将种子菌液接入经过巴氏灭菌的烟草提取液中，30℃、转速150rpm条件下培养24小时，测定培养液中的亚硝酸盐含量。结果如表3所示。从结果显示本发明之巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627可以几乎100％地降解处理烟草提取液中的亚硝酸盐。
表3 实施例五巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627在降解养鱼池中亚硝酸盐含量方面的应用水产养殖过程中通常会有亚硝酸盐的积累从而造成鱼的死亡。实验表明本发明之巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627可以减少养鱼过程中亚硝酸盐的积累。种子菌液培养基为葡萄糖1.5％，蛋白胨0.2％，氯化钠0.1％，磷酸氢二钾0.135％，磷酸二氢钾0.07％，硫酸镁0.02％，pH 7。以4％的接种量将本发明之巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627接种在上述种子菌液培养基中，30℃、转速150rpm培养24h，获得种子菌液。以1010个菌/m3的密度将种子菌液接种在鱼池中，投喂三天后开始检测鱼池水质中亚硝酸盐含量。试验设一个对照组，三个重复。
表4 表4表明本发明之巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627可以使养鱼过程中亚硝酸盐含量从0.1698mg/L下降到0.0513mg/L，有效的减少了亚硝酸盐的积累。
权利要求
1.一种分离能够降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌的方法，其包括步骤从种植烟草的农田、废烟末、烟叶仓库、烟垛周围、烟厂周围等烟草环境中筛选能够降解亚硝酸盐的微生物；分离纯化目标微生物和施用耐受亚硝酸盐能力实验；其中筛选、分离纯化目标微生物及耐受亚硝酸盐能力实验所用的培养基的组分如下葡萄糖1-2％蛋白胨0.1-0.3％氯化钠0.1-0.5％磷酸氢二钾0.1-0.3％磷酸二氢钾0.05-0.2％硫酸镁0.01-0.02％亚硝酸钠 0.01-0.5％pH6.5-7.5
2.由权利要求1所述方法分离的能够降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌(B.megaterium)MPF-906，保藏编号为CGMCC No.1627。
3.一种培养由权利要求1所述方法分离的能够降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌的方法，其特征在于所用培养基的组分如下葡萄糖1-2％蛋白胨0.1-0.3％氯化钠0.1-0.5％磷酸氢二钾0.1-0.3％磷酸二氢钾0.05-0.2％硫酸镁0.01-0.02％pH6.5-7.5
4.权利要求2的巨大芽孢杆菌在降解亚硝酸盐方面的应用。
5.如权利要求4所述的巨大芽孢杆菌的应用，其特征为用于降低鱼池中亚硝酸盐的含量。
全文摘要
本发明涉及一种能高效降解亚硝酸盐的微生物，鉴定为巨大芽孢杆菌(B.megaterium)MPF－906，保藏编号为CGMCC No.1627。本发明还公开了能够降解亚硝酸盐的巨大芽孢杆菌的分离方法和培养方法。本发明还公开了所述巨大芽孢杆菌CGMCC No.1627在降解亚硝酸盐方面的应用，可以降低水中、土壤、烟草等环境中的亚硝酸盐含量，减少亚硝酸盐对人类和环境的危害。
文档编号C02F3/34GK101050433SQ20061001160
公开日2007年10月10日 申请日期2006年4月6日 优先权日2006年4月6日
发明者孙君社, 马鹏飞, 刘萍, 张京声 申请人:中国农业大学