一种小檗碱亲和标记探针及其制备方法
【专利摘要】一种小檗碱亲和标记探针及其制备方法属于生物检测领域。探针包括：活性基团小檗碱、亲和标记基团、连接部位和报告基团四个功能部位。此小檗碱标记探针与靶蛋白作用后，通过光照使亲和标记基团分解，得到活泼的中间体，从而使探针分子与靶点蛋白共价结合，将靶标蛋白调出，确定靶标蛋白。本探针可用于小檗碱与机体、组织、细胞、菌体作用后靶标的探究。此小檗碱亲和标记探针基于活性小分子与靶标蛋白之间的作用，具有方便、准确、灵敏高、适用于非模式生物的特点，其灵敏度明显高于蛋白质光谱探针、RNA干扰。小檗碱亲和标记探针可用于钓取人体、实验动物和微生物中的靶标蛋白，具有重要生物和医学应用价值。
【专利说明】
一种小檗碱亲和标记探针及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种高灵敏小檗碱亲和标记探针及其制备方法，属于生物技术、生物 检测领域。
【背景技术】
[0002] 小檗碱为异喹啉类生物碱，是中药黄连、黄柏等的主要成分。文献表明，小檗碱对 痢疾杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、金黄葡菌球菌等有抑制作用，传统主要用于治疗肠道感 染及菌痢等。现代药理学证明小檗碱具有显著的抗心力衰竭、抗心律失常、降低胆固醇、抗 制血管平滑肌增殖、改善胰岛素抵抗、抗血小板、抗炎、抗癌等作用，且具有显著的耐药性消 除作用，因而在心血管系统、抗炎、神经系统疾病方面具有广阔的应用前景，堪称老药新用 的典范。小檗碱对部分真菌病害有抑制作用，2013-2014年期间先后有十四家农药企业申请 以小檗碱为主要成分防治植物病原真菌的田间试验，主要用于褐腐病、白粉病、灰霉病、晚 疫病等病虫害的防治，说明小檗碱作为农药杀菌剂已被越来越多的科技工作者所关注。
[0003] 作为传统抗细菌药物，小檗碱的抗细菌机制研究较多。有报道认为小檗碱与蛋白 或膜蛋白的非特异性结合是其抗菌的主因，研究发现小檗碱对G+菌的stortase酶、转肽酶 的活性有很强抑制作用，推断抑制上述酶的活性是小檗碱的抗菌机制之一。90%的药物靶 标为蛋白质，小分子药物靶标绝大多数是蛋白质，如酶、受体、离子通道等。确定靶蛋白的方 法有很多，包括基因芯片技术、生物信息学、化学基因组学、亲和色谱技术等，但这些技术大 都适用于模式生物细胞中靶标的发现。对于非模式生物，小檗碱亲和标记探针是发现未知 靶蛋白的有效手段，本发明一种高灵敏小檗碱亲和标记探针是活性小分子探针，它基于活 性小分子与靶标蛋白之间的作用，具有方便、准确的特点。经大量查询，未发现以亲和标记 探针研究小檗碱作用靶点的文献。
[0004]
【发明内容】
[0005] 小檗碱是一种异喹啉类生物碱，其分子结构如下：
[0006]
[0007] -种小檗碱亲和标记探针，其特征在于:探针包括活性基团、亲和标记基团、连接 部位、报告基团四部分;是活性基团为小檗碱;亲和标记基团是氮苯、氮杂苯、苯基叠氮、苯 甲基三氟双吖丙啶、二苯甲酮、苯并三哇类、邻羟基二苯甲酮类、Tinuvin 400，Cya-sorb UV 1164，Tinuvin 1577中的一种或几种。
[0008] 报告基团与亲和基团连接基团为RhRi为三乙二醇、聚乙二醇、C原子数n = 5-7的长 链烷烃;亲和基团与小檗碱活性基团连接基团为R2，R2为乙二胺，乙酰胺，乙胺，C原子数n = 2-4的长链烷烃等中的一种或几种。
[0009] 报告基团为：多肽标签、荧光素如？11^、1^1〇(1&1^116、？41、8001?￥、〇73、〇75以及生物 素等。
[0010]探针与靶点蛋白接触后，在紫外光照射下，（照射距离3-5cm，震荡下光照15-30min，光照波长300-375nm。）亲和标记基团分解，得到活泼的中间体，中间体可与革E1点蛋白 共价结合，将靶标调出。其基本结构如下（其中报告基团以生物素为例，亲和基团以苯甲基 三氟双吖丙啶为例，连接基团为Ri，R 2):
[0011]
[0012]部分化合物结构如下：
[0015] 其中Y1制备反应路线如下：
[0016] 以小檗碱(^61^61'；[116，13131041为起始原料，经真空裂解得到小檗红碱42,42与卤代 物R2X反应，进行连接臂的延长得到A3,然后将A3与经过以B2为起点制得的B1反应，得到小 檗碱亲和标记探针BBR-BP。
[0017]其中B1为报告基团与亲和基团连接物。
[0018]
[0019] 通常，小檗碱A1经高温反应制得A2在真空下进行，用乙醇或者水进行重结晶，得到 A2，A2酚羟基成醚一般在N-N二甲基甲酰胺(DMF)、丙酮、乙腈中，以碳酸钾、碳酸铯、氢氧化 钠作为缚酸剂，反应温度为20_90°C，反应时间为2-22h，反应结束后，一般用乙酸乙酯，二氯 甲烷，氯仿等溶剂萃取，经饱和食盐水洗，真空除溶剂，硅胶柱层析得到A3,产物用NMR等方 法证明。
[0020] A3与B1的连接，一般在二氯甲烷，DMF或混合溶剂，加入催化剂二环己基碳二亚胺 (DCC)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，1 -羟基苯并三唑(HoBt)等进行缩合，反应温度0-80 °C，反应 时间为l_28h，反应完成后一般真空除溶剂，用乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷等溶剂萃取，洗涤， 除溶剂，硅胶柱层析得到目标探针BBR-BP。产物通过NMR，MS等方法证明。
[0021] 这种高灵敏小檗碱亲和标记探针及其制备方法，其特征是小檗碱亲和标记探针用 于研究或探讨小檗碱作用于人体、动物和微生物的靶标蛋白。
【具体实施方式】
[0022] 现结合实例详细说明本发明的技术方案。所有的实例都严格按照上述的制备方法 的操作步骤进行操作
[0023] 实施例1:
[0024] 小檗红碱A2的制备
[0025] 9.0g(25mmol)小檗碱于250ml三口烧瓶内，将烧瓶抽真空，于195°C，机械搅拌2h。 反应完毕后，将粗产物溶于250ml无水乙醇，过滤出去不溶物。蒸干溶剂，硅胶柱层析，体积 比（甲醇：二氯甲烷=1:15)，得红色固体（6.35g, 19.7mmol)，产率78.8^,11^^(4001?， DMS0)511.23(s,1H) ,9.89(s , lH), 8.82(s , lH) ,8.09(d ,J = 9. OHz , lH) ,7.79(d ,J = 5.3Hz , 1H) ,7.69(d ,J = 8.9Hz,lH),7.07(s,lH) ,6.17(d ,J = 4.3Hz,2H) ,4.89(t ,J = 6.1Hz ,2H), 4· 03(s, 3H), 3 · 22-3 · 14(m, 2H) ·HRMS(ESI):计算值Ci9Hi6N〇4+322 · 1079,实测值322 · 1079 · [0026] 实施例2:
[0027]小檗红碱连接臂A3的制备：
[0028] 100ml单口烧瓶中，化合物六2(0.58，1.55111111〇1)溶于351111乙腈中，加入带保护的溴 乙胺（R2X)(433.05mg，l .93mmol，1.3equiv)，碳酸铯（970.943mg)，氢氧化钠（60mg)，60°C磁 力搅拌16h，反应结束后，过滤，滤液蒸干溶剂，硅胶柱层析，体积比（甲醇：二氯甲烷=1: 10)，得黄色固体（340mg，0 · 73mmo 1)，产率 49 · 13 %。4 MMR( 400MHz，DMSO )S9.88(s，lH), 8.95(d ,J = 6.9Hz,lH),8.19(d ,J = 8.9Hz,lH),8.00(dd ,J=17.0,9.1Hz,lH),7.80(s,lH), 7.11(d ,J=14.8Hz,2H),6.18(s,2H),4.95(d ,J=17.9Hz,2H),4.34(t ,J = 5.1Hz,2H),4.03 (d,J=14.0Hz,3H) ,3.41( t,J= 11.5Hz, 2H) ,3.22(d,J = 5.5Hz,2H) ,1.40-1.25(m,9H) .HRMS(ESI):计算值C26H29N2〇6+465 · 2026,实测值465 · 2023.
[0029] 实施例3:
[0030] 化合物B3的制备：
[0031] 于25ml单口烧瓶中，化合物B2 (80mg，0 · 347mmol)溶于10ml无水DMF，加入RiX (132 · 4mg，0 · 424mmo 1)，四丁基碘化铵33mg，K2C〇364mg，70°C磁力搅拌12h。反应完毕后，向反 应液加入15ml水，用乙酸乙酯萃取3次，饱和氯化钠洗。有机相无水Na 2S〇4干燥。硅胶柱层 析，体积比（乙酸乙酯：石油醚=1:5)，得黄色油状物B3 (0.112g，0.243mmo 1)，产率69.83 % ,Η NMR(400MHz，CDCl3)Sl0.47(s，lH)，7.84(d，J = 8.1Hz，lH)，6.86(d，J = 8.2Hz，lH)，6.75 (s,lH),4.98(s,lH),4.28-4.22(m,2H),3.74-3.67(m,2H),3.66-3.60(m,2H),3.57-3.49 (m,2H),3.31(d ,J = 5.0Hz,2H),1.43(s,9H).
[0032] 实施例4:
[0033] 化合物M的制备：
[0034] 于5ml单口烧瓶中，加入化合物B3(0. lg，0.217mmol)，溶于lml二氯甲烷中，在冰水 浴下滴加三氟乙酸-二氯甲烷lml (体积比TFA: CH2C12= 1:1)，磁力避光搅拌lh。反应完毕后， 蒸干溶剂，将残余物溶于lmlDMF中，后向反应液中加入三乙胺98μ1，加入溶于lmlDMF中的报 告基团生物素(81.38mg，238.39ymol，1 · lequiv)，磁力搅拌过夜。反应完毕后，蒸干溶剂，将 残渣溶于甲醇与二氯甲烷中，分别用1N氢氧化钠洗，饱和氯化钠溶液洗，1N盐酸洗，饱和氯 化钠溶液洗，无水硫酸钠干燥。硅胶柱层析，体积比（甲醇:二氯甲烷=1:10)。得无色固体Μ (6811^，115.724111〇1)，产率53.4%。1!1匪1?(4001抱，0)(：13)37.75(8，1!〇,7.09((1，了 = 20.0抱， 2H)，5.64(s，lH)，5.54(s，lH)，5.37(s，lH)，4.59(m，lH)，4.30(m，2H)，4.07(m，lH)，3.71(d， J = 39.9Hz,4H),3.49(m ,J= 17.4Hz, 5H), 3.32-3.07(m,4H), 2.13(m,2H),1.94(m,lH), 1.70 (m, J = 8 · 1Hz , 3H), 1 · 25(m, 2H) · HRMS(ESI):计算值C25H32F3N5〇6S[M+H]+587 · 2025,实测值[M+ Η]+588·2082·
[0035] 实施例5:
[0036] Y1,BBR_BP 的制备：
[0037] 取101111单口烧瓶，将化合物81(42.8611^，71.01以111〇1)溶于3111101^中，加入81摩尔 数的百分之一量的DCC，搅拌0.5h，后将化合物A3 (50mg)溶于3ml DMF中，加入到反应液中， 并加入适量(B1摩尔数的百分之一量的DCC，）DMAP,磁力搅拌室温搅拌10h至反应完全。蒸干 溶剂。硅胶柱层析，体积比（甲醇:二氯甲烷=1:10)，得产物BBR-BP(34.6mg，34.32μπιο 1).产 率48 · 33% DHRMS(ESI):计算值C48H54F3N80iiS+1007 · 3585，实测值 1007 · 3569。
[0038] 实施例6:
[0039] 小檗碱亲和标记探针活性测定:制备含有小檗碱亲和标记探针的PDA培养基，该探 针终浓度分别为1.7、3.3、6.7、13.3、26.7yg/mL，并有一组PDA培养基加入等量的无菌水作 为空白对照组，每组浓度设置三个重复。另外设置同浓度小檗碱作对照。取出培养好的桃褐 腐菌(Monilinia fructicola)平板，无菌操作条件下，用打孔器打取菌块，每次打取菌块直 径约为8 mm，接种菌块贴到各个培养基平板的中心处（菌丝朝下），待菌饼贴好后（培养约 24h)倒置平板，27°C恒温培养箱培养。用十字交叉法测定菌径大小，每隔24h记录一次生长 情况，据此通过公式计算抑制率。
[0040] 菌落直径(mm)=测量菌落直径平均值(_)-8
[0041 ]杀菌剂对桃褐腐菌抑制率（％ )=(空白对照组菌落直径-带探针组菌落)/空白对 照组菌落直径XI00 %
[0042]选取84h的生长情况进行分析，小檗碱亲和探针对桃褐腐菌有明显的抑菌作用，随 着小檗碱探针浓度的增大，对桃褐腐菌的抑制作用越明显，在小檗碱探针浓度达26.7yg/mL 时，抑菌率89.6 %，小檗碱探针EC5Q = 6.64yg/mL，见表1。
[0043] 表1小檗碱亲和探针对桃褐腐菌菌丝生长的抑制(84h)
[0044]
[0045] 选取84h的生长情况进行分析，小檗碱对桃褐腐菌有明显的抑制作用，随着小檗 碱浓度的增大，对桃褐腐菌的抑制作用越明显，在小檗碱浓度达26.7yg/mL时，抑菌率达 87 · 6 %，小檗碱EC5q = 8 · 32yg/mL，见表2。
[0046] 表2小檗碱对桃褐腐菌菌丝生长的抑制(84h)
[0047]
[0048] 由表1、2可知，小檗碱亲和探针对桃褐腐菌抑制作用与小檗碱没有明显区别，说明 此小檗碱亲和探针与小檗碱具有生物活性，可用于用于钓取人体、实验动物和微生物中的 革巴标蛋白。
【主权项】
1. 一种小築碱亲和标记探针，其特征在于:探针包括活性基团、亲和标记基团、连接部 位、报告基团四部分;是活性基团为小築碱;亲和标记基团是氮苯、氮杂苯、苯基叠氮、苯甲 基Ξ氣双叮丙晚、二苯甲酬、苯并Ξ哇类、邻径基二苯甲酬类、Tinuvin 400，Cya-so;rb UV 1164，Tinuvin 1577中的一种或几种。2. 根据权利要求1所述探针，其特征在于:报告基团与亲和基团连接基团为为Ξ乙 二醇、聚乙二醇、C原子数n = 5-7的长链烧控;亲和基团与小築碱活性基团连接基团为R2，R2 为乙二胺，乙酷胺，乙胺，C原子数n = 2-4的长链烧控中的一种或几种。3. 根据权利要求1所述探针，其特征在于:报告基团为:多肤标签、巧光素或生物素。4. 根据权利要求1所述探针，其特征在于结构是下列任一化合物：5.制备如权利要求1所述的探针方法，当W生物素为报告基团，苯甲基Ξ氣双叮丙晚为 亲和基团，包括如下步骤：W小築碱Α1为起始原料，经真空裂解得到小築红碱Α2，Α2与漠乙 胺反应，其中一端氨基被保护R巧进行连接臂的延长得到A3，然后将A3与经过Β2与RiX反应的 产物为起点制得的B1反应，得到小築碱亲和标记探针BBR-BP; 町X结构为6.应用如权利要求1-4任意一项所述探针，其特征是用于研究或探讨小築碱作用于人 体、动物和微生物的祀标蛋白。
【文档编号】C09K11/06GK106085415SQ201610562804
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月16日
【发明人】田平芳, 尹鸣, 尹一鸣, 李映, 曹哲统
【申请人】北京化工大学