一种高灵敏荧光探针及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于药品的质量检验领域，具体设及一种高灵敏巧光探针TPE-I及其制备 方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肝素是一种高度硫酸化的黏多糖，在临床上被广泛用于多种疾病的治疗和预防。 在外科手术中，肝素被广泛用作抗凝血剂。然而在临床上肝素的用药剂量必须控制在合适 的范围，否则就会引起副作用如大出血、血小板减少、血钟过多和骨质疏松等，严重情况下 甚至威胁生命。据已有研究结果，在外科手术中，肝素合理的剂量范围为2-8U/mU而在后期 康复用药期间，肝素合理的剂量范围为0. 2-1. 2U/血。因此，如何方便快捷地检测肝素的浓 度十分重要。目前常用的肝素浓度检测手段有活化凝血时间测定法（activatedclotting timeassay)、活化部分凝血活酶时间测定法（activatedpartialt虹omboplastintime assay)、电化学方法、电泳法W及表面增强拉曼光谱法等。然而运些方法都存在不足之处。 活化凝血时间测定法和活化部分凝血活酶时间测定法运两个经典方法在临床上已经使用， 但是却存在W下非常明显的缺点：1)都是间接测量肝素的浓度，因此会导致测试结果与真 实情况有偏差，受环境的溫度湿度等不确定性因素影响较大，所得数据不是十分准确可靠； 2)测试时间长；3)测试费用高。而电化学方法检测对肝素的选择性不高，容易受到体系中 其他分子和离子的干扰，因此可能给出假信号。而拉曼光谱仪仪器价格昂贵，此外，用表面 增强拉曼光谱法检测需要先制备相应的金或者银基底，因为金和银均为贵金属，因此该方 法成本较高并且测试结果受基底制备的影响较大，导致数据的波动，准确性可靠性较差。
[0003] 因此，十分需要发展一种新型的检测技术用于肝素的高灵敏、高选择性检测。该技 术必须满足W下条件：1)能够选择性地检测肝素，检测信号不受检测体系中其他成分的干 扰；2)灵敏度高，检测灵敏度必须低于临床上肝素使用的最低剂量浓度；3)检测方法可靠、 稳定，检测不受微环境的影响；4)检测信号与肝素的浓度有很好的线性关系，而不是上下 波动的信号。
【发明内容】
[0004] 发明目的：本发明针对目前肝素检测方法存在的数据不准确、耗时长、测试费用高 等现状，通过发展新型巧光探针技术对肝素进行高选择性、高灵敏性的检测。该技术用于肝 素检测具有W下优点：1)检测信号与肝素浓度呈现非常好的线性关系；2)检测能够在多种 抑环境下进行，不受检测环境和检测体系中复杂成分的影响；3)检测操作简便速度快，该 方法只需将样品与巧光探针混合，然后立即测试其巧光强度即可得知相应的肝素含量；4) 既可W测试样品中肝素的含量，也可W对商品化肝素的质量进行鉴定。
[0005] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高灵敏巧光探针TPE-1，该 巧光探针TPE-I包括有与肝素有识别作用的多肤AG73和作为巧光信号基团的标记在多肤 AG73的一端的AIE巧光团。
[0006] 其中，上述多肤AG73的序列为服化QV化SIRT。 阳007] 其中，上述AIE巧光团为四苯乙締分子。
[0008] 一种高灵敏巧光探针TPE-I的制备方法，包括W下步骤：
[0009] 1)四苯乙締分子的合成；
[0010] 将二苯基甲烧化〇2g，12mmol)溶于50血干燥的四氨巧喃中，置换氮气保护后置 于-78°C冷却浴中。注入5血浓度为2. 5M的正下基裡正己烧溶液，并保持此溫度反应1小 时。将4-漠二苯甲酬（2. 35g，9mmol)溶于IOmL干燥的四氨巧喃，慢慢注入上述溶液中，并 室溫揽拌过夜。加入氯化锭水溶液泽灭反应，二氯甲烧萃取，有机相用无水硫酸钢干燥后旋 干。将所得粗产物溶于SOmL甲苯，加入对甲苯横酸（342mg，1.Smmol)，分水回流5小时。待 反应液冷却至室溫，加入10 %碳酸氨钢水溶液萃取，有机相用无水硫酸钢干燥后旋干。柱层 析提纯得漠代四苯乙締，产率约40%。将漠代四苯乙締（1.6g，3.9mmol)溶于30mL干燥的 四氨巧喃溶液中，氮气保护，置于-78°C冷却浴中。注入2mL浓度为2. 5M的正下基裡正己 烧溶液，并保持此溫度反应2小时。加入过量干冰，并继续室溫反应过夜。减压蒸馈除去溶 剂，柱层析提纯得目标簇基取代四苯乙締分子。 阳01U 咱NMR (CDCI3, 300MHz) 5 :12. 67(S,1H, -C00H)，7. 70化甜，化），7. 14-6. 97 (m, 17H ，化）.HRMScalculated for C2化9〇2([M-田）：375. 1391，observed 375. 1381. 阳01引。多肤AG73的合成；
[0013] 多肤AG73按照固相多肤合成法合成。金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0014] 3)多肤AG73的巧光标记。
[0015] 多肤AG73的巧光标记通过簇基取代四苯乙締分子上的簇基与多肤氨基酸残基上 氮端的氨基形成酷胺键得到巧光探针分子TPE-I。
[0016] HPLC 99. 7% ;MS calculated for []?+3田+619. 03, observed 619. 35.
[0017] 上述的一种高灵敏巧光探针TPE-I在肝素检测方面的应用。
[0018] 上述的高灵敏巧光探针T阳-1对肝素样品中多硫酸软骨素含量检测方法，包括W 下步骤：
[0019] 1)将探针分子TPE-I配制储备液1 :取TPE-I，溶于DMSO中，配制浓度为IOmM的储 备液1;配制抑为7. 4的IOmM肥阳S缓冲溶液100血待用；于比色皿中加入50yLDMS0， 加入1yLTPE-I储备液1，加入950yL肥阳S缓冲液，得探针溶液；将含有多硫酸软骨素 的肝素样品加入上述探针溶液中，测试其巧光强度，记录为Outl;
[0020] 。向上述溶液中加入肝素酶，37°C反应四小时，测试巧光强度，并将所得数值记录 为0ut2;将0ut2/0utl的比值作为信号，即可得出样品中多硫酸软骨素的含量。
[0021] 本发明对肝素的定量检测原理：向T阳-1的溶液中加入肝素会使其发出强烈的巧 光，并且巧光强度和肝素的浓度呈现线性关系；若继续向此混合溶液中加入肝素酶，则所得 强巧光被泽灭，运是因为肝素酶切断了肝素分子，使得肝素与TPE-I的结合被打破，巧光消 失。
[0022] 对肝素中可能杂质多硫酸软骨素的检测原理：多硫酸软骨素能够与TPE-I结合， 结合产生的巧光低于同等浓度的肝素，因此存在多硫酸软骨素的肝素样品加入TPE-I后的 巧光强度弱于纯的肝素样品；肝素中的多硫酸软骨素可W抑制肝素酶的活性，使得肝素酶 不能够水解肝素分子，因此若肝素样品中存在多硫酸软骨素，则经过肝素酶处理之后巧光 不能被泽灭，即0ut2大于纯的肝素。综上，若肝素的样品中存在多硫酸软骨素，则得到更大 数值的Outz/Outi，W此比值为信号，可W计算得出肝素中多硫酸软骨素的含量。
[0023] 有益效果：本发明的巧光探针TPE-I可W对待测溶液中肝素的含量进行定量的检 。检测行为具有很好的线性相关关系、能够在广泛的抑范围下进行检测、检测不受肝素 类似物或者常见生物分子离子的干扰、检测的灵敏度高、探针性能稳定可W长期保存和使 用。此外，TPE-I还可W用于肝素的质量检验，测定其可能含有的杂质多硫酸软骨素的含 量。对肝素中可能存在的多硫酸软骨素检测也是通过信号的增强来实现，检测信号与多硫 酸软骨素的含量有很好的线性关系、检测灵敏度高，因此具有很高的实际应用价值。多肤还 包含其它与肝素特异识别的多肤序列（包含有D-氨基酸、k氨基酸、D-氨基酸与k氨基 酸的混合型及非天然氨基酸的序列）。AIE的探针，除TPE外，还包含其它