一种检测谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法与使用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物检测技术领域，具体设及一种作为谷脱甘肤巧光探针材料使用的 蒙酷亚胺-苯亚讽衍生物及其制备方法与使用方法。
【背景技术】
[0002] 谷脱甘肤佑lutathione，GSH)是由谷氨酸、半脱氨酸和甘氨酸组成的S肤分子， 是人体中含量最多的含琉基氨基酸。在生命体内，谷脱甘肤对维持细胞内氧化还原平衡、 外源物质的新陈代谢、细胞内信号转换和基因调节等起着重要的作用。细胞内谷脱甘肤浓 度的异常将导致一系列生理疾病，例如白细胞缺失、银屑病、肝损伤、癌症和艾滋病等（参 见 L. A. Herzenberg, S. C. De Rosa, J. G. Dubs 等，Glutathione deficiency is associated with impaired survival in HIV disease，Proc.Natl. Acad.Sci.USA.,1997,94 ; 1967-1972)。因此，定量、实时地监测生物体内谷脱甘肤的含量一直是生物化学和化学生物 学的研究热点。
[0003] 巧光检测法由于其优秀的检测灵敏度和选择性，并能实现对生物样品的实时、在 线检测而受到研究者的广泛关注。蒙酷亚胺类巧光分子因其具有良好的光稳定性、高摩尔 消光系数和量子产率等独特优点而成为该方法最重要的巧光母体之一，在多种待测分子的 巧光检测中得到了广泛的应用。
[0004] 目前已开发的用于检测谷脱甘肤的小分子巧光探针主要基于琉基与2, 4-二硝基 苯横酷氨基或是2, 4-二硝基苯壞酷醋基之间的特异性化学反应而设计的。当存在谷脱甘 肤的条件下，探针分子中的2, 4-二硝基苯横酷氨基或是2, 4-二硝基苯壞酷醋基能被谷脱 甘肤中的琉基取代，原2, 4-二硝基苯横酷氨基或是2, 4-二硝基苯壞酷醋基发生离去而导 致探针分子的巧光性质发生变化，从而实现对谷脱甘肤的特异性设别。
[0005] 然而，已报道的谷脱甘肤探针大多数受到生物体内同样含有琉基的氨基酸，如；半 脱氨酸（切steine，切S)和高半脱氨酸（Homo巧steine，化y)的干扰（参见J. Bouffard, Y. Kim, T. M. Swager 等，A Highly Selective Fluorescent Probe for Thiol Bioimaging， Org. Lett. , 2008, 10 ;37_40 ;X. -D. Jiang, J.化ang, X.化ao 等，A selective fluorescent 1:u;rn-〇n NIR probe for cysteine, Org. Biomol. Qiem. , 2012, 10 ; 1966-1968)，难 W实现其 在复杂的生物体内进行谷脱甘肤的特异性检测。因此亟须一种新颖的、具有良好生物稳定 性的且能实现优秀特异性响应的用于生物体内谷脱甘肤检测的巧光探针。
【发明内容】
[0006] 为了克服现有技术中的上述缺陷，本发明旨在提供一种来自蒙酷亚胺和苯亚讽的 用于检测谷脱甘肤的巧光探针及其制备方法和使用方法。
[0007] 本发明的核屯、在于利用1，8-蒙酷亚胺构筑经典的ICT体系，并在4-位引入苯亚 讽部分，调控探针分子的ICT效应。当无谷脱甘肤的存在下，由于4-位苯亚讽的强吸电子效 应导致探针分子无巧光发射；而当存在谷脱甘肤的条件下，苯亚讽部分能被谷脱甘肤取代， 进而发生从4-位硫原子（来自谷脱甘肤）到1，8-蒙酷亚胺的分子内电子转移，而该ICT 效应使得探针分子发射出强巧光。通过上述方案，获得了高度谷脱甘肤特异性的"关-开" 型的巧光响应，大大提高了检测的选择性和灵敏度。
[000引首先，为了达到上述目的，本发明提供了一种如式（I)所示的蒙酷亚胺-苯亚讽衍 生物。
[0009]
【主权项】
1. 一种检测谷胱甘肽的荧光探针，其特征在于：该探针为式（I)所示化合物，
式⑴中，η为O~18的原子数A1为氢，或甲基，或乙基，或异丙基，或氟；R2为甲基， 或羟基，或羧基，或磺酸基，或（三苯基）磷基，或
中的任何一种。
2. 根据权利要求1所述的一种检测谷胱甘肽的荧光探针，其特征在于：该探针结构式 如式（II)，
3. 权利要求1所述一种检测谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于，该方法包 括下列步骤： 步骤一：在惰性气氛下，式（III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐与氨基化合物在醇中反 应得到式（IV)所示取代的4-溴-1，8-萘酰亚胺；
式（IV)中，η为O~18的原子数，R2为甲基，或羟基，或羧基，或磺酸基，或（三苯基） 磷基，或
中的任何一种； 步骤二：在惰性气氛下，在碱存在下，式（IV)所示化合物与式（V)所示化合物在醇中反 应得到式（VI)所示取代的4-苯硫酚基-1，8-萘酰亚胺；
式（VI)中，η为O~18的原子数况为氢，或甲基，或乙基，或异丙基，或氟；R2为甲基， 或羟基，或羧基，或磺酸基，或（三苯基）磷基，或
中的任何一种； 步骤三：在惰性气氛下，式（VI)所示化合物与间氯过氧苯甲酸在有机溶剂中反应即得 式（I)所示化合物。
4. 根据权利要求3所述的一种检测谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在于： 步骤一中所述氨基化合物具体为正丁胺；式（III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述 氨基化合物的摩尔比为1~50:1，；所述醇为甲醇、乙醇，正丙醇、异丙醇、正丁醇或乙二醇 单甲醚；所述反应温度为50~120度，反应时间为1~20小时； 步骤二中所述醇为甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙二醇单甲醚或二乙二醇单甲醚；式（IV) 所示4-溴-1，8-萘酰亚胺和式（V)所示苯硫酚化合物的摩尔比为1~10:1 ;所述碱为有 机碱或无机碱；所述有机碱为三乙胺、吡啶或二异丙基乙基胺中；所述无机碱为碳酸钾、碳 酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾；反应温度为〇~140度；反应时间为1~ 48小时； 步骤⑶中所述间氯过氧苯甲酸与式（VI)所示取代的4-苯硫酚基-1，8-萘酰亚胺的 摩尔比为0. 5~1. 5:1 ;所述有机溶剂为氯仿、二氯甲烷、乙腈、DMF、DMSO或1，2-二氯乙烷； 反应温度为〇~100度；反应时间为1~24小时。
5. 根据权利要求3或4所述的一种检测谷胱甘肽的荧光探针的制备方法，其特征在 于： 步骤一中，式（III)所示4-溴-1，8-萘二甲酸酐和所述氨基化合物的摩尔比为10 :1 ; 所述醇为乙醇；所述反应温度为80度；反应时间为5小时； 步骤二中所述醇乙二醇单甲醚；式（IV)所示4-溴-1，8-萘酰亚胺和式（V)所示苯硫 酚化合物的摩尔比为5 :1 ;反应温度为为100度；反应时间24小时； 步骤三中，间氯过氧苯甲酸与式（VI)所示取代的4-苯硫酚基-1，8-萘酰亚胺的摩尔 比1 :1 ;所述有机溶剂为二氯甲烷；反应温度为25度；反应时间为5小时。
6. -种检测谷胱甘肽的荧光探针的使用方法；其特征在于，该方法具体包括以下步 骤： 步骤1 :向不同浓度谷胱甘肽的缓冲溶液中加入相同浓度的式（I)所示化合物，配置至 少3种不同谷胱甘肽含量的含有式（I)所示化合物的标准溶液； 所示缓冲溶液以是磷酸盐缓冲溶液、Tris-HCl缓冲溶液、HEPES缓冲溶液、硼酸-硼酸 钠缓冲溶液中的任何一种， 所示标准溶液的pH值为6~11，具体以是7. 2 ; 所示标准溶液中式（I)所示化合物的浓度为InM~10 μΜ ; 所示标准溶液中谷胱甘肽的含量为〇. InM~ImM ; 步骤2 :分别测定所述标准溶液的荧光发射光谱，激发波长为366nm，以谷胱甘肽浓度 为横坐标，以I482为纵坐标，建立标准曲线； I482表示所述标准溶液在波长为482nm处的荧光发射峰强度值； 步骤3 :向待测样品中加入式（I)所示化合物，控制其浓度与所述标准溶液中式（I)所 示化合物的浓度相等；测定其在激发波长为366nm的激发光下的荧光发射谱，即根据标准 曲线计算得出待测样品的谷胱甘肽含量； 上述步骤：2或步骤3中荧光强度在荧光仪上进行检测。
7. 根据权利要求6所述的一种检测谷胱甘肽的荧光探针的使用方法；其特征在于：步 骤1中的缓冲溶液是磷酸盐缓冲溶液。
【专利摘要】本发明公开了一种检测谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法与使用方法。本发明利用1,8-萘酰亚胺构筑经典的ICT体系，并在4-位引入苯亚砜部分，调控探针分子的ICT效应。当无谷胱甘肽的存在下，由于4-位苯亚砜的强吸电子效应导致探针分子无荧光发射；而当存在谷胱甘肽的条件下，苯亚砜部分能被谷胱甘肽取代，进而发生从4-位硫原子（来自谷胱甘肽）到1,8-萘酰亚胺的分子内电子转移，而该ICT效应使得探针分子发射出强荧光。本发明能够实现对细胞内谷胱甘肽的检测，具有操作简便，成本低廉，响应灵敏，易于推广和应用等优点。
【IPC分类】C07D221-14, G01N21-64, C09K11-06
【公开号】CN104673278
【申请号】CN201510083494
【发明人】韩益丰, 杨成玉
【申请人】浙江理工大学
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月15日