一种尺寸可调的荧光碳氮纳米片制备方法和应用与流程

本发明涉及一种碳纳米材料中的碳纳米片(Carbon nanosheets)的制备方法及其具有双光子荧光成像的应用，属于纳米技术领域。

背景技术：

碳氮纳米片是一种新型的碳氮材料，因为它具有独特的化学结构和较高的氮元素含量，已经广泛研究于应用检测金属离子和生物电子供体或受体。Zhao等近期在先进材料(Advanced Materials)上报道了一种通过水热法合成的有机碳氮纳米片，通过加入不同金属盐可得到不同的金属碳氮纳米片。Liu等人在分析化学(Analytical Chemistry)杂志上报道了通过硝酸氧化法与液体去角质法处理合成的块状不规则碳氮纳米片聚合体得到小尺寸的碳氮纳米片，且这种碳氮纳米片可以与酪氨酸有效结合，产生一种具有荧光活性的生物碳氮纳米片。Ju等人也在分析化学杂志上报道了通过三聚氰胺加聚获得大块石墨碳氮纳米片，再用超声波剥离处理的方法，得到2nm左右的微小碳氮纳米片，同时系统的研究了碳氮纳米片与DNA的相互作用，并设计了出碳氮纳米片与DNA结合的快速均相荧光检测。Tian等人通过均相加热的方法，在利用硝酸与液体去角质法，得到了1nm左右厚度的碳氮纳米片，他们只对铜离子对其的淬灭作用进行了深入研究。但此方法需要在高温下煅烧得到大块碳氮纳米片，且碳氮纳米片尺寸大小不一，后处理剥取过程繁琐，需要超声处理。然而，从大块石墨碳氮纳米片上剥离的这些碳氮纳米片的尺寸和厚度不是与复杂的合成方法的可控偶联。此外，它还显示出低的稳定性和在水溶液中的差的分散性，这极大地限制了碳氮纳米片的进一步修饰和应用。因此，具有可控尺寸和表面性质以及有利的亲水性的均匀且稳定的碳氮纳米片的方法仍然是一个实质性的挑战。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是：提出一种可以利用价格低廉的原料和简单的制备工艺过程，得到良好水溶性的荧光碳纳米片的尺寸可调的荧光碳氮纳米片制备方法和应用，所制备的荧光碳氮纳米片可用于对肝癌细胞(HEPG2)，宫颈癌细胞(Hela)，神经细胞(SH-SY5Y)进行双光子荧光成像。

为了解决上述技术问题，本发明提出的技术方案是：一种尺寸可调的荧光碳氮纳米片的制备方法，包括以下步骤：

采用水热反应的方法制备碳氮纳米片：称取1-2g聚合物分散于10-20mL去离子水中，放置在10-100mL的反应釜内，在反应温度100-240℃，高温炉中加热4-6小时，获得黄色溶液；然后把反应液倒入7000-14000透析袋内透析，透析时间为2-4天，得到浅黄色水溶液，冷冻干燥得到浅黄色的固体粉末；所述聚合物为聚乙烯亚胺PEI或谷胱甘肽GSH。

优选的，其中反应温度240℃，高温炉中加热6h。

为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：一种尺寸可调的荧光碳氮纳米片，根据所述的尺寸可调的荧光碳氮纳米片的制备方法制备而得。

为了解决上述技术问题，本发明提出的另一技术方案是：所述的尺寸可调的荧光碳氮纳米片的应用方法，所述的尺寸可调的荧光碳氮纳米片对细胞进行双光子荧光成像的应用，在贴壁细胞PBS缓冲溶液中加入所述碳氮纳米片溶液，孵育一定时间，进行双光子成像。

优选的，所述PBS缓冲溶液是含100mM K+、5mM Mg2+,pH＝7.4的缓冲溶液；所用碳氮纳米片溶液的浓度为10-200μg/mL，孵化时间为2-4小时。

优选的，PBS缓冲溶液的用量是1mL，碳氮纳米片溶液的用量是10μL-50μL。

本发明的有益效果：

本发明为一种尺寸可调的水溶性荧光碳氮纳米片及其制备方法和应用，它对原有的制备方法进行了显著的改进，通过改变温度(100-240℃)，获得了尺寸可调(10-100nm)和水溶性很好的荧光微型化碳氮纳米片；并且所制备的碳氮纳米片可以作为一种双光子荧光成像剂，在肝癌细胞(HEPG2),宫颈癌细胞(Hela)，神经细胞(SH-SY5Y)中都具有很好的双光子荧光成像效果。

附图说明

下面结合附图对本发明的作进一步说明。

图1为实施例1中制得的碳氮纳米片的透射电镜图(插图部分突出显示碳化氮粒径分布曲线；

图2为实施例1中制得的碳氮纳米片的吸收光谱图；

图3为实施例1中制得的碳氮纳米片的荧光光谱图；

图4为实施例2中制得的碳氮纳米片的透射电镜图(插图部分突出显示碳化氮粒径分布曲线)；

图5为实施例2中制得的碳氮纳米片的吸收光谱图；

图6为实施例2中制得的碳氮纳米片的荧光光谱图；

图7为实施例3中制得的碳氮纳米片的透射电镜图(插图部分突出显示碳化氮粒径分布曲线)；

图8为实施例3中制得的碳氮纳米片的吸收光谱图；

图9为实施例3中制得的碳氮纳米片的荧光光谱图；

图10为实施例4中制得的碳氮纳米片的透射电镜图(插图部分突出显示碳化氮粒径分布曲线)；

图11为实施例4中制得的碳氮纳米片的吸收光谱图；

图12为实施例4中制得的碳氮纳米片的荧光光谱图；

图13为实施例4中制得的碳氮纳米片的原子力显微图(图中显示碳化氮高度分布效果图)；

图14为实施例8中制得的碳氮纳米片的吸收光谱图；

图15为实施例8中制得的碳氮纳米片的荧光光谱图；

图16为实施例9中碳氮纳米片在GPEG2细胞的双光子荧光成像图(图中a1,a2,a3分别为没有碳氮纳米片时细胞的暗场，明场和叠加场成像；b1,b2,b3分别为有碳氮纳米片时细胞的暗场，明场和叠加场成像)；

图17为实施例10中碳氮纳米片在Hela细胞的双光子荧光成像图(图中a,b分别为没有碳氮纳米片时细胞的明场和暗场成像；c，d分别为有碳氮纳米片时细胞的明场和暗场成像)；

图18为实施例11中碳氮纳米片在SH-SY5Y细胞的双光子荧光成像图(图中a1,a2,a3分别为没有碳氮纳米片时细胞的暗场，明场和叠加场成像；b1,b2,b3分别为有碳氮纳米片时细胞的暗场，明场和叠加场成像)；

具体实施方式

以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。

实施例1：称取1g PEI分散于10mL去离子水中，放置在20mL的反应釜内，在反应温度100℃高温炉中加热6小时，获得黄色溶液；然后把反应液倒入7000-14000透析袋内透析，透析时间为2天，如此反复5次换水透析(目的是尽量去掉反应中残留的聚合物，以免干扰后续的应用)后，得到浅黄色水溶液，冷冻干燥得到浅黄色的固体粉末。加入2mL二次水而配成浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，以便后续使用。浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，即每毫升碳氮纳米片溶液中含有2mg碳氮纳米片。再进行透射电镜测试并记录其吸收和荧光强度，测试得到碳氮纳米片的尺寸为～100nm，吸收波长365nm，发射波长460nm，分别如图1，2，3。

实施例2：称取1g PEI分散于10mL去离子水中，放置在20mL的反应釜内，在反应温度180℃高温炉中加热6小时，获得黄色溶液；然后把反应液倒入7000-14000透析袋内透析，透析时间为2天，如此反复5次换水透析(目的是尽量去掉反应中残留的聚合物，以免干扰后续的应用)后，得到浅黄色水溶液，冷冻干燥得到浅黄色的固体粉末。加入2mL二次水而配成浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，以便后续使用。浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，即每毫升碳氮纳米片溶液中含有2mg碳氮纳米片。再进行透射电镜测试并记录其吸收和荧光强度，测试得到碳氮纳米片的尺寸～65nm，吸收波长365nm，发射波长460nm，分别如图4，5，6。

实施例3：称取1g PEI分散于10mL去离子水中，放置在20mL的反应釜内，在反应温度220℃高温炉中加热6小时，获得黄色溶液；然后把反应液倒入7000-14000透析袋内透析，透析时间为2天，如此反复5次换水透析(目的是尽量去掉反应中残留的聚合物，以免干扰后续的应用)后，得到浅黄色水溶液，冷冻干燥得到浅黄色的固体粉末。加入2mL二次水而配成浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，以便后续使用。浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，即每毫升碳氮纳米片溶液中含有2mg碳氮纳米片。再进行透射电镜测试并记录其吸收和荧光强度，测试得到碳氮纳米片的尺寸～45nm，吸收波长365nm，发射波长455nm，分别如图7，8，9。

实施例4：称取1g PEI分散于10mL去离子水中，放置在20mL的反应釜内，在反应温度240℃高温炉中加热6小时，获得黄色溶液；然后把反应液倒入7000-14000透析袋内透析，透析时间为2天，如此反复5次换水透析(目的是尽量去掉反应中残留的聚合物，以免干扰后续的应用)后，得到浅黄色水溶液，冷冻干燥得到浅黄色的固体粉末。加入2mL二次水而配成浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，以便后续使用。浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，即每毫升碳氮纳米片溶液中含有2mg碳氮纳米片。再进行透射电镜测试、原子力显微镜测试、紫外可见光谱、荧光分光光度计，测试得到碳氮纳米片的尺寸～20nm、吸收波长330nm、发射波长450nm和高度0.5-1.5nm，分别如图10，11，12，13，此温度下得到的碳化氮荧光强度最高，尺寸最小且分布最均一。

实施例5：称取2g PEI分散于10mL去离子水中，放置在20mL的反应釜内，在反应温度240℃高温炉中加热6小时，获得黄色溶液；然后把反应液倒入7000-14000透析袋内透析，透析时间为2天，如此反复5次换水透析(目的是尽量去掉反应中残留的聚合物，以免干扰后续的应用)后，得到浅黄色水溶液，冷冻干燥得到浅黄色的固体粉末。加入2mL二次水而配成浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，以便后续使用。浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，即每毫升碳氮纳米片溶液中含有2mg碳氮纳米片。

实施例6：称取1g PEI分散于20mL去离子水中，放置在20mL的反应釜内，在反应温度240℃高温炉中加热6小时，获得黄色溶液；然后把反应液倒入7000-14000透析袋内透析，透析时间为2天，如此反复5次换水透析(目的是尽量去掉反应中残留的聚合物，以免干扰后续的应用)后，得到浅黄色水溶液，冷冻干燥得到浅黄色的固体粉末。加入2mL二次水而配成浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，以便后续使用。浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，即每毫升碳氮纳米片溶液中含有2mg碳氮纳米片。

实施例7：称取1g PEI分散于10mL去离子水中，放置在20mL的反应釜内，在反应温度240℃高温炉中加热4小时，获得黄色溶液；然后把反应液倒入7000-14000透析袋内透析，透析时间为2天，如此反复5次换水透析(目的是尽量去掉反应中残留的聚合物，以免干扰后续的应用)后，得到浅黄色水溶液，冷冻干燥得到浅黄色的固体粉末。加入2mL二次水而配成浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，以便后续使用。浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，即每毫升碳氮纳米片溶液中含有2mg碳氮纳米片。

实施例8：称取1g谷胱甘肽GSH分散于15mL去离子水中，放置在100mL的反应釜内，在反应温度240℃高温炉中加热6小时，获得黄色溶液；然后把反应液倒入7000-14000透析袋内透析，透析时间为2天，如此反复5次换水透析(目的是尽量去掉反应中残留的聚合物，以免干扰后续的应用)后，得到浅黄色水溶液，冷冻干燥得到浅黄色的固体粉末。加入2mL二次水而配成浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，以便后续使用。浓度为2mg/mL的碳氮纳米片溶液，即每毫升碳氮纳米片溶液中含有2mg碳氮纳米片，再记录其吸收和荧光强度，吸收波长365nm，发射波长455nm，分别如图14，15。

实施例9：在培养好贴壁细胞(HEGP2)的培养皿中加入PBS缓冲溶液(10mM Mg²⁺，50mM K⁺，pH＝7.4)1mL，再加入实施例4获得的碳氮纳米片溶液100μL(2mg/mL)到培养皿中，孵育2小时后，使用新鲜的PBS缓冲溶液冲洗两次，放置于双光子共聚焦荧光显微镜下成像，得到碳氮纳米片在HEGP2细胞中的双光子成像图片(激发波长为750nm，发射荧光收集范围400-500nm)。如图16。

实施例10：在培养好贴壁细胞(Hela)的培养皿中加入PBS缓冲溶液(10mM Mg²⁺，50mM K⁺，pH＝7.4)1mL，再加入实施例4获得的碳氮纳米片溶液100μL(2mg/mL)到培养皿中，孵育2小时后，使用新鲜的PBS缓冲溶液冲洗两次，放置于双光子共聚焦荧光显微镜下成像，得到碳氮纳米片在Hela细胞中的双光子成像图片(激发波长为750nm，发射荧光收集范围400-500nm)，如图17。

实施例11：在培养好贴壁细胞(SH-SY5Y)的培养皿中加入PBS缓冲溶液(10mM Mg²⁺，50mM K⁺，pH＝7.4)1mL，再加入实施例4获得的碳氮纳米片溶液100μL(2mg/mL)到培养皿中，孵育2小时后，使用新鲜的PBS缓冲溶液冲洗两次，放置于双光子共聚焦荧光显微镜下成像，得到碳氮纳米片在SH-SY5Y细胞中的双光子成像图片(激发波长为750nm，发射荧光收集范围400-500nm)，如图18。