多金簇-去铁蛋白复合物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种多金簇-去铁蛋白复合物，该多金簇-去铁蛋白复合物中含有由24个蛋白质亚基构成的全重链去铁蛋白和生长在所述全重链去铁蛋白上的金纳米团簇。本发明还公开了一种多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法，该方法包括将由24个蛋白质亚基构成的全重链去铁蛋白与氯金酸溶液接触。本发明提供的多金簇-去铁蛋白复合物能够同时具有生物相容性好、近红外荧光特性强、纯度高且金纳米团簇的负载率高的优点，并且本发明提供的多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法操作简单。
【专利说明】多金簇-去铁蛋白复合物及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及荧光纳米材料领域，具体地，涉及一种多金簇-去铁蛋白复合物及多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法。
【背景技术】
[0002]贵金属纳米团簇(NMNCs) —般是指由Au、Ag或Pt等贵金属的几个至几十个原子组成的具有荧光、水溶性的分子级聚集体。NMNCs特有的量子尺寸效应使其光学性质具有随粒径大小而变化的特性，这种特性使得NMNCs的荧光发射光谱在可见光到近红外光区范围内可调节。AiuAg或Pt等金属具有化学惰性且保护基团对生物体的毒副作用小，使得含有此类贵金属的NMNCs具有良好的生物相容性。NMNCs的粒径一般在2nm以下，界于原子和纳米颗粒之间。此外，NMNCs还具有光稳定性强、反聚合能力强、斯托克位移较大且在所有相关时间尺度上无闪烁等特点，大大改善了其作为生物标记物的性能，显著提升了现有分析方法的灵敏度。
[0003]十几年来，国内外的研究学者们对NMNCs的合成方`法做了很大的改进和发展。目前NMNCs的合成方法有多种分类，按照保护基团的不同可分为模板法和单分子层保护法两种。模板法是以一定的材料为基质或模型来合成具有特殊立体结构或具有特殊功能的NMNCs的方法，是目前最常用的方法之一；单分子层保护纳米团簇(MPCs)是指在表面修饰或组装一层分子而形成的具有特定功能的纳米团簇。
[0004]近几年来，对于NMNCs的研究日渐成熟，使得NMNCs在粒径大小、化学及光稳定性方面有了较大提高，研究的重心也开始由简单合成向各种应用转移，如应用于生物传感器、细胞标记、半胱氨酸的检测、蛋白质的检测、大肠杆菌的检测、生物探针等。
[0005]由于以生物材料为模板的贵金属纳米团簇具有生物安全性好、稳定性强、可以用基因工程进行生物修饰改造等优势而受到研究者们的广泛关注。而且以生物材料为模板的贵金属纳米团簇中的生物材料是涉及生物体内各种细胞功能的生物活性物质，并具有良好的生物相容性和可控的生物降解性，降解后的短肽和氨基酸还能被人体吸收。因此，相对于其他纳米材料体系，生物材料有着更为广阔的应用前景。
[0006]但是，在现有的生物材料内进行贵金属团簇的生长还具有操作复杂、近红外荧光特性弱、生物相容性不好、不能精确控制生物材料内多个纳米贵金属团簇的生长等缺陷，依I日是一个难以解决的问题。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种制备方法简便、近红外荧光穿透能力强以及能够精确控制生物材料内多个纳米贵金属团簇的生长的多金簇-去铁蛋白复合物。
[0008]为了实现上述目的，本发明提供了一种多金簇-去铁蛋白复合物，该多金簇-去铁蛋白复合物中含有由24个蛋白质亚基构成的全重链去铁蛋白和生长在所述全重链去铁蛋白上的金纳米团簇。
[0009]本发明还提供了一种多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法，该方法包括将由24个蛋白质亚基构成的全重链去铁蛋白与氯金酸溶液接触。
[0010]本发明还提供了一种按照本发明的制备方法制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物。
[0011]本发明提供的多金簇-去铁蛋白复合物能够同时具有生物相容性好、近红外荧光特性强、纯度高且金纳米团簇的负载率高的优点，并且本发明提供的多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法操作简单。
[0012]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的【具体实施方式】一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0014]图1表示通过冷冻电镜观察本发明实施例1中所得到的多金簇-去铁蛋白复合物的形貌图。
[0015]图2表示通过透射电镜观察本发明实施例1中所得到的多金簇-去铁蛋白复合物中金纳米团簇的高分辨成像。
[0016]图3表示本发明实施例1中所得到的多金簇-去铁蛋白复合物中金纳米团簇中金原子的X-射线能谱图。
[0017]图4表示本发明实施例1中所得到的多金簇-去铁蛋白复合物的荧光激发和发射图谱。
【具体实施方式】
[0018]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0019]在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“溶液”的范围并不限于分散质的粒子直径小于Inm的分散系(真溶液)，而是泛指均一的液态混合物，可以包括胶状分散体(胶体溶液)。
[0020]在本发明中，在未作相反说明的情况下，液体的体积数值均为标准状态下的数值。
[0021]在本发明中，在未作相反说明的情况下，所述的接触或混合可以在搅拌的条件下进行。搅拌的速度可以为常规的选择。
[0022]在本发明中，所述的“全重链去铁蛋白”为由24个重链(H-链)组成的不含铁的铁蛋白，其序列号为:RCSB Protein Data Bank - RCSB PDB:3AJ0。
[0023]本发明提供了一种多金簇-去铁蛋白复合物，该多金簇-去铁蛋白复合物中含有由24个蛋白质亚基构成的全重链去铁蛋白和生长在所述全重链去铁蛋白上的金纳米团簇。
[0024]在本发明中，所述全重链去铁蛋白可以通过本领域内常规使用的各种方法获得，例如可以从大肠杆菌中提取获得，本发明中，优选采用文献(Masaki Uchida等，Targetingof Cancer Cells with Ferrimagnetic Ferritin Cage Nanoparticles, Journal ofAmerican Chemical Society, 2006, Vol28，16626-16633)提供的方法获得全重链去铁蛋白。
[0025]在本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物中，优选地，所述全重链去铁蛋白的蛋白质亚基上具有含有组氨酸的亚铁氧化酶位点。
[0026]在本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物中，优选地，所述金纳米团簇位于全重链去铁蛋白的亚铁氧化酶位点上，或者所述金纳米团簇位于全重链去铁蛋白的亚铁氧化酶位点的周围。
[0027]由本发明提供的上述多金簇-去铁蛋白复合物具有生物相容性好、近红外荧光特性强的优点。
[0028]本发明还提供了一种多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法，该方法包括将由24个蛋白质亚基构成的全重链去铁蛋白与氯金酸溶液接触。
[0029]本发明中，所述全重链去铁蛋白优选以溶液形式提供，溶剂优选为水，更优选全重链去铁蛋白水溶液的浓度为l_20mg/mL。
[0030]本发明的发明点主要在于由上述全重链去铁蛋白与氯金酸溶液接触和/或混合所获得的多金簇-去铁蛋白复合物及其制备方法，本发明仅需要将全重链去铁蛋白与氯金酸溶液接触和/或混合即可得到具有生物相容性好、近红外荧光特性强、纯度高且金纳米团簇的负载率高的多金簇-去铁蛋白复合物，由此可见，本发明提供的多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法操作非 常简单。
[0031]在本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法中，相对每重量份的全重链去铁蛋白，优选所述氯金酸的用量为0.5-4重量份。
[0032]在本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法中，相对每重量份的全重链去铁蛋白，进一步优选氯金酸的用量为1-2重量份。
[0033]在本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法中，优选所述接触的pH值为
11-13;进一步优选 pH 值为 11.5-12.5。
[0034]在本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法中，优选所述接触的温度为4-450C ;进一步优选温度为15-37°C。
[0035]在本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法中，优选所述接触的时间为
12-48小时；进一步优选时间为20-35小时。
[0036]在本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法中，优选所述氯金酸溶液的浓度为10-50毫摩尔/升；进一步优选所述氯金酸溶液的浓度为22-38毫摩尔/升。
[0037]在本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法中，优选该方法还包括将接触后的混合物依次进行离心、超滤和清洗，得到多金簇-去铁蛋白复合物。
[0038]在本发明所述的方法中，对所述离心、超滤和清洗的方法和条件没有特别的限定，可以采用本领域内常规使用的各种方法。例如，可以采用离心机在5000-15000转/分钟的转速下进行离心，然后将离心后所得到的上清液依次进行超滤和清洗。在本发明中，所述超滤的方法有多种，本发明优选采用将离心后所得到的上清液通过超滤管和/或超滤膜进行超滤。本发明优选取适量的去离子水将超滤后所得到的滤液进行清洗。
[0039]根据本发明的一种优选实施方式，所述多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法包括将由24个蛋白质亚基构成的全重链去铁蛋白与氯金酸溶液接触，相对每重量份的全重链去铁蛋白，氯金酸的用量为0.5-4重量份，所述接触的条件包括pH值为11-13，温度为4-45°C，时间为12-48小时，所述氯金酸溶液的浓度为10-50毫摩尔/升。然后将由24个蛋白质亚基构成的全重链去铁蛋白与氯金酸溶液接触后所得到的多金簇-去铁蛋白复合物依次进行离心、超滤和清洗。
[0040]在本发明中，在没有特别说明的情况下，所述“溶液”中的溶剂为水。例如，所述氯金酸溶液即为氯金酸水溶液。
[0041]以下，通过实施例进一步详细说明本发明。其中，在没有特别说明的情况下，所用的试剂均为市售品。
[0042]在本发明的以下实施例中，所使用的氯金酸的CAS号为16961-25-4，购自sigma公司；
[0043]所使用的去离子水为国家纳米科学中心生物安全与效应实验室自制的去离子水；
[0044]所使用的离心机牌号为XIR，购自Thermo公司；
[0045]所使用的50KD超滤管货号UFC801096，购自MIlipore公司；
[0046]所使用的冷冻电镜FEI Titan Krios，购自FEI公司；
[0047]所使用的高分辨透射电镜FEI Tecnai F20U-TWIN，购自FEI公司；
[0048]所使用的X-射线能谱测量仪的型号FEI Tecnai F20U-TWIN，购于FEI公司；
[0049]所使用的荧光分光光度计的型号为日立F-4600，购于HITACHI公司。
[0050]制备例I
[0051 ] 本制备例用于获得本发明所述的全重链去铁蛋白。
[0052]米用文献(MasakiUchida等，Targeting of Cancer Cells with FerrimagneticFerritin Cage Nanoparticles, Journal of American Chemical Society，2006， Vol28，16626-16633)提供的方法获得全重链去铁蛋白，所不同的是，在本制备例中将全重链去铁蛋白的表达菌株于37°C培养至OD=0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG于37°C下诱导表达4小时。每升菌得到纯化的蛋白在50mg以上，纯度为97.2%。
[0053]全重链去铁蛋白溶液的浓度通过280nm处的吸光度来确定，其浓度为10mg/mL，共提取lOOmg，纯度为97.2%。
[0054]制备例2
[0055]本制备例用于获得本发明所述的氯金酸溶液。
[0056]取5份Ig/份的氯金酸,分别溶于60mL、45mL、50mL、75mL和120mL的去离子水中，然后用浓度为0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液调PH值到7，分别得到30毫摩尔/升、45毫摩尔/升、38毫摩尔/升、22毫摩尔/升和12毫摩尔/升的氯金酸溶液，备用。
[0057]实施例1
[0058]本实施例用于说明本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物A及其制备方法。
[0059]取制备例2所得的30毫摩尔/升的氯金酸溶液3.025mL,加入到5mL制备例I所得5mg/mL的全重链去铁蛋白水溶液中。用浓度为0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液调PH到12，在37°C的恒温培养箱中振荡孵育24小时后，将所得到的溶液转入离心机中以7500转/分钟的速度离心10min，取上清液。然后将所得到的上清液通过50KD超滤管进行超滤，再用适量去离子水清洗超滤后所得到的溶液，重复该清洗步骤3次，以除去溶液中可能含有的氯金酸，得到纯度为97.5%的多金簇-去铁蛋白复合物A。
[0060]通过冷冻电镜可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物A的内部有多个金纳米团簇，如附图1所示。
[0061]通过高分辨透射电镜可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物A的内部的金纳米团簇的晶格结构，如附图2所示。
[0062]通过X-射线能谱测量仪可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物A的内部的金纳米团簇中金元素的X射线能谱，如附图3所示。
[0063]实施例2
[0064]本实施例用于说明本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物B及其制备方法。
[0065]取制备例2所得的22毫摩尔/升的氯金酸溶液2.758mL,加入到5mL制备例I所得5mg/mL的全重链去铁蛋白水溶液中。用氢氧化钠调PH到11.5，在30°C恒温的水浴箱中振荡孵育20小时后，将所得到的溶液转入离心机中以10000转/分钟的速度离心10min，取上清液。然后将所得到的上清液通过50KD超滤管进行超滤，再用适量去离子水清洗超滤后所得到的溶液，重复该清洗步骤3次，以除去溶液中可能含有的氯金酸，得到纯度为97.3%的多金簇-去铁蛋白复合物B。
[0066]通过冷冻电镜可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物B的内部有多个金纳米团簇，与多金簇-去铁蛋白复合物A类似。
[0067]通过高分辨透射电镜可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物B的内部的金纳米团簇的晶格 结构，与多金簇-去铁蛋白复合物A类似。
[0068]通过X-射线能谱测量仪可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物B的内部的金纳米团簇中金元素的X射线能谱，与多金簇-去铁蛋白复合物A类似。
[0069]实施例3
[0070]本实施例用于说明本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物C及其制备方法。
[0071]取制备例2所得的38毫摩尔/升的氯金酸溶液3.194mL,加入到5mL制备例I所得5mg/mL的全重链去铁蛋白水溶液中。用氢氧化钠调PH到12.5，在30°C恒温的水浴箱中振荡孵育35小时后，将所得到的溶液转入离心机中以8000转/分钟的速度离心10min，取上清液。然后将所得到的上清液通过50KD超滤管进行超滤，再用适量去离子水清洗超滤后所得到的溶液，重复该清洗步骤3次，以除去溶液中可能含有的氯金酸，得到纯度为97.6%的多金簇-去铁蛋白复合物C。
[0072]通过冷冻电镜可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物C的内部有多个金纳米团簇，与多金簇-去铁蛋白复合物A类似。
[0073]通过高分辨透射电镜可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物C的内部的金纳米团簇的晶格结构，与多金簇-去铁蛋白复合物A类似。
[0074]通过X-射线能谱测量仪可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物C的内部的金纳米团簇中金元素的X射线能谱，与多金簇-去铁蛋白复合物A类似。
[0075]实施例4
[0076]本实施例用于说明本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物D及其制备方法。
[0077]本实施例采用与实 施例1相同的方法制备得到多金簇-去铁蛋白复合物D，所不同的是:[0078]取制备例2所得的45毫摩尔/升的氯金酸溶液0.674mL加入到全重链去铁蛋白水溶液中接触反应。
[0079]得到的多金簇-去铁蛋白复合物D的纯度为95.0%。
[0080]通过冷冻电镜可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物D的内部有多个金纳米团簇，但是在黄色的多金簇-去铁蛋白复合物D的溶液中可以看到有少量的红色杂质。
[0081]通过高分辨透射电镜可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物D的内部的金纳米团簇的晶格结构，与多金簇-去铁蛋白复合物A类似。
[0082]通过X-射线能谱测量仪可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物D的内部的金纳米团簇中金元素的X射线能谱，与多金簇-去铁蛋白复合物A类似。
[0083]实施例5
[0084]本实施例用于说明本发明所述的多金簇-去铁蛋白复合物E及其制备方法。
[0085]本实施例采用与实施例1相同的方法制备得到多金簇-去铁蛋白复合物E，所不同的是:
[0086]取制备例2所得的12毫摩尔/升的氯金酸溶液20.227mL加入到全重链去铁蛋白水溶液中接触反应。
[0087]得到的多金簇-去铁蛋白复合物E的纯度为96.5%。
[0088]通过冷冻电镜可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物E的内部有多个金纳米团簇，但是在黄色的多金簇-去铁蛋白复合物E的溶液中可以看到有少量的红色杂质。
[0089]通过高分辨透射电镜可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物E的内部的金纳米团簇的晶格结构，与多金簇-去铁蛋白复合物A类似。
[0090]通过X-射线能谱测量仪可以看到上述制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物E的内部的金纳米团簇中金元素的X射线能谱，与多金簇-去铁蛋白复合物A类似。
[0091]测试例I
[0092]本测试例采用荧光分光光度计测定由上述实施例1制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物A (Au-HFt)的近红外荧光穿透能力，其荧光激发和发射图谱如图4所示。
[0093]从图4中可以看出采用本发明实例I提供的方法制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物A的近红外荧光穿透能力强，荧光特性好，它的荧光激发峰在720nm左右，发射峰在81 Onm左右。
[0094]测试例2-5
[0095]采用与测试例I相同的方式测定由上述实施例2-5制备得到的多金簇-去铁蛋白复合物B、多金簇-去铁蛋白复合物C、多金簇-去铁蛋白复合物D、多金簇-去铁蛋白复合物E，测得上述多金簇-去铁蛋白复合物的近红外荧光穿透能力，其荧光激发和发射图谱与多金簇-去铁蛋白复合物A相似。
[0096]通过以上检测和分析可以得知，本发明提供的多金簇-去铁蛋白复合物的纯度高、近红外荧光穿透能力、金纳米团簇的负载率高，而本发明提供的制备多金簇-去铁蛋白复合物的方法操作简便。
[0097]以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0098]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0099]此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视 为本发明所公开的内容。
【权利要求】
1.一种多金簇-去铁蛋白复合物，其特征在于，该多金簇-去铁蛋白复合物中含有由24个蛋白质亚基构成的全重链去铁蛋白和生长在所述全重链去铁蛋白上的金纳米团簇。
2.根据权利要求1所述的多金簇-去铁蛋白复合物，其中，所述全重链去铁蛋白的蛋白质亚基上具有含有组氨酸的亚铁氧化酶位点。
3.根据权利要求1或2所述的多金簇-去铁蛋白复合物，其中，所述金纳米团簇位于全重链去铁蛋白的亚铁氧化酶位点上，或所述金纳米团簇位于全重链去铁蛋白的亚铁氧化酶位点周围。
4.一种多金簇-去铁蛋白复合物的制备方法，其特征在于，该方法包括将由24个蛋白质亚基构成的全重链去铁蛋白与氯金酸溶液接触。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，相对每重量份的全重链去铁蛋白，所述氯金酸的用量为0.5-4重量份,优选为1-2重量份。
6.根据权利要求4所述的方法，其中，所述接触的条件包括pH值为11-13，温度为4-45°C，时间为12-48小时。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述接触的条件包括pH值为11.5-12.5，温度为15-37°C，时间为20-35小时。
8.根据权利要求4-7中任意一项所述的方法，其中，所述氯金酸溶液的浓度为10-50毫摩尔/升，优选为22-38毫摩尔/升。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，该方法还包括将接触后的混合物依次进行离心、超滤和清洗，得到多金族_去铁蛋白复合物。
10.权利要求4-9中任意一项所`述的方法得到的多金簇-去铁蛋白复合物。
【文档编号】C09K11/58GK103880931SQ201410103174
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月19日 优先权日:2014年3月19日
【发明者】聂广军, 孙翠骥, 袁嫕 申请人:国家纳米科学中心