专利名称：一种汉族人肾肉瘤样癌细胞系及其制备方法
技术领域：
本发明属微生物动物细胞系领域，具体涉及一种汉族人肾肉瘤样癌细胞系 RCC09HYF，及其制备方法。
背景技术：
肿瘤细胞系在肿瘤的基础研究中具有重要的地位，采用细胞系进行体外实验及体内动物模型的构建，对于在后基因组时代即功能基因组时代，挖掘重要基因的潜在功能至关重要。由于细胞系具有比较恒定的遗传背景，因此细胞系仍是目前完成基因功能的体外检测和验证的重要工具。人癌细胞的体外培养，不仅能从分子、基因水平深入研究肿瘤发生和发展机理，而且对临床的早期诊断、药物筛选和肿瘤治疗具有重要意义，如sunitinib malate治疗转移性肾透明细胞癌目前进入了 III期临床实验，之前该药物在786-0等肾癌细胞系的作用机制的深入研究起到了奠基作用。肾肉瘤样癌是肾脏恶性肿瘤的特殊类型，仅占肾实质肿瘤的1.0% -8.0%，临床少见，瘤体具有浸润性生长的生物学特性，恶性程度高，病程进展迅速，转移通常发生早，多数患者对放化疗不敏感，预后极差。Tl患者的平均生存期为49. 7个月，T2-T4患者的平均生存期为6. 8个月。1968年Farrow等首先发现并命名为肉瘤样癌(Farrow GM, Harrison EG,UTZ DG. Sarcomas and sarcomatoid and mixed malignant tumors of the kidney in adults-Part III. Cancer 1968,22 :556-563)。该肿瘤成分中，上皮部分可以是各种病理类型的肾细胞癌，70%为透明细胞癌或颗粒细胞癌；肉瘤样部分可以表现为血管外皮肉瘤样、 横纹肌肉瘤样、骨肉瘤样、软骨肉瘤样及未分化肉瘤样等结构。目前肾肉瘤样癌的诊断水平和治疗效果没有突破性进展，早期发现并进行根治性手术治疗仍然是首选的诊断治疗方案。临床上证实少部分肾肉瘤样癌病例对细胞因子治疗有一定效果，但属于个案报道，尚未得到临床实验的证据。由于肾肉瘤样癌中，肉瘤样结构与上皮结构的混合比例直接影响了患者预后及系统治疗，肉瘤样结构占的比例越高，患者预后越差，系统治疗越困难。为了阐明肾肉瘤样癌的遗传特性，特别是肉瘤样结构与上皮结构部分的相互作用在肾细胞癌恶性进展中发生的作用，从而指导临床的系统治疗，建立体外肾肉瘤样癌细胞模型是必经之路也是当务之急。目前，ATCC尚未收录任何有关肾肉瘤样癌的细胞系，鉴于全世界人种的遗传背景和生活条件的差异，肿瘤发病率和病死率也有所不同，对汉族人新鲜肾肉瘤样癌细胞的培养及细胞系的建立是研究中国人肾癌转移机制的重要步骤，具有切实的科学意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种汉族人肾肉瘤样癌细胞系。本发明应用体外细胞培养技术建立人肾肉瘤样癌细胞系，采用细胞株作为实验对象，分析肿瘤细胞的生长、转移等生物学行为特点，为进一步研究汉族人肾细胞癌发生和转移机制，为临床预测、诊断及治疗提供有效且稳定的细胞模型。
本发明提供一种汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF，其保藏号为CCTCC C201130, 于2011年5月11日保藏于中国典型培养物保藏中心。本发明还提供了上述汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF的制备方法，包括以下步骤本发明的RCC09HYF细胞取自一位汉族肾肉瘤样癌患者的肾原位肿瘤组织。将切除的肿瘤组织放入盛有少量无血清DMEM培养基(含1000单位/ml青霉素，3 μ g/ml两性霉素B)的细胞培养平皿中，剔除坏死组织、脂肪结缔组织、血管等，随后将可肉眼分辨的肿瘤组织块于4°C下浸泡于无血清的DMEM培养基中。30min后，将组织块用眼科剪剪成l_3mm3 的小块，将组织块随同浸泡液转移至离心管中，反复摇晃清洗2-aiiin，1500转/分，离心 IOmin0弃上清，重新加入DMEM培养基悬浮组织块，反复摇晃清洗2_;3min，1500转/分，离心lOmin，弃上清。用Iml的DMEM完全培养基(DMEM培养基，10%胎牛血清，青霉素100单位/ml，链霉素100 μ g/ml)重悬组织块，并接种到玻璃细胞培养瓶(IOOml)中。将培养瓶置于37°C ,5% C02，95%湿度的(X)2培养箱中培养Mh。24h组织块贴壁后补充加入DMEM完全培养基2-2. 5ml继续培养。本发明的汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF的具体制备方法如下1.原代培养无菌条件下，取行肾癌根治术患者的肾原位肿瘤组织(后病理鉴定为肾肉瘤样癌)，放入盛有少量无血清DMEM培养基(含1000单位/ml青霉素，3 μ g/ml两性霉素B)的细胞培养平皿中，剔除坏死组织、脂肪结缔组织、血管等，随后将可肉眼分辨的肿瘤组织块于4°C下浸泡于无血清的DMEM培养基中。30min后，将组织块用眼科剪剪成l_3mm3的小块， 将组织块随同浸泡液转移至离心管中，反复摇晃清洗2-;3min，1500转/分，离心lOmin。弃上清，重新加入DMEM培养基悬浮组织块，反复摇晃清洗2-aiiin，1500转/分，离心lOmin， 弃上清。用Iml的DMEM完全培养基重悬组织块，并接种到玻璃细胞培养瓶(IOOml)中。将培养瓶置于37°C，5% C02，95%湿度的(X)2培养箱中培养Mh。24h组织块贴壁后补充加入 DMEM完全培养基2-2. 5ml继续培养。2.传代当细胞从组织块中爬出，并有85%以上融合的时候，进行细胞传代。在超净工作台内，于无菌条件下，吸除培养瓶内培养液。用少量D-hanks液清洗培养瓶2次后，加入0. 25% 胰酶1ml，置37°C，5% C02，95%湿度的(X)2培养箱中4-5min。待镜下观察大部分细胞的细胞质回缩、细胞间隙增大时(甚至看到有个别细胞漂浮起来)，加入DMEM完全培养基中和，反复吹打贴壁的细胞，形成单细胞悬液。3.冻存与复苏冻存冻存前24h更换新鲜的DMEM完全培养基，使细胞处于指数生长期。在超净工作台内，于无菌条件下，吸除培养瓶内培养液。用D-hanks液清洗培养瓶2次后，加入 0. 25%胰酶1ml，置37°C，5% C02，95%湿度的(X)2培养箱中4-5min。待镜下观察大部分细胞的细胞质回缩、细胞间隙增大时(甚至看到有个别细胞漂浮起来)，加入DMEM完全培养基細1，反复吹吸贴壁的细胞，形成单细胞悬液。将细胞悬液收集至离心管中，室温下1500rpm 离心IOmin收集培养细胞。弃上清，细胞沉淀用1.5ml冻存液悬浮，计数，调整至5 X IO6/ ml。移入冻存管，将冻存管口封严。贴上标签，注明细胞种类、冻存日期、冻存者。冻存管置于-80°C 12h以上，次日移入液氮。复苏从液氮中取出冻存管、迅速置于37°C温水中。待冻存管中的冻存物融化成液体后，将细胞悬液吸至离心管中，1500rpm离心lOmin，弃去上清液。沉淀加5ml DMEM完全培养基，吹打均勻至单细胞悬液(细胞浓度5 X 105/ml)，转移至培养瓶中，置37°C，5% CO2, 95%湿度的(X)2培养箱中培养。目前中国典型培养物保藏中心保藏的是我们培养的第64代、69代RCC09HYF。本发明涉及到的培养液配方如下D-Hanks 液=NaCl 8. Og, KCl 0. 4g, Na2HPO4 12H20 0. 08g, KH2PO4 0. 06g, NaHCO3 0. !35g，l%酚红anl，超纯水溶解并定容至1000ml。121°C 30min灭菌，4°C保存。DMEM培养基Hyclone，hvitrogen (高糖，添加丙酮酸钠及L-谷氨酰胺)。DMEM完全培养基DMEM培养基，10 %胎牛血清，青霉素100单位/ml，链霉素 100μ g/ml。冻存液(使用前现配)采用胎牛血清添加二甲基亚砜(DMSO)配制冻存液，其体积比 14-20 1。本发明的汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF，能在体外长期生长和稳定传代， 呈双相分化特征，由肉瘤样结构和上皮样结构(主要为透明细胞癌)，失去接触抑制； RCC09HYF染色体为异倍体，染色体数目主要集中在55-68，染色体众数为63，染色体的数目及结构均有畸变 ’经历12个月传120代，群体倍增时间为18h，集落形成率为31% ；免疫组化分析 RCC09HYF 对应肿瘤，显示 Vimentin、CD10、CAM、Ki67 呈强阳性，ABC、CACP、HMB、P53、 SMA阴性。本发明的汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF，经体外原位动物模型致瘤实验发现，动物体内成瘤速度较快，接种瘤体3-4周后，50%以上的裸鼠移植瘤充满整个腹腔，恶液质，个别已存在肺转移。冻存后复苏率达80%以上，复苏后的细胞生长状态与原培养细胞一致。采用本发明的汉族人肾肉瘤样癌细胞系细胞作为实验对象，可以分析肿瘤细胞的生长特性，及肿瘤细胞的侵袭、转移等相关恶性生物学行为及发生机制，为进一步研究汉族人肾肉瘤样癌的发生及转移，为临床预测、诊断及治疗提供有效且稳定的细胞模型。本发明的汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF，为进行肾肉瘤样癌的早期发现、有效治疗筛选特异的标志物和治疗靶点。
图1为RCC09HYF的12代细胞于光学显微镜下观察QOO X)，细胞均呈贴壁生长， 培养早期细胞形态及其不规则，失去接触抑制，呈双相分化特征(A)，细胞异质性明显(B)， 部分细胞呈现肉瘤样结构(蓝色箭头所指)，部分细胞呈现上皮样结构——透明细胞癌(红色箭头所指)。图2为RCC09HYF细胞生长曲线。图3为RCC05HYF HE染色。细胞大，核膜、核仁轮廓明显，核仁清晰，胞质少，核糖体颗粒丰富，大部分细胞双核或多核，核质比例倒置。箭头所指为细胞双核的现象。 图4为RCC05HYF对应的肿瘤组织HE染色分析。部分为肉瘤样结构(A)，上皮样结构主要以透明细胞癌为主(B)。图5为RCC05HYF对应的肿瘤组织免疫组化分析显示CAM、Vimentin、CD10、Ki67呈
强阳性。图6为RCC05HYF染色体核型分析图。从图中可见，RCC05HYF细胞存在超二倍体情况，许多染色体均超过了 2条。
具体实施例方式下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1 汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF的获得1.原代培养无菌条件下，取行肾癌根治术患者的肾原位肿瘤组织(后病理鉴定为肾肉瘤样癌)，放入盛有少量无血清DMEM培养基(含1000单位/ml青霉素，3 μ g/ml两性霉素B)的细胞培养平皿中，剔除坏死组织、脂肪结缔组织、血管等，随后将可肉眼分辨的肿瘤组织块于4°C下浸泡于无血清的DMEM培养基中。30min后，将组织块用眼科剪剪成l_3mm3的小块， 将组织块随同浸泡液转移至离心管中，反复摇晃清洗2-;3min，1500转/分，离心lOmin。弃上清，重新加入DMEM培养基悬浮组织块，反复摇晃清洗2-aiiin，1500转/分，离心lOmin， 弃上清。用Iml的DMEM完全培养基重悬组织块，并接种到玻璃细胞培养瓶(IOOml)中。将培养瓶置于37°C，5% C02，95%湿度的(X)2培养箱中培养Mh。24h组织块贴壁后补充加入 DMEM完全培养基2-2. 5ml继续培养。2.传代当细胞从组织块中爬出，并有85%以上融合的时候，进行细胞传代。在超净工作台内，于无菌条件下，吸除培养瓶内培养液。用少量D-hanks液清洗培养瓶2次后，加入0. 25% 胰酶1ml，置37°C，5% C02，95%湿度的(X)2培养箱中4-5min。待镜下观察大部分细胞的细胞质回缩、细胞间隙增大时(甚至看到有个别细胞漂浮起来)，加入DMEM完全培养基中和，反复吹打贴壁的细胞，形成单细胞悬液。3.冻存与复苏冻存冻存前24h更换新鲜的DMEM完全培养基，使细胞处于指数生长期。在超净工作台内，于无菌条件下，吸除培养瓶内培养液。用D-Hanks液清洗培养瓶2次后，加入 0. 25%胰酶1ml，置37°C，5% C02，95%湿度的(X)2培养箱中4-5min。待镜下观察大部分细胞的细胞质回缩、细胞间隙增大时(甚至看到有个别细胞漂浮起来)，加入DMEM完全培养基細1，反复吹吸贴壁的细胞，形成单细胞悬液。将细胞悬液收集至离心管中，室温下1500rpm 离心IOmin收集培养细胞。弃上清，细胞沉淀用1.5ml冻存液悬浮，计数，调整至5 X IO6/ ml。移入冻存管，将冻存管口封严。贴上标签，注明细胞种类、冻存日期、冻存者。冻存管置于-80°C 12h以上，次日移入液氮。复苏从液氮中取出冻存管、迅速置于37°C温水中。待冻存管中的冻存物融化成液体后，将细胞悬液吸至离心管中，1500rpm离心lOmin，弃去上清液。沉淀加5ml DMEM完全培养基，吹打均勻至单细胞悬液(细胞浓度5 X 105/ml)，转移至培养瓶中，置37°C，5% CO2,95%湿度的(X)2培养箱中培养。本发明涉及到的培养液配方如下D-Hanks 液=NaCl 8. 0g, KCl 0. 4g, Na2HPO4 12H20 0. 08g, KH2PO4 0. 06g, NaHCO3 0. !35g，l%酚红anl，超纯水溶解并定容至1000ml。121°C 30min灭菌，4°C保存。DMEM培养基Hyclone，Invitrogen (高糖，添加丙酮酸钠及L-谷氨酰胺)。DMEM完全培养基DMEM培养基，10 %胎牛血清，青霉素100单位/ml，链霉素 100μ g/ml。冻存液(使用前现配)采用胎牛血清添加二甲基亚砜(DMSO)配制冻存液，其体积比 14-20 1。实施例2 本发明的汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF的生长及遗传特性鉴定。1.细胞形态学观察原代培养成功后，常规进行细胞传代，能在体外长期生长和稳定传代，经历12个月传120代。倒置显微镜镜下观察第12代O00X)，可见细胞均呈贴壁生长，培养早期细胞形态及其不规则，失去接触抑制，呈双相分化特征(图1-A)，细胞异质性明显(图1-B)，部分细胞呈现肉瘤样结构(图1-B，蓝色箭头所指)，部分细胞呈现上皮样结构——透明细胞癌(图1-B，红色箭头所指)。 2. RCC09HYF细胞生长曲线将5 X IO4个细胞接种到24孔板中，加2ml的1640完全培养基，共接种21个孔。 以后每隔一天消化3个孔并进行细胞计数。计算细胞数量的平均数和标准差，绘制细胞生长曲线(图2)。从图中可见细胞在第1-4天成对数生长，到第5天后达到平台期，倍增时间为 18h。3. RCC05HYF HE 染色将处于对数生长期的RCC09HYF细胞取出后，PBS清洗，浸入95%酒精固定。PBS清洗后，采用苏木素染液及伊红染液染色，随后梯度酒精脱色、固定、中性树胶封片，显微镜观察结果。镜下观察，细胞大，核膜、核仁轮廓明显，核仁清晰，胞质少，核糖体颗粒丰富，大部分细胞双核或多核，核质比例倒置。箭头所指为细胞双核的现象。4. RCC09HYF软琼脂克隆形成分析(以6孔板的单个孔为分析单位)首先制备下层琼脂采用1.8%的琼脂糖、2XDMEM、100XL-谷氨酰胺、100X青链霉素、胎牛血清等配制成终浓度为0. 6%的混合体系，待其凝固。将RCC09HYF细胞消化后，计数，制成5000/ml的细胞悬液。随后制备上层琼脂采用1.8%的琼脂糖、2XDMEM、 100XL-谷氨酰胺、100X青链霉素、胎牛血清等配制成终浓度为0.3%的混合体系，并与 500 μ 1细胞悬液充分混合，立即倾注于下层琼脂上，待其凝固后置C02培养箱中培养。15 天后MTT染色观察计算集落形成率。镜下观察，随机选择10个视野，计算每个视野中的集落形成率=含有10个以上细胞数的克隆/接种细胞数X 100。经15天的培养，RCC09HYF 的克隆形成率为31%。5. RCC09HYF对应的肿瘤组织HE染色及免疫组化分析按照第二军医大学伦理委员会的规定，经患者知情同意后，取该患者肿瘤组织标本。常规4 μ m石蜡切片，贴在涂有切片粘合剂的干净载玻片上，58°C烤18小时，常规二甲苯脱蜡至水。一部分进行HE染色，镜下观察(图4)，部分为肉瘤样结构(图4-A)，上皮样结构主要以透明细胞癌为主(图4-B)。另一部分进行免疫组化分析采用0. lmol/L PBS (PH =7.4)对脱蜡后的切片进行清洗。95°C抗原修复(AR) 10分钟，自然冷却，PBS清洗。一抗 (Vimentin、CD10、CAM、Ki67、ABC、CACP、HMB、P53、SMA) 4°C孵育过夜，PBS 清洗。0. 3% H202 抑制内源性过氧化物酶。二抗37°C孵育30分钟，PBS清洗。0. 05%DAB+0. 03%H202显色 8-12分钟，自来水充分冲洗终止反应。苏木素衬染30s，水洗，蓝化(37°C ),0. 5%盐酸乙醇分化，水洗蓝化。常规树脂封片。观察阳性产物为棕黄色或呈棕褐色，背景为紫蓝色。结果显示Vimentin、CD10、CAM、Κ 67 呈强阳性(图 5)，ABC、CACP、HMB、P53、SMA 阴性。6.染色体显示和结构分析取处于指数生长期、80% -90%融合单层培养的细胞。加秋水仙素阻抑中期分裂， 使其在培养基中最终浓度为0. 04-0. 1 μ g/ml培养基，C02培养箱中继续培养4小时。经过固定染色后，对30个处于分裂中期的细胞染色体进行计数，RCC09HYF细胞系染色体数目主要集中在55-68，染色体众数为63，提示存在超二倍体的情况。同时采用R带显色法分析染色体结构(鄂征主编，组织培养和分子细胞学技术，北京出版社，出版日期2001-1-1)。表1-2为RCC05HYF染色体核型分析结果。对30个处于分裂中期的细胞染色体进行分析，对异常情况进行计数，超过10个分裂相的异常情况如表1、表2所示第1号染色体存在缺失，检出率为90. 0%。第7、9、10、11、12号染色体普遍存在超二倍体情况，检出率分别为96. 7%U00%,83. 3%,96. 7%U00% ；第9、11、12号染色体同时存在结构异常， 检出率分别为100^^56.7^^63.3 ^此外，第1、2号染色体普遍存在结构异常，del (1) (qter — p31 )，del (2) (pter — q33 )，检出率均为 93. 3% (28/30)。表1 RCC09HYF细胞染色体数目异常分析(异常超过10个分裂相)
权利要求
1.汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF，其保藏号为CCTCCC201130。
2.根据权利要求1所述的汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF的制备方法，包括以下步骤将切除的汉族肾肉瘤样癌患者的肾原位肿瘤组织块放入盛有少量无血清含1000单位 /ml青霉素和3 μ g/ml两性霉素B的DMEM培养基的细胞培养平皿中，剔除坏死组织、脂肪结缔组织和血管，将肿瘤组织块于4°C下浸泡于无血清的DMEM培养基中；30分钟后，将肿瘤组织块用剪成l_3mm3的小块，将肿瘤组织块随同浸泡液转移至离心管中，反复摇晃清洗2-3 分钟，1500转/分，离心10分钟；弃上清，重新加入DMEM培养基悬浮组织块，反复摇晃清洗 2-3分钟，1500转/分，离心10分钟，弃上清；用Iml的DMEM完全培养基重悬组织块，并接种到玻璃细胞培养瓶中；将培养瓶置于37°C，5% C02，95%湿度的CO2培养箱中培养对小时；组织块贴壁后补充加入DMEM完全培养基2-2. 5ml继续培养；DMEM完全培养基的配方为 DMEM培养基，10%胎牛血清，青霉素100单位/ml，和链霉素100 μ g/ml。
3.根据权利要求2所述的汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF的制备方法，具体步骤如下A、原代培养无菌条件下，取行肾癌根治术患者的肾原位肿瘤组织，放入盛有少量无血清含1000单位/ml青霉素和3 μ g/ml两性霉素B的DMEM培养基的细胞培养平皿中，剔除坏死组织、脂肪结缔组织、血管等，随后将可肉眼分辨的肿瘤组织块于4°C下浸泡于无血清的DMEM培养基中；30分钟后，将组织块用眼科剪剪成l-3mm3的小块，将组织块随同浸泡液转移至离心管中，反复摇晃清洗2-3分钟，1500转/分，离心10分钟；弃上清，重新加入DMEM培养基悬浮组织块，反复摇晃清洗2-3分钟，1500转/分，离心10分钟，弃上清；用Iml的DMEM完全培养基重悬组织块，并接种到玻璃细胞培养瓶中；将培养瓶置于37°C，5% C02，95%湿度的 CO2培养箱中培养M小时；对小时组织块贴壁后补充加入DMEM完全培养基2-2. 5ml继续培养；DMEM完全培养基的配方为DMEM培养基，10%胎牛血清，青霉素100单位/ml，和链霉素 100 μ g/ml ；B、传代当细胞从组织块中爬出，并有85%以上融合的时候，进行细胞传代；在超净工作台内， 于无菌条件下，吸除培养瓶内培养液；用少量D-hanks液清洗培养瓶2次后，加入0. 25%胰酶1ml，置37°C，5% C02，95%湿度的(X)2培养箱中4_5分钟；待镜下观察大部分细胞的细胞质回缩、细胞间隙增大时，加入DMEM完全培养基中和，反复吹打贴壁的细胞，形成单细胞悬液；D-Hanks 液的配方为 NaCl 8. 0g, KCl 0. 4g, Na2HPO4 12H20 0. 08g, KH2PO4 0. 06g, NaHCO3 0. 35g，酚红^il，超纯水溶解并定容至1000ml，121°C 30min灭菌，4°C保存。
全文摘要
本发明属微生物动物细胞系领域。肾肉瘤样癌是肾脏恶性肿瘤的特殊类型，仅占肾实质肿瘤的1.0％-8.0％，临床少见，目前，ATCC尚未收录任何有关肾肉瘤样癌的细胞系。本发明提供一种汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF，其保藏号为CCTCC C201130，本发明还提供了制备方法。本发明的汉族人肾肉瘤样癌细胞系RCC09HYF，能在体外长期生长和稳定传代，具有上皮样细胞形态，失去接触抑制；细胞为异倍体，染色体数目和结构畸变；免疫组化分析RCC09HYF对应的肿瘤组织，显示Vimentin、CD10、CAM、Ki67呈强阳性，ABC、CACP、HMB、P53、SMA阴性；经体外原位动物模型致瘤实验发现，动物体内成瘤速度较快，接种瘤体3-4周后，50％以上的裸鼠移植瘤充满整个腹腔，恶液质，个别已存在肺转移。本发明可为进一步研究汉族人肾肉瘤样癌的发生和转移机制，为临床预测、诊断及治疗提供有效且稳定的细胞模型。
文档编号C12N5/09GK102286429SQ20111020255
公开日2011年12月21日 申请日期2011年7月20日 优先权日2011年7月20日
发明者关蔚, 常文军, 曹广文, 谭晓*, 韩一芳 申请人:中国人民解放军第二军医大学