专利名称：一种菊粉染料标记物的制备及其应用的利记博彩app
一种菊粉染料标记物的制备及其应用技术领域一种菊粉染料标记物的制备及其应用，属于生物技术领域，特别涉及高产 内切菊粉酶菌株的筛选与选育。
技术背景菊粉是一种存在于植物体内天然的储藏性碳水化合物。它属果聚糖，是由(3-呋喃果糖以卩-2， 1 -糖苷键相连，在其还原端接一个葡萄糖基，呈直链结构， 分子量在3500 -5500之间。菊芋、菊苣、蒲公英、牛蒡和朝鲜蓟中含有大量的 菊粉。菊粉酶(P-2,1 - D-果聚糖酶)催化植物中的果聚糖水解，根据其作用方式不 同分为两类， 一是内切菊粉酶(Endoinulinase,EC3.2. 1.7)，主要水解产物是低 聚果糖；另一类是外切菊粉酶(Exoinulinase ， EC 3. 2. 1. 80)，水解产物主要为果 糖。菊粉酶广泛存在于植物和微生物中，它为果糖、高果糖浆及低聚果糖的生 产提供了广阔的前景，具有巨大的工业应用潜力。微生物是菊粉酶最方便生产来源。筛选产内切菊粉酶的菌株是工业生产功 能性食品配料的关键。为筛选水解菊粉的微生物及对菊粉水解酶进行分子水平 上的操作，完善、快速、有效的平板筛选技术的应用非常必要。传统己有的基 于菊粉酶与底物作用的平板筛选技术是基于菊粉的溶解性，如Vullo. D. et al.(1991)报道的将培养后的培养基置于5。C， 7天以促进未水解的菊粉沉淀产生 晕轮，但这方法显色时间长、工作量大、耗时，不适合大量的筛选工作。还有 较快的方法是培养后，用乙醇或丙酮在培养基上流淌，促进未水解的菊粉沉淀 产生晕轮，这方法仍然存在很多缺点，容易造成污染和菌株的死亡、鉴定方法 烦琐和分辨力不强等。考虑到上面提到的现有方法的局限性，需要有一种能应 用于平板筛选的标记底物。通过染料着色标记菊粉可快速完成初步筛选工作。 发明内容本发明的目的是提供一种菊粉染料标记物的制备及其应用方法，以便简单、 快捷、直观、灵敏的初步筛选内切菊粉酶产生菌。本发明的技术方案 一种菊粉染料标记物的制备方法，以活性染料与菊粉 共价偶合制备菊粉染料标记物；(1) 将活性染料与菊粉分别溶解成溶液；(2) 将上述两种溶液混合，使染料浓度为lg/L 5g/L和菊粉浓度为40 g/L 100g/L;(3) 将混合溶液置于40°C ~ 60'C下搅拌0.5 h l h;;(4) 在(3)过程中，分3次加入Na2S04，使其浓度为10g/L 50g/L;(5) 再加入Na2C03或其它碱性无机盐，使溶液pH值为8 10;并继续在 40°C ~ 60。C下搅拌0.5 h 1 h;(6) 溶液冷却，加入溶液体积计2~3倍的95%的乙醇进行沉淀，5000g、 4°C ~ 6'C离心15 min ~30 min，取沉淀物；(7) 用沉淀物重20 50倍的去离子水洗涤沉淀，离心条件同上述；(8) 重复(7)步骤洗涤至上清液无色；(9) 4(TC 6(TC下沉淀物干燥48h 72h，得菊粉染料标记物。 活性染料选用活性艳蓝、活性艳红、或活性黄。 菊粉的聚合度大于20。制备的菊粉染料标记物的应用，用于筛选菊粉酶产生菌；筛选步骤-(1) 配制选择培养基，培养基配方以g/L计为菊粉染料标记物5， K2HP04 1， NaN03 1.5， (NH4)H2P042, KC1 0.5， MgS04.7H20 0,5， FeS04'7H20 0.01，琼脂20; pH6.0;(2) 接种、培养后，根据培养基中菊粉染料标记物被菊粉酶水解后颜色褪去出现透明水解圈的原理筛选菊粉酶产生菌，根据水解圈的大小初步判断菌株 的产酶能力。本发明的有益效果该标记物能作为微生物可利用的唯一碳源，与琼脂及 无机盐按比例配制成选择培养基，经接种、培养后，根据培养基中有色菊粉被 菊粉酶水解后颜色褪去出现透明水解圈的原理筛选菊粉酶产生菌，根据水解圈 的大小初步判断菌株的产酶能力。本发明建立起一种简便、快捷、直观、灵敏 的筛选内切菊粉酶产生菌的方法。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明，实施例不是对本技术方案的限制。 事实上，该标记物除了用于筛选产酶菌株外，还能作为内切菊粉酶的作用底物， 快速鉴定内切菊粉酶用于酶谱技术；测定内切菊粉酶活力大小；快速筛选菊粉 酶抑制剂。实施例1(O制备菊粉染料标记物菊粉(80.0g)和活性艳红KN(5.0g)分别放入 装有500 mL蒸馏水的烧杯中溶解，然后混合。混合物在50。C保温1 h，强力 搅拌，其间分3次加入30 g的Na2S04。然后，加入10 mLNa2C03溶液(100 g L")， 再维持50。C 1 h。混合物加入3倍体积的乙醇(950 g L")，在5。C、 5，000 g离 心25min，弃去上清液，沉淀物重新悬浮在100mL蒸馏水中，用上述条件离心， 该过程被重复7次，直到得到无色的上清液，此后，沉淀物于5(TC下干燥60h。(2) 配制选择培养基配方为(g/L):菊粉染料标记物，5， K2HP04 1， NaN03 1.5， (NH4)H2P04 2， KC1 0.5， MgS04'7H20 0.5， FeS04'7H20 0.01，琼脂20; pH6.0;将除菊粉染料标记物以外的物质溶解，121°C， 15min 20min杀菌。菊粉染料 标记物用紫外线杀菌后在倒平板前加入培养基，搅拌均匀。(3) 将样品用无菌水稀释至10—4 10—7，每个平板接入0.2mL， 30°C培养2 d~5 d，根据培养基中有色菊粉被菊粉酶水解后颜色褪去，出现蓝色透明水解圈 的大小筛选菊粉酶产生菌株并初步判断菌株的产酶能力。实施例2(1) 制备菊粉染料标记物菊粉(40.0g)和活性艳蓝KN(5.0g)分别放入 装有500 mL蒸馏水的烧杯中溶解，然后混合。混合物在50。C保温0.5 h，强 力搅拌，其间分3次加入40g的Na2SO4 。然后，加入10 mLNa2C03溶液(100 gL")，再维持50。Clh。混合物加入3倍体积的乙醇(950gL")，在5。C、 5,000 g离心25min，弃去上清液，沉淀物重新悬浮在100mL蒸馏水中，用上述条件 离心，该过程被重复5次，直到得到无色的上清液，沉淀物于4(TC下干燥72h。(2) 配制选择培养基配方为(g/L):菊粉染料标记物5， K2HP04 1， NaN03 1.5， (NH4)H2P04 2， KC1 0.5， MgS04.7H20 0.5， FeS04.7H20 0.01，琼脂20; pH6.0; 将除菊粉染料标记物以外的物质溶解，121°C， 15min 20min杀菌。菊粉染料 标记物用紫外线杀菌后在倒平板前加入培养基，搅拌均匀。(3) 将样品用无菌水稀释至1(T4 10—7，每个平板接入0.2mL， 30°C培养2 d 5 d，根据培养基中有色菊粉被菊粉酶水解后颜色褪去，出现蓝色透明水解圈 的大小筛选菊粉酶产生菌株并初步判断菌株的产酶能力。实施例3(1) 制备菊粉染料标记物菊粉(40.0g)和活性黄KN(5.0g)分别放入装 有500 mL蒸馏水的烧杯中溶解，然后混合。混合物在60。C保温1 h，强力搅 拌，其间分3次加入40g的Na2SO4 。然后，加入10 mLNa2C03溶液(lOOgL—"， 再维持60°C 1 h。混合物加入3倍体积的乙醇(950 g L"),在5°C， 5,000 g离 心25min，弃去上清液，沉淀物重新悬浮在100mL蒸馏水中，用上述条件离心， 该过程被重复6次，直到得到无色的上清液，此后，沉淀物于6(TC下干燥48h。(2) 配制选择培养基配方为(g/L):菊粉染料标记物5， K2HP04 1， NaN03 1.5， (NH4)H2P04 2, KC1 0.5， MgS04.7H20 0.5， FeS04-7H20 0.01，琼脂20; pH6.0; 将除菊粉染料标记物以外的物质溶解，121°C， 15min 20min杀菌。菊粉染料 标记物用紫外线杀菌后在倒平板前加入培养基，搅拌均匀。(3) 将样品用无菌水稀释至1(T4 10—7，每个平板接入0.2mL， 30°C培养2 d~5 d，根据培养基中有色菊粉被菊粉酶水解后颜色褪去，出现蓝色透明水解圈 的大小筛选菊粉酶产生菌株并初步判断菌株的产酶能力。
权利要求
1、一种菊粉染料标记物的制备方法，其特征是以活性染料与菊粉共价偶合制备菊粉染料标记物；(1)将活性染料与菊粉分别溶解成溶液；(2)将上述两种溶液混合，使染料浓度为1g/L～5g/L和菊粉浓度为40g/L～100g/L；(3)将混合溶液置于40℃～60℃下搅拌0.5h～1h；；(4)在(3)过程中，分3次加入Na2SO4，使其浓度为10g/L～50g/L；(5)再加入Na2CO3或其它碱性无机盐，使溶液pH值为8～10；并继续在40℃～60℃下搅拌0.5h～1h；(6)溶液冷却，加入溶液体积计2～3倍的95％的乙醇进行沉淀，5000g、4℃～6℃离心15min～30min，取沉淀物；(7)用沉淀物重20～50倍的去离子水洗涤沉淀，离心条件同上述；(8)重复(7)步骤洗涤至上清液无色；(9)40℃～60℃下沉淀物干燥48h～72h，得菊粉染料标记物。
2、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征是活性染料选用活性艳蓝、活 性艳红、或活性黄。
3、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征是菊粉的聚合度大于20。
4、 用权利要求书l所述方法制备的菊粉染料标记物的应用，其特征是用于 筛选菊粉酶产生菌；筛选步骤(1) 配制选择培养基，培养基配方以g/L计为菊粉染料标记物5， K2HP04 1， NaN03 1.5， (NH4)H2P04 2， KC1 0.5， MgS04'7H20 0.5， FeS04.7H20 0.01，琼脂20; pH6.0;(2) 接种、培养后，根据培养基中菊粉染料标记物被菊粉酶水解后颜色褪去出现透明水解圈的原理筛选菊粉酶产生菌，根据水解圈的大小初步判断菌株 的产酶能力。
全文摘要
一种菊粉染料标记物的制备及其应用，属于生物技术领域。本发明应用活性染料上的反应基团可与碳水化合物分子中的羟基或氨基共价偶合形成复合物的原理，制备菊粉染料标记物。该标记物能作为微生物可利用的唯一碳源与琼脂及无机盐按比例配制成选择培养基，经接种、培养后，根据培养基中有色菊粉被菊粉酶水解后颜色褪去出现透明水解圈的原理筛选菊粉酶产生菌，根据水解圈的大小初步判断菌株的产酶能力。本发明建立起一种简便、快捷、直观、灵敏的筛选内切菊粉酶产生菌的方法。
文档编号C09B69/10GK101328321SQ200810123249
公开日2008年12月24日 申请日期2008年6月12日 优先权日2008年6月12日
发明者徐学明, 谢正军, 赵建伟, 金征宇, 陈天祥, 陈寒青, 陈晓明 申请人:江南大学