专利名称：氧化发色剂的稳定化方法
技术领域：
本发明涉及一种在溶液中使氧化发色剂(也称为成色剂、显色剂)稳定化的方法及使用前述方法的氧化发色剂试剂。
背景技术：
已知N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠一般作为通过氧化而发色的高灵敏度发色剂使用。这样的高灵敏度发色剂可以在，例如，通过氧化还原酶使其与氧化物质反应，通过吸光度测定其发色量确定前述氧化物质的量时使用。当供给到这样的酶反应时，N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠通常是溶解于水，调制其溶液，使用其作为液体试剂。
但是，由于N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠这样的氧化发色剂在水溶液中不稳定，因此担心不到1天就自然发色。因此，如果使用在溶液状态下保存的N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠，吸光度测定中背景吸收上升，存在测定精度降低的问题。
为了防止这样的自然发色产生的影响，需要在每次测定时调制前述液体试剂，但这样做操作繁杂、成本高。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种使N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠之类的氧化发色剂在溶液中稳定化的方法及使用该方法的试剂。
为了达成前述目的，本发明氧化发色剂的稳定化方法是在溶液中使前述氧化发色剂稳定化，其特征在于，在前述溶液中使前述氧化发色剂与果糖基氨基酸氧化酶(以下，称为FAOD)及过氧化物酶(以下，称为POD)的至少之一共存。作为前述氧化发色剂，可以列举出例如N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠。
这样，使FAOD或POD的至少之一共存于溶液中，其机理尚不明，但可以抑制N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠这样的氧化发色剂的自然发色。据此，例如，前述氧化发色剂在溶液状态下的保存成为可能，不需要每次测定时调制液体试剂，因此测定等操作变得简易，低成本化也成为可能。进而，即使使用保存的溶液作为发色反应的试剂，由于在吸光度测定中背景吸收的上升得到抑制，因此可以提高测定精度。
在本发明的稳定化方法中，氧化发色剂的浓度优选为1～10000μmol/L的范围。
在本发明的稳定化方法中，FAOD的浓度优选为0.002～200g/L的范围或0.1～1000KU/L的范围，POD的浓度优选为0.02～50g/L的范围或1～5000KU/L的范围。
在本发明的稳定化方法中，相对于0.1mmol的氧化发色剂，优选以0.01～200g的范围或0.5～1000KU的范围添加FAOD，优选以0.02～50g的范围或1～5000KU的范围添加POD。此外，当添加前述两种酶时，优选以0.01～100g的范围或0.5～600KU的范围添加FAOD，以0.02～50g的范围或1～5000KU的范围添加POD。
在本发明的稳定化方法中，由于可以进一步抑制自然发色，因此优选前述溶液含有从ADA缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Bis-Tris缓冲液、甘氨酰替甘氨酸缓冲液、Bicine缓冲液及磷酸缓冲液构成的组中选取的至少一种缓冲液。
在本发明的稳定化方法中，优选还使从α-生育酚乙酸酯(VE)、异抗坏血酸钾及山梨酸钾构成的组中选取的至少一种抗氧剂、或从乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)及反式-1，2-二氨基环己烷-N，N，N’，N’-四乙酸(CyDTA)、O，O’-二(2-氨乙基)乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸(GEDTA)及氨三乙酸(NTA)构成的组中选取的至少一种螯合剂、或叠氮化钠等共存。通过使这些物质共存，可以进一步抑制自然发色。此外，可以使这些物质的一种，也可以使两种以上共存。
其次，本发明的氧化发色剂试剂是将前述氧化发色剂溶解于水性溶剂中，进一步使FAOD及POD的至少之一溶解而得到的试剂溶液。与前述相同，作为前述氧化发色剂，可以列举出例如N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠等。
这样的试剂即使放置或保存也可以抑制N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠这样的氧化发色剂的自然发色，因此不需每次使用时调制试剂。所以，例如，使用N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠的各种测定反应等的操作变得简便。
图1为本发明稳定化方法的一实施例中，在缓冲液中使FAOD共存时表示DA-64的吸光度光谱的附图。
图2为本发明稳定化方法的其他实施例中，在缓冲液中使POD共存时表示DA-64的吸光度光谱的附图。
图3为本发明稳定化方法另外的其他实施例中，在缓冲液中使FAOD及POD共存时表示DA-64的吸光度光谱的附图。
图4为比较例中，表示缓冲液中DA-64的吸光度光谱的附图。
具体实施例方式
对于本发明的稳定化方法，对使用N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠作为氧化发色剂的一例进行说明。
本发明的N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠的稳定化，例如，可以通过将前述N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠和FAOD及POD的至少之一溶解于水性溶剂中，调制N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠水溶液来进行。
前述FAOD可以为催化下述式(1)反应的酶，其来源源无特别限制，例如可以使用商品名FAOX-E(Kikkoman Corporation制造)、FOD(Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.制造)等市售品。
(1)前述式(1)中，R1表示羟基或来自于糖化反应前的糖的残基(糖残基)。当反应前的糖为醛糖时，前述糖残基(R1)为醛糖残基，当反应前的糖为酮糖时，为酮糖残基。例如，当反应前的糖为葡萄糖时，通过阿马多利(Amadori)重排，反应后的结构成为果糖结构，此时糖残基(R1)成为葡萄糖残基(醛糖残基)。该糖残基(R1)可以例如用-[CH(OH)]n-CH2OH表示，n为0～6的整数。
在前述式(1)中，R2并无特别限定，例如，当基质为糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白质时，α-氨基被糖化的情况与除α-氨基之外的氨基被糖化时的情况不同。
在前述式(1)中，当α-氨基被糖化时，R2为下述式(2)所示的氨基酸残基或肽残基。
-CHR3-CO-R4(2)在前述式(2)中，R3表示氨基酸侧链基。此外，R4表示羟基、氨基酸残基或肽残基，例如，可以用下述式(3)表示。在下述式(3)中，n为0以上的整数，R3与前述同样，表示氨基酸侧链基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH (3)此外，在前述式(1)中，当α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸侧链基被糖化)时，R2可以用下述式(4)表示。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7(4)在前述式(4)中，R5表示氨基酸侧链基中被糖化的氨基以外的部分。例如，当被糖化的氨基酸为赖氨酸时，R5为-CH2-CH2-CH2-CH2-，例如，当被糖化的氨基酸为精氨酸时，R5为-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-。
此外，在前述式(4)中，R6为氢、氨基酸残基或肽残基，例如，可以用下述式(5)表示。此外，在下述式(5)中，n为0以上的整数，R3与前述同样，表示氨基酸侧链基。
-(CO-CHR3-NH)n-H(5)此外，在前述式(4)中，R7为羟基、氨基酸残基或肽残基，例如，可以用下述式(6)表示。在下述式(6)中，n为0以上的整数，R3与前述同样，表示氨基酸侧链基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH (6)此外，POD可以使用催化下述式(7)反应的已知物质。另外，在下述式(7)中，AH2表示基质，A没有特别限制。
(7)前述水溶液中N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠的浓度并无特别限制，但从N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠相对于水的溶解度等出发，如前所述，其为例如1～10000μmol/L的范围，优选1～1000μmol/L的范围。
当添加FAOD时，如前所述，其浓度为例如0.002～200g/L的范围，优选0.01～50g/L的范围，更优选0.3～20g/L的范围。此外，当用酶的活性表示时，其为例如0.1～1000KU/L的范围，优选0.5～300KU/L的范围，更优选1～150KU/L的范围。此外，相对于0.1mmol的N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠的添加比例，例如为0.01～200g的范围，优选0.1～50g的范围，更优选0.6～20g的范围，如果用酶的活性表示，例如为0.5～1000KU的范围，优选1～300KU的范围，更优选2～100KU的范围。
当添加POD时，如前所述，其浓度例如为0.02～50g/L的范围，优选0.2～10g/L的范围。此外，当用酶的活性表示时，例如为1～5000KU/L的范围，优选5～1000KU/L的范围。此外，相对于0.1mmol的N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠的添加比例，例如POD为0.02～50g的范围，优选0.2～10g的范围，如果用酶的活性表示，例如为1～5000KU的范围，优选5～1000KU的范围。
此外，可以同时添加FAOD及POD，在这种情况下，例如，FAOD为0.002～100g/L，POD为0.02～50g/L的范围，优选FAOD为0.01～50g/L，POD为0.2～10g/L的范围，更优选FAOD为0.3～20g/L，POD为0.2～10g/L的范围。此外，如果用酶的活性表示，例如，FAOD为0.1～600KU/L，POD为1～5000KU/L的范围，优选FAOD为0.5～300KU/L，POD为5～1000KU/L的范围，更优选FAOD为1～150KU/L，POD为5～1000KU/L的范围。
相对于0.1mmol的N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠的添加比例，例如，FAOD为0.01～100g、POD为0.02～50g的范围，优选FAOD为0.1～50g、POD为0.2～10g的范围，更优选FAOD为0.6～20g、POD为0.2～10g的范围。此外，如果用酶的活性表示，FAOD为0.5～600KU、POD为1～5000KU的范围，优选FAOD为1～300KU、POD为5～1000KU的范围，更优选FAOD为2～100KU、POD为5～1000KU的范围。
此外，FAOD(A)与POD(B)的添加比例(A∶B)，用重量比表示时，例如，为A∶B＝100∶0～0∶100的范围。
作为前述水系的溶剂，例如可以使用水、各种缓冲液。其中，从进一步能够抑制N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠的自然发色出发，优选各种缓冲液。作为前述缓冲液，例如，可以使用前述的ADA缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Bis-Tris缓冲液、甘氨酰替甘氨酸缓冲液、Bicine缓冲液及磷酸钾缓冲液(KPB)等磷酸缓冲液、HEPES缓冲液、HEPSO缓冲液等，优选ADA缓冲液、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液。作为前述缓冲液的pH，例如，pH为5.0～9.0的范围，优选6.0～8.0的范围。
此外，前述缓冲液的浓度并无特别限制，例如，为1～1000mmol/L的范围，但由于相对的高浓度更可以抑制N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠的自然发色，优选50～800mmol/L的范围，更优选100～500mmol/L的范围。
此外，调制的前述水溶液的pH并无特别限制，例如，pH为5.0～9.0的范围，优选6.0～8.0的范围。
这样的N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠水溶液，通过与前述FAOD及POD的至少之一共存而被稳定化，因此可以在溶液状态下保存。其保存温度并无特别限制，例如，为0～40℃的范围，优选0～25℃的范围，更优选0～10℃的范围。
当FAOD及POD的任一个都不添加时，如果在10℃下保存，则发色的N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠在吸收波长727nm的吸光度，保存5天后，例如增加2～3倍，保存18天后，例如增加10～11倍。与此相比，如果根据本发明进行稳定化，即使在10℃下保存，例如，在9天内可以防止自然发色，优选为1～5天。
此外，在本发明的稳定化方法中，不仅是FAOD及POD，还可以进一步使前述的抗氧剂、前述螯合剂、叠氮化钠等与所述氧化发色剂共存。其中优选前述螯合剂、叠氮化钠。
作为前述抗氧剂，可以使用前述的VE、异抗坏血酸钾、山梨酸钾等。作为前述抗氧剂的添加比例，例如，为0.1～1000μmol/L的范围，优选0.2～100μmol/L的范围，更优选0.5～20μmol/L的范围。此外，相对于0.1mmol的N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠，例如，为0.1～100μmol的范围，优选0.2～20μmol的范围。
作为前述螯合剂，如前所述，可以使用EDTA、DTPA、CyDTA、GEDTA、NTA等，优选EDTA、DTPA、CyDTA。作为前述螯合剂的添加比例，例如，为0.01～20mmol/L的范围，优选0.05～10mmol/L的范围，更优选0.1～5mmol/L的范围。此外，相对于0.1mmol的N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠，例如，为0.02～15mmol的范围，优选0.05～10mmol的范围，更优选0.1～5mmol的范围。
作为前述叠氮化钠的添加比例，例如，为0.01～20mmol/L的范围，优选0.05～10mmol/L的范围，更优选0.1～5mmol/L的范围。此外，相对于0.1mmol的N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠，例如，为0.01～10mmol的范围，优选0.05～5mmol的范围，更优选0.1～2mmol的范围。
用这样的方法稳定化的N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠，例如，即使在溶液状态下长期保存也可以如前述那样抑制自然发色，因此作为液体试剂是有用的。作为前述N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠试剂的用途，并无特别限制，例如，可以如前所述作为氧化还原反应中的发色基质等使用。当利用于这样的反应时，如前所述由于可以抑制自然发色，因此可以抑制吸光度测定中背景吸收的上升，也可以提高各种测定的精度。此外，与前述本发明的稳定化方法相同，优选添加各种缓冲液、抗氧剂、表面活性剂、螯合剂、叠氮化钠等。
实施例(实施例1～3及比较例1)该实施例为在Tris-HCl缓冲液中使N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠与FAOD及POD共存时，考察其稳定性(吸光度变化)的实施例。
在200mM Tris-HCl缓冲液(pH7.0)中添加N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠(商品名DA-64、Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.制造、以下称为“DA-64”)，使浓度成为0.088mM。在该DA-64溶液中添加FAOD(商品名FOD、Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.制造)、POD(Toyobo Co.，Ltd.制造)，使其达到以下浓度，调制出样品，使用自动分析装置(商品名JCA-BM8、Japan Electron Optics LaboratoryCo.，Ltd.制造)测定将这些样品在10℃下保持所定时间(刚制成之后、5天、9天、18天)时的吸光光谱。比较例除了不添加FAOD及POD以外，与前述实施例相同调制样品，测定吸收光谱。
FAOD浓度 POD浓度实施例10.09g/L(22KU/L) -实施例2-0.37g/L(15KU/L)实施例30.09g/L(22KU/L) 0.37g/L(15KU/L)比较例1--这些结果示于图1～4。图1表示实施例1、图2表示实施例2、图3表示实施例3、图4表示比较例1在保存所定天数后的吸收光谱图。
如图所示，添加了FAOD或POD的实施例1～3，即使保存期间增长，与比较例相比，发色的DA-64在吸收波长727nm的吸光度的增加被抑制在约1/2～1/10。特别是对于添加了FAOD及POD两者的实施例3，自然发色得到了最有效地抑制。
如上所述，根据本发明的稳定化方法，可以在溶液状态下稳定地保存N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠这样的氧化发色剂。因此，即使需要例如N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠等氧化发色剂的液体试剂时，由于不需要每次使用时调制试剂，因此试剂的低成本化成为可能，操作也变得简便。
权利要求
1.在溶液中使氧化发色剂稳定化的方法，其特征在于，在所述溶液中使所述氧化发色剂与果糖基氨基酸氧化酶和过氧化物酶的至少之一共存。
2.根据权利要求1记载的稳定化方法，其中，氧化发色剂为N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠。
3.根据权利要求1或2记载的稳定化方法，氧化发色剂的浓度为1～10000μmol/L的范围。
4.根据权利要求1～3的任一项记载的稳定化方法，其中，果糖基氨基酸氧化酶的浓度为0.002～200g/L的范围或0.1～1000KU/L的范围。
5.根据权利要求1～4的任一项记载的稳定化方法，其中，过氧化物酶的浓度为0.02～50g/L的范围或1～5000KU/L的范围。
6.根据权利要求1～5的任一项记载的稳定化方法，其中，相对于0.1mmol的氧化发色剂，以0.01～200g的范围或0.5～1000KU的范围添加果糖基氨基酸氧化酶，以0.02～50g的范围或1～5000KU的范围添加过氧化物酶。
7.根据权利要求1～6的任一项记载的稳定化方法，其中，所述溶液含有从ADA缓冲液、Tris-HCl缓冲液、Bis-Tris缓冲液、甘氨酰替甘氨酸缓冲液、Bicine缓冲液及磷酸缓冲液构成的组中选取的至少一种缓冲液。
8.根据权利要求1～7的任一项记载的稳定化方法，其中，还使从α-生育酚乙酸酯(VE)、异抗坏血酸钾及山梨酸钾构成的组中选取的至少一种抗氧剂共存。
9.根据权利要求1～8的任一项记载的方法，其中，还使从乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、反式-1，2-二氨基环己烷-N，N，N’，N’-四乙酸(CyDTA)、O，O’-二(2-氨乙基)乙二醇-N，N，N’，N’-四乙酸(GEDTA)及氨三乙酸(NTA)构成的组中选取的至少一种螯合剂共存。
10.根据权利要求1～9的任一项记载的方法，其中，还使叠氮化钠共存。
11.根据权利要求1～10的任一项记载的方法，其中，溶液的pH为5.0～9.0的范围。
12.根据权利要求1～11的任一项记载的方法，其中，溶液的温度为0～40℃的范围。
13.试剂溶液，其包含水性溶剂和溶解于该水性溶剂中的氧化发色剂，其中果糖基氨基酸氧化酶及过氧化物酶的至少之一进一步在所述水性溶剂中溶解。
14.根据权利要求13记载的试剂溶液，其中，氧化发色剂为N-(羧甲胺基羰基)-4，4’-二(二甲胺基)二苯胺钠。
全文摘要
本发明提供了一种在溶液状态下使氧化发色剂稳定化的方法。通过在溶液中使作为氧化发色剂的N－(羧甲胺基羰基)－4，4’－二(二甲胺基)二苯胺钠与果糖基氨基酸氧化酶(FAOD)及过氧化物酶(POD)的至少之一共存，使其稳定化。FAOD的浓度为0.01～1.0g/L或1～100KU/L的范围，POD的浓度为0.01～1.0g/L或1～100KU/L的范围。
文档编号C09B67/00GK1568355SQ0281997
公开日2005年1月19日 申请日期2002年10月9日 优先权日2001年10月11日
发明者八木雄次, 小森胤树 申请人:爱科来株式会社