专利名称：荧光化合物的利记博彩app
技术领域：
本发明一般涉及新颖的荧光化合物和涉及可用作荧光染料的化合物，从微生物分离这样化合物的方法和这样的化合物在科学应用中的用途。
采用合成荧光探针，通常使用配体以赋予要观察的生物化学反应的特异性，并且所述荧光染料提供相互作用的检测或定量化的措施。这些应用包括，其中，蛋白质的检测(例如在凝胶或水溶液中)、细胞跟踪、通过荧光标记的抗体的蛋白质检测、酶活性的评价、核酸的染色。
由于它降低来自细胞自身荧光的干扰和降低荧光团与光结合的细胞毒性效果，长波吸光度通常增加荧光探针的效用。尽管激光器特别用作荧光激发用的集中光源，目前激光器的输出局限于特定波长的光。激发光谱与激光器输出一致的化合物因此具有高效用。氩激光器是最通常的荧光激发光源，并具有488nm和514nm的光的主要输出。由这些波长任意激发的荧光化合物因此具有特定的效用。或者，可以使用固态光源如发光二极管达到荧光的激发。由从这些另外来源发射的光激发的荧光化合物也具有特定的效用。
红荧光化合物广泛用于生物研究的许多领域。许多这些物质，包括Texas红，四甲基罗丹明-异硫氰酸酯或发射红色的BODIPY染料要求用绿色波长如542nm的光激发。这限制它们在许多应用中的用途，特别是其中将氩离子激光器用于激发的那些。化合物如溴化乙锭，可采用来自氩离子激光器的光(520nm谱带)激发，但一般不适于不是核酸的有机分子的标记。其它化合物如藻红蛋白，可以使用氩离子激光器(488nm)激发并发出橙色/红色波长的光。然而，藻红蛋白具有差的稳定性和高分子量，使得它不适于许多应用如细胞跟踪，核酸的标记或染色蛋白质。
对于蛋白质的染色，有许多可利用的方法。这些方法可采用非荧光化合物，或荧光化合物。最通常使用的方法采用考马斯蓝，它是非荧光的，可要求大量有机溶剂的使用，是耗时的。其它荧光基蛋白质检测方法是可利用的，它们比非荧光方法可能更灵敏。然而，这些方法一般比非荧光方法更为昂贵，这限制了它们的广泛应用。因此，结合有用光谱特性的化合物，和相对高灵敏度会具有特定的效用。
有几种方法用于溶液中蛋白质的定量。这些方法基于广泛的技术，和包括其中将染料结合到溶解蛋白质上的方法。这些染料可以是非荧光或荧光化合物。荧光染料基方法经常比非荧光染料更灵敏，并允许在宽浓度范围的蛋白质浓度的测量。结合有用光谱特性和具有结合蛋白质能力的化合物会具有特定的效用。
在酶研究中，广泛使用荧光化合物用于特定酶活性的检测。例如，荧光素二-β-D-吡喃乳糖苷(FDG)是非荧光化合物荧光的。FDG化合物的分裂可以通过溶液中荧光的增加而监测，并因此允许酶活性的灵敏定量化。目前，仅有有限数目的荧光团适于此程序。因此，可以共轭到各种基材上的新颖的荧光化合物会具有效用。
对于双颜色染色，有低分子量荧光团的非常有限的选择。主要的绿色荧光团是荧光素，它强烈地吸收来自氩离子激光器488nm谱带的光，并在518nm再发射。目前有较少的相容红色或橙色荧光团，它们具有低分子量并由氩离子激光器的488nm或514nm谱带激发。因此，由氩离子激光器激发和在大于600nm波长发射的低分子量化合物会具有效用，特别是如果有与荧光素的最小光谱重叠。
本发明人已经分离出衍生自真菌的新化合物，它能够容易地与许多有机分子结合以产生荧光配合物。
优选，本发明的第一方面提供具有通式(Ia)的化合物 优选，根据通式Ia的化合物具有如通式(Ib)所示的立体化学 优选，R是选择性地被羟基和氧代基团取代的直链或支链C1-20共轭烯基；R’是选择性地被羟基取代的直链或支链C1-20烷基和R”是直链或支链C1-20烷基。
更优选，R＝-C(OH)CHC(O)(CH)6CH3，R’＝-CH2OH和R”＝Me使得根据第一和第二方面的本发明在于具有通式(Ic)的化合物 5，6-二氢-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羟基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羟甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮 在第二方面，本发明在于一种根据通式(I)的化合物，其中每个R，R’和R”是氢原子，卤素原子或选择性地被一个或多个卤素、羟基和/或氧代基团取代的直链或支链C1-20烷基，烯基或炔基；环A，B和C选择性地被一个或多个卤素原子取代；和环A，B和C选择性地包括一个或多个双键；
条件是(i)当R’＝-CH2OH，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a之间的双键时，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(ii)当R’＝Me，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a之间的双键时，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(iii)当R＝Me，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(iv)当R’＝-正丙基，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)4Me；(v)当R’＝-正丙基，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)6Me；(vi)当R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)5Me；(vii)当R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)6Me；(viii)当R’＝-Ac，R”＝Me，C4＝C1，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)；(ix)当R’＝-Ac，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)；(x)当R’＝-Ac，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-(CH)2C(Me)CH-异丙基；(xi)当R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)4Me；(xii)当R’＝-正丙基，R”＝Me，环A不包括双键；环B和环C包括在C8a和C4a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)4Me；(xiii)当R’＝-正丙基，R”＝Me，环A，B和C不包括双键时，R≠-C(O)(CH)4Me；(xiv)当R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，环A不包括双键；环B和环C包括在C8a和C4a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)6Me；(xv)当R’＝-C(CH2)Me，R”＝Me，环A不包括双键；环B和环C包括在C8a和C4a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)4Me；(xvi)当R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，环A不包括双键；环B和环C包括在C8a和C4a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)4Me。
优选，根据本发明第二方面的化合物是根据通式(Ia)和更优选，具有如通式(Ib)所示的立体化学。
甚至更优选，R＝-C(OH)CHC(O)(CH)6CH3，R’＝-CH2OH和R”＝Me使得根据第二方面的本发明在于具有通式(Ic)的化合物5，6-二氢-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羟基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羟甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮。
可以理解的是根据通式(I)-(Ic)的化合物包括所有相应的互变体结构。
在化学上，通式(I)-(Ic)的化合物，如5，6-二氢-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羟基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羟甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮，是阿扎非隆(azaphilone)族化合物的成员。阿扎非隆化合物由各种真菌产生，并已经研究它们的抗生素功能，它们抑制酶功能的能力，和它们在食品添加剂中作为着色剂的作用。
也已经在由单子囊孢子(Monascus spp)产生的颜料中发现阿扎非隆核。包含通常阿扎非隆核的颜料包括二氢红曲霉素和红曲红色素。没有它们作为荧光染料用于生物分子或有机化合物染色的效用的记录。
申请人已知的现有技术中没有教导或建议通式(I)-(Ic)中所述结构的化合物会是荧光的，也没有建议它适用于生物分子或有机化合物的荧光染色。因此有与此化合物有关的不可预料和有利的性能，包括凝胶中蛋白质的灵敏检测，细胞跟踪和双颜色染色。
本发明人已经不可预料地发现根据通式(I)-(Ic)的化合物在水溶液中不是荧光的，但能够与有机化合物相互作用以产生强烈荧光的染色。在优选的实施方案中，根据本发明通式(I)-(Ic)的化合物用于有机分子的检测和标记。
优选，根据通式(I)-(Ic)的化合物，当结合到一种有机分子上时，在蓝色波长的光的激发之后发射荧光。更优选，根据通式(I)-(Ic)的化合物由吸收范围300-560nm的光激发。
在优选的实施方案中，根据通式(I)-(Ic)的化合物与蛋白质相互作用以产生荧光配合物，该配合物可由标准UV透照器产生的光(307nm)激发。在激发时，荧光配合物在宽范围波长内发射光，可以检测到蛋白质配合物。蛋白质/染料配合物的激发波长包括与DNA配合的溴化乙锭的波长(吸收最大518nm，发射最大605nm)。由于它允许相同设备用于检测DNA和凝胶中的蛋白质两者，这有特定效用。宽范围的激发波长使化合物强烈地由氩离子激光器的488nm和514nm谱带激发，以及吸收从二极管光源发射的光如在约400nm发射的那些。
在另一个优选的实施方案中，根据通式(I)-(Ic)化合物的荧光形式能够强烈吸收来自氩离子激光器488nm输出的光，并在长于600nm的波长再发射光。
在另一个优选的实施方案中，根据通式(I)的化合物，与分析用载体一起包含在组合物中，并可以与荧光染料如在双染色应用中的荧光素结合使用。这样的荧光染料可包括在组合物中或单独使用。
根据通式(I)-(Ic)的化合物可由真菌种产生。优选，真菌种是在澳大利亚政府分析实验室(AGAL)，在1998年1月15日保藏的，由登记号NM98/00507识别的菌株。
先前没有描述过新颖的荧光团5，6-二氢-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羟基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羟甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮和相关化合物的精制，分离方法以及结构。
根据通式(I)-(Ic)化合物对有机分子的结合可包括直接化学或物理结合或可以通过使用本领域已知的“连接分子”而达到。可以由当用作荧光染料时的本发明化合物结合的有机分子包括，例如，蛋白质、肽、糖、核酸、抗体、细胞表面分子、洗涤剂和细胞。由于化合物具有荧光的和结合有机化合物的特性，可以理解所述化合物可用于许多应用，包括要求连接到有机化合物上的荧光染料的检测。
在第三方面，本发明在于根据本发明第一和第二方面的化合物的生产方法，方法包括在一定的条件下培养真菌种使得真菌种产生所述化合物，和从培养物分离所述化合物。
当在粗培养物提取物中时或当通过萃取和分离技术精制时，根据通式(I)-(Ic)的化合物可用作荧光染料。
已经由本发明人发现在识别为AGAL登记号NM98/00507的菌株在生长介质上的接种和温育之后，由真菌产生适于作为荧光染料的化合物。可以理解应当可以通过使用不是从合适真菌培养物的上清液的技术，产生根据本发明的第一和第二方面通式(I)-(Ic)的化合物。例如，如果真菌产生“前体”，然后可以通过化学，物理或酶措施将前体改性成它的荧光形式。这样的化合物可以从微生物获得的知识应当允许其它化合物或具有有用特性的相当不同化合物的发现和生产，其它化合物适于作为属于相同族的荧光染料。也可以采用合成方式通过直接化学合成，或通过在由真菌使用的生物合成路途中的中间体的改性，生产根据通式(I)的化合物。
也可以采用合成方式通过化学措施生产本发明根据通式(I)-(Ic)的化合物。除在要求条件下培养真菌以外，新荧光化合物由真菌产生的知识可导致生产化合物的其它措施。
本发明根据通式(I)-(Ic)的化合物具有显著的优点在于它以它的荧光形式结合到细胞和其它有机化分子上，使得当采用化合物标记细胞或其它有机分子时，可用作跟踪细胞或其它有机分子的措施。
在第四方面，本发明在于根据本发明第一和第二方面的化合物作为荧光染料或标记物，优选在用于染色，标记和/或检测有机分子的科学技术中的用途。
根据本发明第一和第二方面的化合物用途的例子包括，但不限于用于显微术的细胞跟踪染料、膜流动性染料、与抗体的共轭、对核酸的共轭、细胞表面配合体成象染料、对糖的共轭、细胞计数、和共焦显微术。然而，可理解化合物会适于，其中要求在红色波长中的荧光，包括当在48 8nm下激发时的任何用途。
在第五方面，本发明在于一种荧光标记有机化合物的方法，该方法包括使根据本发明第一或第二方面的化合物结合到一种有机化合物上，使得采用所述化合物荧光标记所述有机化合物。
优选，当曝露于宽范围的波长，优选300-560nm的波长时，检测到荧光标记的有机化合物。
所述有机化合物可包括，但不限于，蛋白质、肽、糖、核酸、抗体、细胞表面生物分子、洗涤剂和细胞。所述化合物可由于化学或物理缔合直接结合到所述有机化合物上或可以通过连接分子结合到所述有机化合物上。如果将所述化合物连接到特异用于所述有机化合物的配体上，例如抗体或植物凝血素，然后配体对所述有机化合物的结合会引起荧光标记有机化合物。
在第六方面，本发明在于检测包含有机化合物的样品中的一种有机化合物的方法，该方法包括根据本发明第五方面的方法标记所述有机化合物，并通过监测或检测它的荧光而检测样品中的所述有机化合物。优选，当将样品曝露于来自宽范围波长，优选300-560nm波长，更优选蓝色波长的光时，检测到标记的有机化合物。
通过本领域已知的任何措施进行标记的有机化合物的荧光监测或检测。这样的措施包括，但不限于，透照、光谱学、显微术和细胞计量术。
在此整个说明书中，理解词语“包括”，或其变化如“包含”或“含有”，暗示所述元素、整数或步骤、或元素、整数或步骤的组的包括，但不排除任何其它元素、整数或步骤、或元素、整数或步骤的组。
已经包括在本发明中的文献、行为、材料、器件、文章等的讨论仅用于提供本发明上下文的目的。当它在本申请每个权利要求的优先权日之前存在于澳大利亚时，不能认为任何或所有这些内容形成了现有技术的基础部分或是关于本发明领域中的常规知识。
为更清楚地理解本发明，参考以下实施例和附图描述优选的形式。
图2显示当结合到牛血清白蛋白(BSA)或结合到DNA上的安妥碘时，由
图1识别的化合物的发射光谱的例子。用于结合到过量BSA上的精制化合物的摩尔数，等于用于结合到过量DNA上的安妥碘的摩尔数。有两个激发谱带，导致发射605nm的光。如所见，由390-400nm光的激发导致最大发射为605nm的光。
具体实施例方式
实施例1提取物A的生产获得具有所有由AGAL登记号NM98/00507识别的菌株的识别特性的微生物的生物纯培养物。
通过向1L水中加入40g蔗糖(CSR)，5g酵母提取物(Difco)，10g蛋白胨(Difco)制备用于真菌，AGAL登记号NM98/00507的生长介质。将混合物在115℃下高压釜蒸煮15分钟用于以下两种目的将介质消毒和溶解琼脂。将液体倾入培养盘中，并使其在室温下凝固。在冷却之后，将真菌的培养物在介质表面上接种，并于25℃温育三天。将培养物转移到冰箱中和在4℃温育直到培养物转变成深红色和产生较高量的染料(通常3-5天)。
一旦培养物产生足够用于收获的染料，在一体积培养物介质对两体积乙醇的比例下，将包括真菌生物量的培养物介质转移到乙醇中。通过在4℃温育和摇动16小时，将染料萃取入乙醇相。将液体相从残余的培养介质滗析，并于4℃在3000转/分钟下离心10分钟。
将澄清的提取物(提取物A)贮存待用，或根据在实施例2和3下描述的程序之一进一步精制。实施例2提取物A的精制以生产提取物B将根据实施例1中所述方法生产的提取物A的粗乙醇提取物在高真空下降低体积，使用甲醇作为溶剂在纤维素粉末上用色谱分析并施加到交联葡聚糖LH-20柱上，也采用甲醇洗脱。在48小时内收集级份并收集靠近末端洗脱的紫色谱带。将此级份冷冻干燥和在最小体积甲醇(0.1％乙酸)中再悬浮和贮存。实施例35，6-二氢-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羟基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羟甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮的精制将根据实施例2中所述方法生产的提取物B进行HPLC精制(Supelco C16-酰胺柱，在75％甲醇/水，0.05％乙酸，然后50％乙腈/水，0.05％乙酸中解析)。冷冻(-20℃)最终的级份以除去水并将剩余的乙腈在氮气流下蒸发。
此程序生产分析纯的，5，6-二氢-3-[(1 Z，4E，6E，8E)-1-羟基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羟甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮，它是橙色固体。实施例45，6-二氢-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羟基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羟甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮的结构确定使用NMR光谱和高分辨率质谱的结合分析根据实施例3生产的化合物以确定5，6-二氢-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羟基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羟甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮的结构。核磁共振光谱通过在CDCl3(0.5mL；99.96原子％，Aldrich)中溶解从实施例3获得的HPLC精制化合物，并将它过滤入NMR管(PP527，Wilmald)，而制备NMR样品。将样品脱气和在氮气气氛下平衡。
将NMR数据在Bruker DRX600(600MHz)NMR光谱仪上在27℃下获得和使用xwinNMR(版本2.6；Bruker)处理。采用正交检测运行所有的2D NMR试验，1H光谱宽度为6009Hz和循环延迟为2s。将化学位移参比残余的CHCl3(δH7.26ppm，δC77.01ppm)。高能1Hπ/2脉冲测量为9.5ms和低能(用于MLEV旋转锁定)在25.15ms。13C高能π/2脉冲是10.5ms和使用65ms的低能脉冲用于GARP去偶。使用100步骤正弦程序沿z轴释放梯度脉冲。
使用32K真实点获得1D试验的数据和将零填充到64K和然后将Gaussian相乘用于分辨率增强。使用回声/反回声-TPPI梯度选择，通过灵敏度增强的双INEPT转移达到碳-氢关联(HSQC)(Palmer，A.G；III，Cavanagh，J.，和Wright，P.(1991))J.Magn.Reson.93，151-70；Schleucher，J.，Schwendinger，M.，Sattler，M.，和Schmidt，P.(1994)J.Biomol，NMR4，301-6；Kay，L.E.，Keifer，P.和Saarirnen，T.(1992)J.Am.Chem.Soc.114(26)，10663-5)。在采集期间采用去偶，采用1.3s循环延迟，在t2(128扫描每增量)收集2K数据点。在t1中，使用512增量(10-170ppm)和将INEPT程序优化用于145Hz的X-H去偶。使用80∶20.1的梯度比以选择回声/抗回声-TPPI相灵敏度。
使用选择性Gaussian脉冲在感兴趣的质子上测量一个二维ROSEY光谱(Kessler，H.，H.Oschkinat，C.Griesinger & W.Bermel，(1986)J.Magn.Reson.70，106；Stonehouse，J.，P，Adell，J.Keeler & A.J.Shaka.(1994)J.Am.Chem.Soc.116，6037；Stokk，K.，J.Stonehouse，J.Keeler，T.L.Hwang & A.J.Shaka(1995)J.Am.Chem.Soc.117，4199 4200)。使用1000步骤Gaussian程序(60ms，64.6dB)以达到π/2脉冲。使用100ms的混合时间(13dB)用于连续波旋转锁定。采用15％梯度沿z轴达到梯度选择。在6009Hz上积累10K暂态。将ROE增强测量为照射峰的百分比和不补偿来自载体频率的偏移。
使用由2ms低能量调整脉冲侧翼的MLEV17(Bax，A.，& Davis，D.G.(1985)J.Magn.Reson.63(1)，207-13)脉冲顺序，测量两个二维同核Hartman-Hahn转移谱(TOCSY)。在两个二维的处理中使用正弦钟转移的(90°)变迹。
采用采集时间期间的无去偶和使用用于选择的梯度脉冲(50∶30∶40.1)，获得通过采用低通J-滤波器(145Hz)对于长范围偶合(HMBC)用于抑制一谱带关联(Bax，A.，& M.F.Summers，(1986)J.Am.Chem.Soc.108，2093-2094)的异核零和双量子相关性的2D1H-13C关联。优化用于长范围偶合进展的延迟用于在单独试验中20，10，5和2Hz的偶合。在F1中使用210ppm的光谱宽度并计算最终光谱大小以破坏相的信息。1H NMR(600MHz，CDCl3)δ1.75，s，C9a-Me；1.84，dd，J 6.7，1.1Hz，C9’-Me；2.80，dd，J 17.2，3.6Hz，H5α；2.89，ddd，J 17.1，11.5，1.9Hz，H5β；3.85，dd，J 12.2，5.5Hz，C6CH2OH；3.97，dd，J 12.2，3.4Hz，C6CH2OH；4.39，m，H6；5.97，m，H9’；6.10，d，J 15.1Hz，H4’，6.19，ddd，J 15.1，10.6，1.6Hz，H8’；6.25，dd，J 14.6，11.2Hz，H6’；6.58，dd，J 14.5，10.5Hz，H7’；6.79，s，H2’；7.16，bs，H4，7.32，dd，J 15.2，11.2Hz，H5’；7.85，s，H8.
13C NMR(125MHz，CDCl3)δ18.8，C9’-Me；28.0，C9a-Me；29.3，C5；63.4，C6-CH2OH；79.0，C6；86.2，C9a；101.0，C2’；112.2，C8a；113.4，C4；115.3，C3；126.5，C4’；128.6，C6’；131.7，C8’；136.0，C9’；140.9，C4a；142.0，C7’；142.6，C5’；159.0，C8；168.2，C2/C3a；177.7，C1’；185.0，C3’；190.0，C9.
使用异核单量子相关性(HSQC)以关联和将所有质子分配到质子化的碳。此外，通过运行一系列采用8毫秒(msec)，20毫秒，100毫秒混合时间的总关联光谱(TOSCY)试验，表征每个自旋体系。最短的混合时间得到对于仅直接偶合质子的关联而最长的混合时间识别整个自旋体系和得到关于非常小的长范围偶合的信息，它有价值用于分配许多(显然地)未偶合质子的位置。通过一系列一个二维选择性旋转框架关联光谱(ROESY)试验，达到整体空间连通性。由低能量Gaussian90度脉冲达到选择性激发和使用梯度部分以仅观察没有TOCSY转移的ROE。发现100毫秒的混合时间是最优的。发现采用20，50，100和250毫秒混合时间的长范围异核多量子相关性(HMBC)对于分配所有的非质子化碳是必须的。甚至在此之后，发现C2不与任何质子关联和与在168.2ppm的C3a一致。
根据光谱数据，几个三环主链理论上是可能的，但一个(5，6-二氢-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羟基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羟甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮)，确实地适合获得的数据。质谱将根据实施例3生产的化合物进行高分辨率质谱分析以确定化合物的分子式为C23H22O7。
质谱(ESI，正离子)m/e 411(M+H+，55％)，317(5)，249(12)，163(10)，121(100)，93(4)。负离子ESI-FTICR测量值M-H+，409.1304，C23H21O7计算值409.1293；测量值247.0617，C13H12O5计算值247.0685。λ最大和ν最大λ最大(MEOH)432，555nm，ε10000，4000。λ最大(碱性MEOH)432nm，ε16000。λ最大(酸性MEOH)390，560nm，ε6000，10000。
ν最大(净)3400(br)，2925，2854，1744，1712，1589，1259，1010cm-1。实施例5使用提取物A的蛋白质凝胶染色根据许多标准方案的任意一个制备蛋白质凝胶。例如，根据Laemmli的方案制备SDS页凝胶(U.K.1970，自然，227680-685)。在完成电泳之后，将凝胶从电泳设备中取出。将凝胶固定在包含100mL染色溶液的容器中，染色溶液由90mL水，10mL甘油和5mL提取物A组成。采用轻微摇动将凝胶和染色溶液温育90分钟。在90分钟染色程序之后，将溶液取出和将凝胶简单地在水中洗涤三次。在这些简单的洗涤之后，将凝胶放入100mL含10％甘油的水中，并采用摇动温育另外30分钟。
为显现凝胶中的蛋白质，将凝胶转移到UV透照器(307nm)中，和使用polaroid 667黑和白膜照相和设计过滤器组用于溴化乙锭凝胶的检测(如，分子探针E-7591)。实施例6孢子形成的和植物细胞的表面荧光在一定条件下培养微生物以促进孢子形成并将提取物B用于进行在主要植物细胞培养物中孢子形成细胞的识别。例如，在包含10g/L葡萄糖，5g/L酵母提取物，和10g/L蛋白胨的水基肉汤中生长酿酒酵母。在30℃下的16小时温育之后，将细胞通过离心收获并在1mL水中再悬浮。将培养物的5μL等分试样点在由5％乙酸钾，2％琼脂和水组成的半固体介质上。将培养物在22℃下温育4天以允许酵母细胞的孢子形成。将孢子形成的培养物在水中再悬浮到1×109细胞每mL的密度，将5μL提取物B加入到1mL孢子形成的培养物中。为对比染色，将5μL的5(6)-羧基荧光素二乙酸酯(CFDA)的10mM溶液(在DMSO中)，加入到孢子形成的培养物中。在5分钟之后，将孢子形成的培养物用离心方法收获并在1mL水中再悬浮。在落射荧光显微镜(激发488nm)下的检验允许在孢子形成的和植物细胞之间的快速差异。
本领域技术人员可以理解的是，可以对如在具体实施方案中所示的本发明进行许多改变和/或改进，而不背离如广泛描述的本发明精神或范围。因此，在所有方面认为本实施方案为说明性的而不是限制性的。
权利要求
1.一种具有通式(I)的化合物，包括通式(I)的互变体， 其中每个R，R’和R”是氢原子，卤素原子或选择性地被一个或多个卤素、羟基和/或氧代基团取代的直链或支链C1-20烷基，烯基或炔基；环A，B和C选择性地包括一个或多个双键；环B和C选择性地被一个或多个卤素原子取代；并且所述化合物能够与一种有机化合物相互作用，并且当与该有机化合物相互作用时，所述化合物以在宽范围波长的光的激发之后发出荧光。
2.权利要求1的化合物，其具有通式(Ia)的结构，包括它的互变体
3.权利要求2的化合物，其具有通式(Ib)所示的立体化学，包括它的互变体
4.权利要求1-3任意一项的化合物，包括它的互变体，其中R是选择性地被羟基和氧代基团取代的直链或支链C1-20共轭烯基；R’是选择性地被羟基取代的直链或支链C1-20烷基和R”是直链或支链C1-20烷基。
5.权利要求3的化合物，包括它的互变体，其中R是-C(OH)CHC(O)(CH)6CH3，R’是-CH2OH和R”是Me，为具有通式(Ic)的化合物5，6-二氢-3-[(1Z，4E，6E，8E)-1-羟基-3-氧代-1，4，6，8-癸四烯基]-6-羟甲基-9a-甲基-2H-呋[3，2-g][2]苯并吡喃-2-9(9aH)-二酮
6.一种具有通式(I)的化合物，包括它的互变体， 其中每个R，R’和R”是氢原子，卤素原子或选择性地被一个或多个卤素、羟基和/或氧代基团取代的直链或支链C1-20烷基，烯基或炔基；环A，B和C选择性地被一个或多个卤素原子取代；和环A，B和C选择性地包括一个或多个双键；条件是(i)当R’＝-CH2OH，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a之间的双键时，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(ii)当R’＝Me，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a之间的双键时，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(iii)当R’＝Me，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(OH)CHC(O)(CH)6C(Et)(Me)；(iv)当R’＝-正丙基，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)4Me；(v)当R’＝-正丙基，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)6Me；(vi)当R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)5Me；(vii)当R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)6Me；(viii)当R’＝-Ac，R”＝Me，C4＝C1，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)；(ix)当R’＝-Ac，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-(CH)2C(Me)CHC(Me)(Et)；(x)当R’＝-Ac，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-(CH)2C(Me)CH-异丙基；(xi)当R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，环A包括在C3和C3a之间的双键；环B包括在C4和C4a之间的双键；和环C包括在C8和C8a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)4Me；(xii)当R’＝-正丙基，R”＝Me，环A不包括双键；环B和环C包括在C8a和C4a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)4Me；(xiii)当R’＝-正丙基，R”＝Me，环A，B和C不包括双键时，R≠-C(O)(CH)4Me；(xiv)当R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，环A不包括双键；环B和环C包括在C8a和C4a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)6Me；(xv)当R’＝-C(CH2)Me，R”＝Me，环A不包括双键；环B和环C包括在C8a和C4a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)4Me；(xvi)当R’＝-(CH)2Me，R”＝Me，环A不包括双键；环B和环C包括在C8a和C4a和C5和C6之间的双键时，R≠-C(O)(CH)4Me。
7.权利要求6的化合物，其具有通式(Ia)的结构
8.权利要求7的化合物，其具有通式(Ib)所示的立体化学
9.权利要求1-8任意一项的化合物，其中当所述化合物与一种有机化合物相互作用时，在蓝色波长的光的激发之后发射荧光。
10.权利要求9的化合物，其中当被范围300-560nm的光激发时，所述化合物发射荧光。
11.权利要求10的化合物，其中所述有机化合物是蛋白质，并且当所述化合物与蛋白质相互作用时，在307nm光的激发之后发射荧光。
12.权利要求10的化合物，其中当被约400nm，488nm和514nm的光激发时，所述化合物发射荧光。
13.权利要求12的化合物，其中在488nm的光的激发之后，所述化合物发射约600nm的荧光。
14.一种组合物，该组合物包含权利要求1-13任意一项的化合物、分析用载体和选择性地，一种荧光染料。
15.一种权利要求1-13任意一项的化合物的制备方法，包括在一定的条件下培养真菌种使得真菌种产生所述化合物，并从培养物中分离所述化合物。
16.权利要求1-13任意一项的化合物作为荧光染料或标记物的用途。
17.权利要求16的用途，用于染色、标记和/或检测有机分子的技术中。
18.一种荧光标记有机化合物的方法，包括以一定的方式使权利要求1-13任意一项的化合物结合到有机化合物上，使得采用所述化合物荧光标记所述有机化合物。
19.权利要求1-14和16-18任意一项的化合物、方法、组合物或用途，其中所述有机化合物是蛋白质、肽、糖、核酸、细胞表面分子或洗涤剂，或包含在抗体或细胞中。
20.权利要求19的化合物、方法或用途，其中所述化合物通过连接分子结合到有机化合物上。
21.一种检测包含在有机化合物的样品中的一种有机化合物的方法，该方法包括根据权利要求18的方法标记所述有机化合物，并通过监测或检测荧光检测样品中的所述有机化合物。
22.权利要求21的方法，其中当将所述样品曝露于如下波长的光时检测所述标记的有机化合物宽范围波长，优选300-560nm的波长，更优选蓝色波长。
23.权利要求21或22的方法，其中所述标记的有机化合物的荧光监测或检测是采用透照、光谱、显微术或细胞计量术。
全文摘要
本发明公开了通式(I)的荧光染料化合物。当它与一种有机化合物以一定的方式相互作用使得采用某些波长的光的激发后发射荧光时，这些化合物是有用的。当被结合到这些荧光染料化合物上时，荧光的检测和/或监测提供了有机化合物的定量或检测的措施。通式(I)，其中每个R，R’和R”是氢原子，卤素原子或选择性地被一个或多个卤素、羟基和/或氧代基团取代的直链或支链C1－20烷基，烯基或炔基；环A，B和C选择性地包括一个或多个双键；环B和C选择性地被一个或多个卤素原子取代。
文档编号C09K11/06GK1426415SQ01808529
公开日2003年6月25日 申请日期2001年4月26日 优先权日2000年4月26日
发明者菲利普·约翰·利文斯顿·贝尔, 彼得·卡鲁索 申请人:福罗若技术有限公司