一种dpyd基因多态性扩增检测试剂盒的利记博彩app
【技术领域】
[0001]本实用新型属于生物技术领域，涉及一种基因检测试剂盒，具体涉及一种DPYD基 因多态性扩增检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 5-氟尿嘧啶（5-FU)是抗代谢类抗肿瘤药，对增殖细胞有杀伤作用，广泛用于胃肠 道肿瘤、乳腺癌以及头颈部肿瘤等实体瘤的治疗。二氢嘧啶脱氢酶(DH))是5-FU降解途径中 的起始酶和限速酶，编码DH)的基因一 DPYD基因内等位基因的突变（IVS14+1G>A)是引起DPD 活性缺乏的原因之一。DH)活性降低可使5-FU的代谢减少、血药浓度升高，可能增加患者发 生不良反应的危险性。IVS14+1G>A突变体的检测作为5-FU类药物使用前的例行筛查，可以 减少患者严重毒副反应的发生（Andre B.P.van Kuilenburg.Clinical Cancer Research.2000,6:4705-4712)〇 【实用新型内容】
[0003] 本实用新型的目的：提供一种DPYD基因多态性扩增检测试剂盒，能较好的应用于 DPYD基因 IVS14+1G>A多态性检测，体积小，便于运输携带和使用，克服了目前对DPYD检测特 异性不强，检测成本高且方法较复杂的不足之处。
[0004] 为实现上述目的，本实用新型采用以下技术方案：
[0005] -种DPYD基因多态性扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括:盒体（1)、 衬垫(2)，所述的衬垫(2)置于盒体（1)内，衬垫(2)上设有的容器孔装有多个装有试剂的离 心管，分别为装有PCR反应液的离心管(3)、装有阳性对照1的离心管(4)、装有阳性对照2的 离心管(5)、装有阳性对照3的离心管(6)、装有阴性对照的离心管(7)。
[0006] 试剂盒结构如图1所示。
[0007] 上述的装有PCR反应液的离心管为2ml离心管，装有阳性对照1、阳性对照2、阳性对 照3、阴性对照的可立冻存管均为0.5ml离心管。
[0008] 上述的PCR反应液包括DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶）、引物、探针及Mg2 +，所述的探针为TaqMan MGB探针(美国Applied Biosystems公司生产）。
[0009] 优选地，所述的阳性对照包括阳性对照1、阳性对照2、阳性对照3,所述的阳性对照 1为含野生型纯合子DPYD序列的质粒，阳性对照2为含突变体纯合子DPYD序列的质粒，阳性 对照3为等比例混合的阳性对照1和阳性对照2。
[0010]根据所述的DPYD基因多态性检测试剂盒的检测方法，其主要特点是，所述的检测 方法包括：
[0011] 1、加样准备:将待检样本的基因组DNA取5yL加入PCR反应液45yL中待扩增；
[0012] 2、PCR扩增:进行PCR扩增，并检测荧光信号；
[0013] 3、分析结果:在同时满足四个对照组标准的情况下，分析样本检测结果；
[0014]其中所述的荧光检测步骤中将Base I ine设为3~15，荧光阈值设定原则为阈值线 刚好超过阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值显示为Undet。
[0015] 优选地，所述的PCR扩增步骤包括：
[0016] 1、样品设置:在仪器软件的相应样本设置窗口内填写各样本的名称。
[0017] 2、荧光通道选择:每个样品选择FAM和VIC 2个通道。参比荧光设置为none。
[0018] 3、反应条件设定:反应体积设定为50yL，UNG酶反应条件为37 °C加热5分钟，预变性 条件为95°C加热5分钟，变性条件为95°C，15秒，以及退火、延伸及检测荧光条件为60°C，1分 钟，共40个循环。
[0019] 进一步优选地，所述的四个对照组标准如下：
[0020] 阴性对照:FAM通道和VIC通道无明显扩增曲线，且Ct显示为Undet。
[0021] 阳性对照I: VIC通道有扩增曲线，且Ct〈36;FAM通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示 为Undet〇
[0022] 阳性对照2: FAM通道有扩增曲线，且Ct〈36; VIC通道无明显S型扩增曲线，且Ct显示 为Undet〇
[0023] 阳性对照3:FAM、VIC通道有典型的扩增曲线，且Ct〈36;
[0024]上述四个条件必须同时满足，否则，本次试验无效。
[0025]进一步优选地，所述的DPYD的基因多态性位点为IVS14+1G>A位点。
[0026]采用了该实用新型中的检测试剂盒及检测方法，其优点在于：
[0027] 1、降低耗材的使用以便降低检测成本，采用本实用新型的方法在操作的全过程中 需要的耗材只有扩增使用的八连管或96孔板以及移液器吸头。
[0028] 2、检测结果准确，降低假阳性结果的出现，在扩增步骤加入阴性对照和阳性对照， 以此可以有效提高对假阳性和假阴性出现的判断。
[0029] 3、对实验污染的有效减少，a.本实用新型采用荧光探针PCR方法，既将核酸的PCR 扩增所用试剂组分一次性加入反应管中并采用荧光PCR仪进行扩增反应，为全封闭反应检 测环境;b.加入UNG酶并以dUTP替代dNTP等PCR污染控制措施可有效防止PCR的污染;c.采用 TaqMan MGB探针以提高检测特异性;用于检测DPYD基因多态性的等位基因特异性核酸引物 和用于检测DPYD基因多态性的寡核苷酸探针，探针为TaqMan MGB探针，TaqMan MGB探针与 传统的TaqMan探针相比，其在扩增检测过程中可有效降低背景信号的干扰，因而测定的特 异性要好于传统的TaqMan探针。因此，TaqMan MGB探针更适合用于鉴定点突变，提高检测性 能，涉及到的引物和探针均可特异地与DPYD的IVS14+1G>A多态性位点进行杂交。
【附图说明】
[0030] 图1为本实用新型的DPYD基因检测试剂盒结构示意图；
[0031 ]图2为本实用新型的杂合子样本检测结果图；
[0032] 图3为本实用新型的野生型纯合子样本检测结果图；
[0033] 图4为本实用新型突变型纯合子样本检测结果图。
【具体实施方式】
[0034] 为了能够更清楚地描述本实用新型的技术内容，下面结合具体实施例来进行进一 步的描述。
[0035]本实用新型所述的DPYD基因多态性检测的检测试剂盒组成如下：
[0037]本实用新型所述的DPYD基因 IVS14+1G>A位点多态性检测的检测方法如下：
[0038] 1、从实用新型试剂盒中取出PCR反应液，室温解冻，完全融化后，轻轻振荡混匀，并 作短暂离心备用。
[0039] 2、取待检测全血样本，常规提取DNA，取5yL作为模板。
[0040] 3、反应液分装，反应体系为50yL，每反应总体积(50yL) = PCR反应液(45yL) +模板 (5yL)〇
[0041] 4、加样，在准备好试剂的PCR反应管中分别加入阴性对照、待测样本DNA、阳性对照 各5yL，盖紧管盖后，瞬时低速离心。
[0042] 5、PCR 扩增：
[0043] 5.1、样品设置:在仪器软件的相应样本设置窗口内填写各样本的名称、类型。
[0044] 5.2、荧光通道选择：每个样品选择FAM和VIC 2个通道。参比荧光（Passive Reference)设置为none 〇
[0045] 5 · 3、反应条件设定:37 °CUNG酶反应5分钟，95 °C预变性5分钟，95 °C 15秒，60 °C 1分 钟，扩增反应为40个循环。
[0046] 6、结果分析
[0047] ABI 7500荧光PCR仪:将Baseline设为3-15(根据实际情况，Baseline Cycler可在 一定范围内变化），荧光阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品扩增曲线 (无规则的噪音线）的最高点，且Ct值显示为Undet。使用仪器配套软件自动分析结果。
[0048] 7、质控标准
[0049] 7.1、阴性对照:FAM通道和VIC通道无明显扩增曲线，且Ct显示为Undet。
[0050] 7.2、阳性对照I: VIC通道有扩增曲线，且Ct〈36; FAM通道无明显S型扩增曲线，且Ct 显示为Undet。
[0051 ] 7.3、阳性对照2: FAM通道有扩增曲线，且Ct〈36; VIC通道无明显S型扩增曲线，且Ct 显示为Undet。
[0052] 7.4、阳性对照3: FAM、VIC通道有典型的扩增曲线，且Ct〈36。
[0053] 7.5、上述四个条件必须同时满足，否则，本次试验无效。
[0054] 8、检验结果解释
[0055]在实验有效的前提下，结果分析如下：
L0057J 纯合于野生型阳性对照序列：
[0058] TGGCCCTGGACAAAGCTCCTTTCTGAATATTGAGCTCATCAGTGAGAAAACGGCTGCATATTGGTGTCAAAGTGTCA CTGAACTAAAGGCTGACTTTCCAGACAACGTAAGTGTGATTTAACATCTAAAACAAGAGAATTGGCATAAGTTGGTG AATGTTTATTTAAACATCCAAT
[0059] 纯合子突变体阳性对照序列：
[0060] TGGCCCTGGACAAAGCTCCTTTCTGAATATTGAGCTCATCAGTGAGAAAACGGCTGCATATTGGTGTCAAAGTGTCA CTGAACTAAAGGCTGACTTTCCAGACAACATAAGTGTGATTTAACATCTAAAACAAGAGAATTGGCATAAGTTGGTG AATGTTTATTTAAACATCCAAT
[0061 ] PCR扩增所使用的引物序列：
[0063] 探针序列
[0065] PCR反应液配方：
[0067] 本实用新型中对样本的检测结果如图2(杂合子）、图3(野生型纯合子）、图4(突变 体纯合子)所示，结果分析依据【具体实施方式】7、8。图中圆圈圈定部分为FAM通道检测曲线； 方框圈定部分为VIC通道检测曲线。
[0068]在此说明书中，本实用新型已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以 作出各种修改和变换而不背离本实用新型的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是 说明性的而非限制性的。
[0069]综上所述，本实用新型结构简单、使用方便、设计合理、检测过程不易受污染，该试 剂盒在DPYD基因多态性扩增检测时具有敏感性钙、特异性强、耗时短、方便运输等优点。
【主权项】
1. 一种DPYD基因多态性扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括:盒体（1)、衬 垫(2)，所述的衬垫(2)置于盒体（1)内，衬垫(2)上设有的容器孔装有多个装有试剂的离心 管，分别为装有PCR反应液的离心管(3 )、装有阳性对照1的离心管(4 )、装有阳性对照2的离 心管(5)、装有阳性对照3的离心管(6)、装有阴性对照的离心管(7)。2. 根据权利要求1所述的一种DPYD基因多态性扩增检测试剂盒，其特征在于，所述衬垫 (2)上的容器孔有5个，每个容器孔分别放置有装有PCR反应液的离心管(3)、装有阳性对照1 的离心管(4)、装有阳性对照2的离心管(5)、装有阳性对照3的离心管(6)、装有阴性对照的 离心管(7)。3. 根据权利要求1所述的一种DPYD基因多态性扩增检测试剂盒，其特征在于，所述的衬 垫(2)上的容器孔分为两排排列。
【专利摘要】本实用新型公开了一种DPYD基因多态性扩增检测试剂盒,其包括盒体(1)、衬垫(2)，所述的衬垫(2)置于盒体(1)内，衬垫(2)上设有的容器孔装有多个装有试剂的离心管，分别为装有PCR反应液的离心管(3)、装有阳性对照1的离心管(4)、装有阳性对照2的离心管(5)、装有阳性对照3的离心管(6)、装有阴性对照的离心管(7)。该试剂盒可用于检测DPYD基因IVS14+1G>A突变多态性，所述检测的方法有操作简便、耗时短、特异性强等优点。
【IPC分类】C12Q1/68, C12M1/34
【公开号】CN205313555
【申请号】CN201620052230
【发明人】卿志荣, 郑帮
【申请人】上海睿玻生物科技有限公司
【公开日】2016年6月15日
【申请日】2016年1月20日