检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂和方法
【专利摘要】本发明公开了检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂和方法。本发明公开的成套试剂，由BMPR2?PG、ACVRL1?PG、SMAD4?PG、SMAD9?PG、KCNK3?PG、NOTCH3?PG、CAV1?PG、ENG?PG和VIP?PG这九个引物组组成，这九个引物组的各单链DNA的序列分别如序列表中序列1?330所示。实验证明，利用本发明的检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂的检测结果与利用高通量测序方法进行检测的结果一致，表明可以利用本发明的成套试剂检测肺动脉高压相关基因是否发生突变。
【专利说明】
检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂和方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域中检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂 和方法。
【背景技术】
[0002] 肺动脉高压（Pulmonary Arterial Hypertension，PAH)是一种极度严重的疾病。 虽然近年来一些新的药物及基因治疗、活体肺移植、房间隔造痿等新疗法的应用，使患者5 年或10年平均生存率提高，但其治疗方案多只是缓解症状，而不能改变疾病的进程与临床 后果。其中一个重要原因是PAH的致病突变还未完全清楚，其发病机制与临床表型的关系还 未明确。骨形成蛋白2型受体、五羟色胺、五羟色胺转运体，前列环素受体、前列环素合酶、电 压门控的钾通道、一氧化氮、内皮素-1，内皮素 A受体、B受体和活性氧等基因编码区域的改 变都可能与PAH的形成有关。因此，对上述蛋白质基因调控的理解，将有助于更为深刻的认 识PAH的病因、预后以及治疗等。
[0003] 最早鉴定PAH的致病基因和突变的方法是候选基因法，及最新兴起的目标区域（已 被前期研究识别）高通量测序方法，然而，这些方法费时及花费较高，在临床上应用受到限 制。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是如何检测肺动脉高压相关基因 (BMPR2基因、ACVRLl 基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因）是否 发生突变。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了检测肺动脉高压相关基因是否发生突变 的成套试剂。
[0006] 本发明所提供的检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂，?ΒΜΡΚ2-PG、ACVRLI-PG、SMAD4-PG、SMAD9-PG、KCNK3-PG、N0TCH3-PG、CAVl-PG、ENG-PG和/或VIP-PG组 成；所述肺动脉高压相关基因为BMPR2基因、ACVRLl基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基 因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和/或VIP基因；
[0007] 所述BMPR2-PG可为由序列表中序列1-30所示的单链DNA组成的引物组，其中，序列 2a-l与序列2a所示的单链DNA为成对引物，a为1至15中的任一个自然数；
[0008] 所述ACVRLI-PG可为由序列表中序列31 -46所示的单链DNA组成的引物组，其中，序 列2b-l与序列2b所示的单链DNA为成对引物，b为16至23中的任一个自然数；
[0009] 所述SMAD4-PG可为由序列表中序列47-64所示的单链DNA组成的引物组，其中，序 列2c-l与序列2c所示的单链DNA为成对引物，c为24至32中的任一个自然数；
[0010] 所述SMAD9-PG可为由序列表中序列65-76所示的单链DNA组成的引物组，其中，序 列2d-l与序列2d所示的单链DNA为成对引物，d为33至38中的任一个自然数；
[0011] 所述KCNK3-PG可为由序列表中序列77-84所示的单链DNA组成的引物组，其中，序 列2e-l与序列2e所示的单链DNA为成对引物，e为39至42中的任一个自然数；
[0012] 所述N0TCH3-PG可为由序列表中序列85-136所示的单链DNA组成的引物组，其中， 序列2f_l与序列2f所示的单链DNA为成对引物，f为43至68中的任一个自然数；
[0013] 所述CAVl-PG可为由序列表中序列137-142所示的单链DNA组成的引物组，其中，序 列2g-l与序列2g所示的单链DNA为成对引物，g为69至71中的任一个自然数；
[0014] 所述ENG-PG可为由序列表中序列143-164所示的单链DNA组成的引物组，其中，序 列2h-l与序列2h所示的单链DNA为成对引物，h为72至82中的任一个自然数；
[0015] 所述VIP-PG可为由序列表中序列165-172所示的单链DNA组成的引物组，其中，序 列2i-l与序列2i所示的单链DNA为成对引物，i为83至86中的任一个自然数。
[0016] 上述成套试剂中，所述BMPR2-PG为由能与BMPR2基因特异结合的单链DNA组成的引 物组；
[0017] 所述ACVRLl -PG为由能与ACVRLl基因特异结合的单链DNA组成的引物组；
[0018] 所述SMAD4-PG为由能与SMAD4基因特异结合的单链DNA组成的引物组；
[0019 ] 所述SMAD9-PG为由能与SMAD9基因特异结合的单链DNA组成的引物组；
[0020] 所述KCNK3-PG为由能与KCNK3基因特异结合的单链DNA组成的引物组；
[0021] 所述N0TCH3-PG为由能与N0TCH3基因特异结合的单链DNA组成的引物组；
[0022]所述CAVl -PG为由能与CAVl基因特异结合的单链DNA组成的引物组；
[0023]所述ENG-PG为由能与ENG基因特异结合的单链DNA组成的引物组；
[0024]所述VIP-PG为由能与VIP基因特异结合的单链DNA组成的引物组。
[0025] 上述成套试剂中，所述BMPR2-PG可满足以下条件:通过利用所述BMPR2-PG进行PCR 扩增并对得到的PCR扩增产物进行测序获得BMPR2基因的全长序列，BMPR2基因的全长序列 可通过将所述BMPR2-PG的PCR扩增产物的序列进行拼接得到；
[0026] 所述ACVRL1-PG可满足以下条件:通过利用所述ACVRL1-PG进行PCR扩增并对得到 的PCR扩增产物进行测序获得ACVRLl基因的全长序列，ACVRLl基因的全长序列可通过将所 述ACVRLl -PG的PCR扩增产物的序列进行拼接得到；
[0027] 所述SMAD4-PG可满足以下条件:通过利用所述SMAD4-PG进行PCR扩增并对得到的 PCR扩增产物进行测序获得SMAD4基因的全长序列，SMAD4基因的全长序列可通过将所述 SMAD4-PG的PCR扩增产物的序列进行拼接得到；
[0028] 所述SMAD9-PG可满足以下条件:通过利用所述SMAD9-PG进行PCR扩增并对得到的 PCR扩增产物进行测序获得SMAD9基因的全长序列，SMAD9基因的全长序列可通过将所述 SMAD9-PG的PCR扩增产物的序列进行拼接得到；
[0029] 所述KCNK3-PG可满足以下条件:通过利用所述KCNK3-PG进行PCR扩增并对得到的 PCR扩增产物进行测序获得KCNK3基因的全长序列，KCNK3基因的全长序列可通过将所述 KCNK3-PG的PCR扩增产物的序列进行拼接得到；
[0030] 所述N0TCH3-PG可满足以下条件：通过利用所述N0TCH3-PG进行PCR扩增并对得到 的PCR扩增产物进行测序获得N0TCH3基因的全长序列，N0TCH3基因的全长序列可通过将所 述N0TCH3-PG的PCR扩增产物的序列进行拼接得到；
[0031] 所述CAVl-PG可满足以下条件:通过利用所述CAVl-PG进行PCR扩增并对得到的PCR 扩增产物进行测序获得CAVl基因的全长序列，CAVl基因的全长序列可通过将所述CAVl-PG 的PCR扩增产物的序列进行拼接得到；
[0032] 所述ENG-PG可满足以下条件:通过利用所述ENG-PG进行PCR扩增并对得到的PCR扩 增产物进行测序获得ENG基因的全长序列，ENG基因的全长序列可通过将所述ENG-PG的PCR 扩增产物的序列进行拼接得到；
[0033] 所述VIP-PG可满足以下条件:通过利用所述VIP-PG进行PCR扩增并对得到的PCR扩 增产物进行测序获得VIP基因的全长序列，VIP基因的全长序列可通过将所述VIP-PG的PCR 扩增产物的序列进行拼接得到。
[0034] 所述PCR扩增均可为以相应的全长基因为模板进行的PCR扩增。
[0035] 上述成套试剂中，所述成套试剂中各单链DNA的摩尔数比例可以根据实际检测的 样品进行调整，所述成套试剂中各单链DNA的摩尔数液均可相同。
[0036]所述成套试剂中的各单链DNA均可独立包装，也可包装在一起;也可将其中的成对 引物单独包装，也可以将其中的至少两个成对引物包装在一起;也可根据检测的目的基因 的不同将针对同一基因的引物组分别进行单独包装或将针对几个基因的引物组包装在一 起（即将所述 BMPR2-PG、所述 ACVRL1-PG、所述 SMAD4-PG、所述 SMAD9-PG、所述 KCNK3-PG、所述 N0TCH3-PG、所述CAV1-PG、所述ENG-PG和所述VIP-PG均分别包装或将其中的至少两个包装 在一起)。
[0037] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测所述肺动脉高压相关基因是否发生突 变的系统。
[0038] 本发明所提供的检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的系统，包括所述成套试 剂和Yl;所述Yl为进行PCR扩增所需要的试剂和/或仪器。
[0039] 上述系统中，所述系统可为包括所述成套试剂和所述进行PCR扩增所需要的试剂 的试剂或试剂盒。所述进行PCR扩增所需要的试剂可为2XKAPA HiFi HotStart ReadyMix。 2 XΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix为ΚΑΡΑ Biosystems产品。
[0040] 为解决上述技术问题，本发明还提供了检测所述肺动脉高压相关基因是否发生突 变的方法。
[0041] 本发明所提供的检测或辅助检测所述肺动脉高压相关基因是否发生突变的方法， 包括：以待测人离体肺组织的基因组DNA为模板，利用所述成套试剂进行多重PCR扩增，得到 PCR扩增产物;将所述PCR扩增产物的序列与野生型的BMPR2基因（在NCBI中的序列号为ΝΜ_ 001204)、ACVRL1基因（在NCBI中的序列号为ΝΜ_000020)、SMAD4基因（在NCBI中的序列号为 NM_005359)、SMAD9基因（在NCBI中的序列号为NM_001127217)、KCNK3基因（在NCBI中的序列 号为NM_002246)、N0TCH3基因（在NCBI中的序列号为NM_000435)、CAVl基因（在NCBI中的序 列号为匪_001172895)4如基因（在％81中的序列号为匪_000118)和￥1?基因（在％81中的 序列号为NM_003381)中相应基因的序列进行比对，确定所述肺动脉高压相关基因是否发生 突变。
[0042]上述方法中，所述多重PCR扩增可在55°C的退火温度下进行。所述多重PCR扩增可 在55°C的退火温度下退火30秒。所述多重PCR扩增的反应条件具体可为：98°C5min;98°C 3〇86。，551€3〇86(3,721€4586(3，循环20次；72 1€511^11。
[0043]上述方法中，所述多重PCR扩增可在反应体系1中进行;所述反应体系1可由所述待 测人血液的基因组DNA、所述成套试剂、2 XKAPA HiFi HotStart ReadyMix和水组成。所述 反应体系1中所述待测人离体肺组织的基因组DNA的浓度可为50ng/20yl，所述成套试剂的 浓度可为12.5mM。
[0044] 上述方法还可包括:对所述多重PCR的产物依次进行A-加尾、连接接头和扩增。
[0045] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述任一应用：
[0046] XI、所述成套试剂在制备预测或辅助预测肺动脉高压产品中的应用；
[0047] X2、所述成套试剂在预测或辅助预测肺动脉高压中的应用；
[0048] X3、所述成套试剂在制备检测或辅助检测所述肺动脉高压相关基因是否发生突变 产品中的应用；
[0049] X4、所述成套试剂在检测或辅助检测所述肺动脉高压相关基因是否发生突变中的 应用；
[0050] X5、所述系统在制备预测或辅助预测肺动脉高压产品中的应用；
[0051] X6、所述系统在预测或辅助预测肺动脉高压中的应用；
[0052] X7、所述系统在制备检测或辅助检测所述肺动脉高压相关基因是否发生突变产品 中的应用；
[0053] X8、所述系统在检测或辅助检测所述肺动脉高压相关基因是否发生突变中的应 用；
[0054] X9、所述方法在预测或辅助预测肺动脉高压中的应用。
[0055] 为解决上述技术问题，本发明还提供了预测或辅助预测人是否患有肺动脉高压的 方法。
[0056] 本发明所提供的预测或辅助预测待测对象是否患有肺动脉高压的方法，包括:利 用所述检测所述肺动脉高压相关基因是否发生突变的方法确定所述肺动脉高压相关基因 是否发生突变，所述肺动脉高压相关基因发生突变的待测对象患有肺动脉高压的风险高于 或候选高于所述肺动脉高压相关基因不发生突变的待测对象。
[0057]实验证明，利用本发明的检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂对三 个肺动脉高压患者家系中的81?1?2、4(^此1、5獻04、5獻09、此疆3、勵了013、04￥^吣和￥1?基 因的序列进行检测，发现家系1中的肺动脉高压患者的BMPR2基因的第1038位由胸腺嘧啶 (T)突变为了胞嘧啶(C)，其他基因均未发生突变，而非肺动脉高压患者的这九个基因均未 发生突变;家系2中的BMPR2基因的第1042位由鸟嘌呤(G)突变为了腺嘌呤(A)，其他基因均 未发生突变，而非肺动脉高压患者的这九个基因均未发生突变;非家系3中的肺动脉高压患 者的ACVRLl基因的第1450位由胞嘧啶(C)突变为了胸腺嘧啶(T)，其他基因均未发生突变， 而非肺动脉高压患者的这九个基因均未发生突变。这些结果与利用高通量测序方法进行检 测的结果一致。表明，本发明的检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂可以用 来检测肺动脉高压相关基因是否发生突变。
[0058]因此，
【申请人】针对肺动脉高压相关基因，建立了基于多重PCR的检测肺动脉高压相 关基因是否发生突变的方法。利用该方法可确定目标基因是否发生突变进而可筛查PAH的 已知致病突变，为患者快速作出基因诊断。也可以针对通过排查已知致病突变收集到的已 知突变阴性的PAH家系，建立队列，进行全外显子的基因测序，搜寻与疾病共分离的致病新 突变。
[0059]考虑到合并BMPR2、ACVRLI、SMAD4、SMAD9、KCNK3、N0TCH3、CAVI、ENG、VIP基因突变 PAH可能的不良预后，应对PAH患者，尤其是遗传性PAH、特发性PAH和/或合并HHT的患者及亲 属行基因突变检测，为提早确诊病变，为无症状亲属提供发病危险度预测有重要意义，对合 并突变的潜在发病者，建议每3年复查超声心动图，结合临床症状的严密观察，对PAH的早期 诊断和干预以改善临床预后有重大意义。对儿童PAH患者，也应积极行基因检测以尽早为病 因的明确提供依据，检测双亲以发现携带致病基因突变的高患病风险者，同时测定父母再 行生育后代患病的风险度。
[0060] 本发明的实验证明，本发明发现一种新的肺动脉高压致病基因突变位点，其与肺 动脉高压相关，通过检测是否为该突变位点，预测待测样本是否患有肺动脉高压，其可以作 为治疗肺动脉高压的靶点，为日后研究肺动脉高压药物提供新的治疗途径。
【附图说明】
[0061] 图1为三个肺动脉高压患者样本家系图。其中，图A、图B和图C分别为肺动脉高压患 者样本家系1、家系2和家系3,箭头所示患者为该家系中肺动脉高压先证者。
[0062]图2为三个肺动脉高压患者样本家系中肺动脉高压患者DNA的测序验证结果。其 中，A为家系1中肺动脉高压患者BMPR2基因的第1038位附近的DNA测序结果，B为家系2中肺 动脉高压患者BMPR2基因的第1042位附近的DNA测序结果，C为家系3中肺动脉高压患者 ACVRLl基因的第1450位附近的DNA测序结果。
【具体实施方式】
[0063]下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0064] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0065] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0066] 下述实施例中的2 XKAPA HiFi HotStart ReadyMix为KAPA Biosystems产品，产 品目录号为KK2601。
[0067] 实施例1、利用检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂检测肺动脉高 压相关基因是否发生突变
[0068] -、检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂的制备
[0069] 检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂，由BMPR2-PG、ACVRL1-PG、 SMAD4-PG、SMAD9-PG、KCNK3-PG、N0TCH3-PG、CAVl -PG、ENG-PG 和 VIP-PG 组成；
[0070] BMPR2-PG为由序列表中序列1-30所示的单链DNA组成的引物组，其中，序列2a-l与 序列2a所示的单链DNA为成对引物，a为I -15中的自然数;BMPR2-PG可满足以下条件:通过利 用BMPR2-PG以BMPR2基因为模板进行PCR扩增并对得到的PCR扩增产物进行测序可以获得 BMPR2基因的全长序列，BMPR2基因的全长序列可通过将BMPR2-PG的PCR扩增产物的序列进 行拼接得到；
[0071] ACVRLI-PG为由序列表中序列31 -46所示的单链DNA组成的引物组，其中，序列2b-1 与序列2b所示的单链DNA为成对引物，b为16-23中的自然数;ACVRLl -PG可满足以下条件:通 过利用ACVRL1-PG以ACVRLl基因为模板进行PCR扩增并对得到的PCR扩增产物进行测序可以 获得ACVRLl基因的全长序列，ACVRLl基因的全长序列可通过将ACVRL1-PG的PCR扩增产物的 序列进行拼接得到；
[0072] SMAD4-PG为由序列表中序列47-64所示的单链DNA组成的引物组，其中，序列2c-l 与序列2c所示的单链DNA为成对引物，c为24-32中的自然数;SMAD4-PG可满足以下条件:通 过利用SMAD4-PGG以SMAD4基因为模板进行PCR扩增并对得到的PCR扩增产物进行测序可以 获得SMAD4基因的全长序列，SMAD4基因的全长序列可通过将SMAD4-PG的PCR扩增产物的序 列进行拼接得到；
[0073] SMAD9-PG为由序列表中序列65-76所示的单链DNA组成的引物组，其中，序列2d-l 与序列2d所示的单链DNA为成对引物，d为33-38中的自然数;SMAD9-PG可满足以下条件:通 过利用SMAD9-PG以SMAD9基因为模板进行PCR扩增并对得到的PCR扩增产物进行测序可以获 得SMAD9基因的全长序列，SMAD9基因的全长序列可通过将SMAD9-PG的PCR扩增产物的序列 进行拼接得到；
[0074] KCNK3-PG为由序列表中序列77-84所示的单链DNA组成的引物组，其中，序列2e-l 与序列2e所示的单链DNA为成对引物，e为39-42中的自然数;KCNK3-PG可满足以下条件:通 过利用KCNK3-PG以KCNK3基因为模板进行PCR扩增并对得到的PCR扩增产物进行测序可以获 得KCNK3基因的全长序列，KCNK3基因的全长序列可通过将KCNK3-PG的PCR扩增产物的序列 进行拼接得到；
[0075] N0TCH3-PG为由序列表中序列85-136所示的单链DNA组成的引物组，其中，序列2f-1与序列2f所示的单链DNA为成对引物，f为43-68中的自然数;N0TCH3-PG可满足以下条件： 通过利用N0TCH3-PG以N0TCH3基因为模板进行PCR扩增并对得到的PCR扩增产物进行测序可 以获得N0TCH3基因的全长序列，N0TCH3基因的全长序列可通过将N0TCH3-PG的PCR扩增产物 的序列进行拼接得到；
[0076] CAVl-PG为由序列表中序列137-142所示的单链DNA组成的引物组，其中，序列2g-l 与序列2g所示的单链DNA为成对引物，g为69-71中的自然数;CAV卜PG可满足以下条件:通过 利用CAVl-PG以CAVl基因为模板进行PCR扩增并对得到的PCR扩增产物进行测序可以获得 CAVl基因的全长序列，CAVl基因的全长序列可通过将CAVl-PG的PCR扩增产物的序列进行拼 接得到；
[0077] ENG-PG为由序列表中序列143-164所示的单链DNA组成的引物组，其中，序列2h-l 与序列2h所示的单链DNA为成对引物，h为72-82中的自然数;ENG-PG可满足以下条件:通过 利用ENG-PG以ENG基因为模板进行PCR扩增并对得到的PCR扩增产物进行测序可以获得ENG 基因的全长序列，ENG基因的全长序列可通过将ENG-PG的PCR扩增产物的序列进行拼接得 到；
[0078] VIP-PG为由序列表中序列165-172所示的单链DNA组成的引物组，其中，序列2i-l 与序列2i所示的单链DNA为成对引物，i为83-86中的自然数;VIP-PG可满足以下条件:通过 利用VIP-PG以VIP基因为模板进行PCR扩增并对得到的PCR扩增产物进行测序可以获得VIP 基因的全长序列，VIP基因的全长序列可通过将VIP-PG的PCR扩增产物的序列进行拼接得 到。
[0079] 检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂中各单链DNA独立包装，各单 链DNA的摩尔数均相同。
[0080] 二、肺动脉高压相关基因是否发生突变的检测
[0081] 三个肺动脉高压患者样本家系图如图1所示，图1中A为家系1的家系图，B为家系2 的家系图，C为家系3的家系图。其中家系1有三个患者，其余均非肺动脉高压患者，另外二个 散发肺动脉高压患者(即家系2中患者和家系3中患者），其父母为均非肺动脉高压患者。
[0082] 按照下述方法利用步骤一的检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂 分别对该家系每个人的肺动脉高压相关基因是否发生突变进行检测：
[0083] 1、基因组DNA的提取：
[0084] 取待检测样本抗凝全血，利用QIAGEN公司DNA提取试剂盒提取得到待检测样本基 因组DNA;
[0085] 2、多重PCR扩增
[0086] 多重PCR扩增反应体系如下:待检测样本基因组DNA 50ng;步骤一的检测肺动脉高 压相关基因是否发生突变的成套试剂(该成套试剂中所有单链DNA在该反应体系中的总浓 度为 12.5mM);2XKAPA HiFi HotStart ReadyMix 10μ1;(ΜΗ2〇补至20μ1。
[0087] 多重PCR扩增反应的条件为:98°C预变性5min; 98 °C变性30sec，55 °C退火30sec，72 。(:延伸45sec，循环20次;72°C终末延伸5min。
[0088] 将得到的PCR扩增产物利用QIAGEN公司的PCR产物纯化试剂盒进行纯化，得到纯化 后的PCR扩增产物。
[0089] 3、建立文库(用于二代测序，该步骤为二代测序上机前样本制备）
[0090] 3 .IA-加尾
[0091 ] 反应体系为：步骤2的纯化后的PCR扩增产物8μ1，10 Xblue buffer(Enzymatics， BOl I) I · 25μ1，dATP( lmM)2 · 5μ1 (Enzymatics公司），Klenow(3 ' -5 ' exo_) (Enzymatics公司， P7010-HC-L) 0 · 75μI，总体积为12 · 5μI。
[0092] 将上述反应体系在37度下孵育30min，然后向反应体系中加入25μ1 AMPure XP磁 珠 (Beckman Coulter ,Α63880，是一种能够获得高质量DNA产物的核酸纯化试剂盒;纯化后 的核酸纯度高，无盐离子残留，无需离心或过滤)进行分选，得到成功加尾的PCR扩增产物， 将成功加尾的PCR扩增产物溶于8μ1溶解缓冲液中得到加尾的PCR扩增产物。
[0093] 3.2接头连接
[0094] 反应体系：步骤3.1的加尾的PCR扩增产物7.5yl，2XRapid ligation buffer (Enzymatics 公司，BlOl ) 12 · 5μ1，Adapters( ΙΟμΜ) (Adptor 序列：InPEAl， GATCGGAAGAGCACACGTCT;InPEA2，ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT，经退火后使用） 2.5yl，T4DNA Ligase(Enzymatics公司，1^603-!1(：-〇2.5以1，总体积为2541。
[0095] 将上述反应体系在20度下孵育15min，然后向反应体系中加入25μ1 AMPure XP磁 珠 (Beckman Coulter ,Α63880，是一种能够获得高质量DNA产物的核酸纯化试剂盒;纯化后 的核酸纯度高，无盐离子残留，无需离心或过滤)进行分选，得到接头连接成功的PCR扩增产 物，将接头连接成功的PCR扩增产物溶于23μ1溶解缓冲液中得到连接接头的PCR扩增产物。
[0096] 3.3前扩增
[0097] 反应体系：步骤3.2的连接接头的PCR扩增产物11.5μl，PE1.0(25μM)(PE1.0序 列：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT)0·5μ1，ΡΕ 2.0+ index(25yM)0.5yl，2XKAPA HiFi HotStart ReadyMix 12·5μ1，总体积为25μ1。其中，PE 2.0+index中的各单链DNA的序列如下：
[0098] InPE-2.0-1：
[0099] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0100] InPE-2.0-2：
[0101] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0102] InPE-2.0-3：
[0103] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0104] InPE-2.0-4：
[0105] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0106] InPE-2.0-5：
[0107] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0108] InPE-2.〇-6：
[0109] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0110] InPE-2.0-7:
[0111] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0112] InPE-2.0-8:
[0113] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0114] InPE-2.0-9:
[0115] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0116] InPE-2.0-10:
[0117] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0118] InPE-2.0-1I:
[0119] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0120] InPE-2.0-12:
[0121] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0122] InPE-2.0-13:
[0123] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0124] InPE-2.0-14:
[0125] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0126] InPE-2.0-15:
[0127] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0128] InPE-2.0-16:
[0129] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0130] InPE-2.0-17:
[0131] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0132] InPE-2.0-18:
[0133] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0134] InPE-2.0-19:
[0135] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0136] InPE-2.0-20:
[0137] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
[0138] 反应条件为：98°C 预变性 2min;98°C 变性 30sec，65°C 退火 30sec，72°C 延伸 45sec， 循环16次;72°C终末延伸5min。
[0139] 反应结束后将得到的产物进行电泳检测并用QIAGEN公司的凝胶回收试剂盒进行 凝胶回收，将回收产物进行定量(测序所需满足的回收产物DNA的浓度为10-20ngAU)后进 行ILUMINA Hiseq40000二代测序（ILUMINA公司二代测序平台）。
[0140] 测序结果表明该回收产物经过测序拼接得到了BMPR2基因、ACVRLl基因、SMAD4基 因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因这9个基因的全长序 列，将这些序列与野生型的BMPR2基因（在NCBI中的序列号为NM_001204)、ACVRL1基因（在 NCBI中的序列号为NM_000020)、SMAD4基因（在NCBI中的序列号为NM_005359)、SMAD9基因 (在NCBI中的序列号为匪_001127217)、队疆3基因（在叱81中的序列号为匪_002246)、 N0TCH3基因（在NCBI中的序列号为M1_000435)、CAV1基因（在NCBI中的序列号为匪_ 001172895)、ENG基因（在NCBI中的序列号为NM_000118)和VIP基因（在NCBI中的序列号为 NM_003381)中相应基因的序列进行比对，确定待检测样本的各肺动脉高压相关基因是否发 生突变。
[0141] 结果显示，家系1中的三个肺动脉高压患者的BMPR2基因的第10 3 8位由胸腺嘧啶 (T)突变为了胞嘧啶(C)，导致BMPR2蛋白质第347位由半胱氨酸突变为了精氨酸;这三个肺 动脉高压患者的ACVRLl基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、 ENG基因和VIP基因的DNA序列均未发生突变。家系1中其他的非肺动脉高压患者的BMPR2基 因、ACVRLl基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和VIP 基因的DNA序列均未发生突变。
[0142] 家系2中肺动脉高压患者的BMPR2基因的第1042位由鸟嘌呤(G)突变为了腺嘌呤 (A)，导致BMPR2蛋白质第348位由缬氨酸突变为了异亮氨酸;该患者的ACVRLl基因、SMAD4基 因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因的DNA序列均未发生 突变。该患者的父母的BMPR2基因、ACVRL1基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3 基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因的DNA序列均未发生突变。
[0143] 家系3中肺动脉高压患者的ACVRLl基因的第1450位由胞嘧啶（C)突变为了胸腺嘧 啶(T)，导致ACVRLl蛋白质第488位由精氨酸突变为了色氨酸;该患者的BMPR2基因、SMAD4基 因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因的DNA序列均未发生 突变。该患者的父母的BMPR2基因、ACVRL1基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3 基因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因的DNA序列均未发生突变。
[0144] 另外，利用现有的高通量测序方法（目的基因捕获结合二代测序方法，由北京迈基 诺基因科技有限责任公司完成)对三个肺动脉高压患者样本家系中的肺动脉高压患者及非 肺动脉高压患者的BMPR2基因、ACVRLl基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基 因、CAVl基因、ENG基因和VIP基因进行测序，该高通量测序结果表明这三个家系中的每个个 体的BMPR2基因、ACVRLl基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、CAVl基因、 ENG基因和VIP基因的全长序列与利用本发明的利用检测肺动脉高压相关基因是否发生突 变的成套试剂检测得到的这9个基因的全长序列相同。
[0145] 通过在BMPR2基因的第1038位两侧设计引物，利用该引物分别对家系1中的三个肺 动脉高压患者的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，结果发现，三个肺动脉 高压患者的BMPR2基因的第1038位由胸腺嘧啶(T)突变为了胞嘧啶(C)(图2)，与上述结果一 致。
[0146] 通过在BMPR2基因的第1042位两侧设计引物，利用该引物分别对家系2中的肺动脉 高压患者的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，结果发现，该肺动脉高压患 者的BMPR2基因的第1042位由鸟嘌呤(G)突变为了腺嘌呤(A)(图2)，与上述结果一致。
[0147] 通过在ACVRLl基因的第1450位两侧设计引物，利用该引物分别对家系3中的肺动 脉高压患者的基因组DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测序，结果发现，该肺动脉高压 患者的ACVRLl基因的第1450位由胞嘧啶(C)突变为了胸腺嘧啶(T)(图2 )，与上述结果一致。
【主权项】
1. 检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的成套试剂，由BMPR2-PG、ACVRL1-PG、 SMAD4-PG、SMAD9-PG、KCNK3-PG、N0TCH3-PG、CAV1-PG、ENG-PG和/或 VIP-PG 组成；所述肺动脉 高压相关基因为BMPR2基因、ACVRL1基因、SMAD4基因、SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因、 CAV1基因、ENG基因和/或VIP基因； 所述BMPR2-PG为由序列表中序列1-30所示的单链DNA组成的引物组； 所述ACVRL1-PG为由序列31 -46所示的单链DNA组成的引物组； 所述SMAD4-PG为由序列47-64所示的单链DNA组成的引物组； 所述SMAD9-PG为由序列65-76所示的单链DNA组成的引物组； 所述KCNK3-PG为由序列77-84所示的单链DNA组成的引物组； 所述NOTCH3-PG为由序列85-136所示的单链DNA组成的引物组； 所述CAV 1-PG为由序列137-142所示的单链DNA组成的引物组； 所述ENG-PG为由序列143-164所示的单链DNA组成的引物组； 所述VIP-PG为由序列165-172所示的单链DNA组成的引物组。2. 根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于:所述成套试剂中各单链DNA的摩尔数 均相同。3. 检测肺动脉高压相关基因是否发生突变的系统，包括权利要求1或2所述成套试剂和 Y1;所述Π 为进行PCR扩增所需要的试剂和/或仪器。4. 根据权利要求3所述的系统，其特征在于:所述进行PCR扩增所需要的试剂为2 X ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix。5. 检测或辅助检测权利要求1中所述肺动脉高压相关基因是否发生突变的方法，包括： 以待测人离体肺组织的基因组DNA为模板，利用权利要求1或2所述成套试剂进行多重PCR扩 增，得到PCR扩增产物；将所述PCR扩增产物的序列与BMPR2基因、ACVRL1基因、SMAD4基因、 SMAD9基因、KCNK3基因、N0TCH3基因 、CAV 1基因、ENG基因和VIP基因中相应基因的序列进行 比对，确定所述肺动脉高压相关基因是否发生突变； 所述多重PCR扩增在55 °C的退火温度下进行。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于:所述多重PCR扩增在55°C的退火温度下退 火30秒。7. 根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述多重PCR扩增在反应体系1中进行； 所述反应体系1由所述待测人离体肺组织的基因组DNA、权利要求1或2所述成套试剂、2 X ΚΑΡΑ HiFi HotStart ReadyMix和水组成。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述反应体系1中所述成套试剂的浓度为 12.5mM〇9. 下述任一应用： XI、权利要求1或2所述成套试剂在制备预测或辅助预测肺动脉高压产品中的应用； X2、权利要求1或2所述成套试剂在预测或辅助预测肺动脉高压中的应用； X3、权利要求1或2所述成套试剂在制备检测或辅助检测权利要求1中所述肺动脉高压 相关基因是否发生突变产品中的应用； X4、权利要求1或2所述成套试剂在检测或辅助检测权利要求1中所述肺动脉高压相关 基因是否发生突变中的应用； X5、权利要求5所述系统在制备预测或辅助预测肺动脉高压产品中的应用； X6、权利要求5所述系统在预测或辅助预测肺动脉高压中的应用； X7、权利要求5所述系统在制备检测或辅助检测权利要求1中所述肺动脉高压相关基因 是否发生突变产品中的应用； X8、权利要求5所述系统在检测或辅助检测权利要求1中所述肺动脉高压相关基因是否 发生突变中的应用； X9、权利要求5-8中任一所述方法在预测或辅助预测肺动脉高压中的应用。10.预测或辅助预测待测对象是否患有肺动脉高压的方法，包括:利用权利要求5-8中 任一所述的方法确定权利要求1中所述肺动脉高压相关基因是否发生突变，所述肺动脉高 压相关基因发生突变的待测对象患有肺动脉高压的风险高于或候选高于所述肺动脉高压 相关基因不发生突变的待测对象。
【文档编号】C12Q1/68GK106086190SQ201610464314
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月23日
【发明人】杜杰, 朴春梅, 刘婷婷, 郑帅
【申请人】北京市心肺血管疾病研究所