一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb³⁺荧光的microRNA检测方法

一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb³⁺荧光的microRNA检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb3+荧光的microRNA检测方法，属于光学生物传感技术领域。基于聚合酶Klenow片段和末端脱氧核苷酸转移酶的共同催化作用，将microRNA有效延伸成长度较长的富鸟嘌呤DNA序列，富鸟嘌呤DNA序列通过共振能量转移效应可增强Tb3+的荧光。Tb3+的荧光强度与microRNA浓度的对数成正比，据此实现microRNA的高灵敏检测。
【专利说明】
一种基于富鸟嘌昤DNA敏化Tb3+荧光的m i croRNA检测方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb3+荧光的microRNA检测方法，属于光学生物传感技术领域。
【背景技术】
[0002]成熟的microRNA是一类单链、非编码蛋白、长度约为19-23个核苷酸的短的内源性RNAt3MicroRNA作为重要的基因表达的后转录调控因子，可调节信使核糖核酸的降解或翻译抑制。MicroRNA在许多生物进程中起着重要作用，不仅包括癌症的早期诊断和预后指标，还包括介入治疗以及癌症药物的发现。所以，开发灵敏度高且选择性好的microRNA检测方法非常必要。体外聚合核苷酸因具有显著的信号放大能力，作为一个强有力的工具广泛应用于生物分析中。在研究microRNA的检测方法方面，体外聚合核苷酸显示出巨大的应用潜能，目前常用的检测方法有聚合酶链反应、滚环扩增反应以及链置换反应等，但是这些检测方法灵敏度低、耗时、复杂或者需要昂贵的试剂。因此，探索经济方便、灵敏度和特异性高的mi croRNA检测新方法非常必要。
[0003]稀土离子(Ln3+)有独特的4f轨道，因而具有非凡的光学性质。然而，Ln3+的f-f变迀被自旋-禁止使得其吸收很弱，直接激发Ln3+发射荧光非常困难。Ln3+可以和很多配体(如，有机分子、纳米粒子、多肽和寡核苷酸链等)螯合，通过“天线”效应而发射荧光，从而可解决以上问题。Ln3+螯合物的荧光通常源于分子间的能量转移，从配体的三重激发态到Ln3+的电子态，铽离子(Tb3+)是一个典型例子，经配体敏化的Tb3+螯合物具有优越的长Stokes位移和尖锐的发射光谱等光学性质。近年来，单链DNA(ssDNA)作为Tb3+的配体，受到越来越多的关注。当Tb3+和ssDNA相互作用时，发生能量转移而导致Tb3+荧光增强，尤其是Tb3+与富鸟嘌呤的ssDNA的作用使得Tb3+荧光大大增强，而双链DNA却不能增强Tb3+的荧光。因此，我们将富鸟嘌呤(G )碱基DNA序列与Tb3+之间的共振能量转移效应应用于me i roRNA检测中，提出一种新颖的基于稀土离子焚光增强的microRNA分析方法，并用于复杂样品中microRNA的检测。

【发明内容】

[0004]本发明的目的在于提供一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb3+焚光的microRNA检测方法，该方法对microRNA的检测具有灵敏、简单、快速的优点。
[0005]本发明是这样来实现的，一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb3+焚光的microRNA检测方法，其特征在于，当microRNA存在时，引物microRNA与模板DNA杂交形成引物-模板复合物；加入聚合酶Klenow片段使其绑定在引物-模板复合物中引物的3’-羟基末端，催化引物延伸反应，生成与模板DNA互补的短DNA序列；末端脱氧核苷酸转移酶将含有脱氧三磷酸鸟嘌呤核苷和脱氧三磷酸腺嘌呤核苷的混合脱氧三磷酸核糖核苷酸添加到短DNA序列的3’-羟基末端，催化混合脱氧三磷酸核糖核苷酸沿着短DNA序列的5’端到3’端延伸而形成聚富鸟嘌呤碱基序列；加入Tb3+，富鸟嘌呤DNA序列与Tb3+相互作用发生共振能量转移，增强了 Tb3+的荧光，Tb3+的荧光强度随microRNA浓度的增加而增强，根据Tb3+的荧光强度判断microRNA的浓度，据此实现对microRNA的高灵敏检测。
[0006]本发明采用以下技术方案:一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb3+荧光的microRNA检测方法，
(I)双聚合酶延伸富鸟嘌呤DNA序列:将模板DNA和mi croRNA与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液混合，在55 °(:退火杂交10 min，冷却至室温后，加入聚合酶Klenow片段和脱氧三磷酸腺嘌呤核苷，在37 ° C水浴中等温反应30 min，超滤除去过量的脱氧三磷酸腺嘌呤核苷后，向得到的溶液中加入含0.6 mM脱氧三磷酸鸟嘌呤核苷、0.4 mM脱氧三磷酸腺嘌呤核苷和9 U末端脱氧核苷酸转移酶的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲溶液，在37 °C水浴中等温反应2.5 h，生成富鸟嘌呤DNA序列；
(2 )荧光法检测mi croRNA浓度:将Tb3+加入到步骤(I)生成的富鸟嘌呤DNA序列溶液中，室温孵育10 min后，在光程为I cm的石英池中、激发波长为290 nm、光谱扫描范围为450nm-610 nm的条件下，测量发射波长545 nm处的焚光光谱;microRNA浓度越大，生成的长的富鸟嘌呤DNA序列越多，富鸟嘌呤DNA序列与Tb3+相互作用发生的共振能量转移越强，Tb3+的荧光越强，根据Tb3+的荧光强度可实现microRNA的高灵敏检测。
[0007]上述方法中，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的浓度为10mM，pHS7.9，含50 mM NaCl和10 mM MgCl2。所述的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲溶液的浓度为20 mM,pH为7.9，含50 mM KAc、10 mM Mg(Ac)2和0.25 mM CoCl2o
[0008]本发明的技术效果是:本发明利用聚合酶Klenow片段和末端脱氧核苷酸转移酶的共同催化作用，将microRNA延伸成长度较长的富鸟嘌呤DNA序列，富鸟嘌呤DNA序列通过共振能量转移效应可增强Tb3+的荧光，Tb3+的荧光强度与microRNA浓度的对数成正比，据此实现microRNA的高灵敏检测，该方法具有灵敏、简单、快速的优点。
【附图说明】
[0009]图1是基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb3+荧光检测microRNA的原理图。
[0010]图2是(A)荧光光谱图:(a)含和(b)不含microRNA-2U(B)将Tb3+加入到不同反应溶液中的荧光光谱图。
[0011 ]图3是不同浓度microRNA-21 (O，I，2，5，10，20，50，100，200，500，1000 pM)存在时的荧光光谱图，内插图为荧光强度与microRNA-21浓度的对数关系曲线。
[0012]图4是分析方法的特异性:Blank，microRNA_141，microRNA_210，单碱基错配的microRNA-2 l(SM),完全互补的mi croRNA -21 (PM)0
[0013]图5是实际样品检测:Blank，A549和MCF-7。
【具体实施方式】
[0014]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。
[0015]实施例1
(I)双聚合酶延伸富鸟嘌呤DNA序列:将模板DNA(pDNA)和microRNA与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液混合，在55 °C退火杂交10 min，冷却至室温，使得引物microRNA与模板DNA杂交形成引物-模板复合物;加入聚合酶Klenow片段和脱氧三磷酸腺嘌呤核苷，在37 ° C水浴中等温反应30 min，使聚合酶Klenow片段绑定在引物-模板复合物中引物的3’-羟基末端，催化引物延伸反应，生成与模板DNA互补的短DNA序列;超滤除去过量的脱氧三磷酸腺嘌呤核苷后，加入含0.6 mM脱氧三磷酸鸟嘌呤核苷、0.4 mM脱氧三磷酸腺嘌呤核苷和9 U末端脱氧核苷酸转移酶的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲溶液，在37 ° C水浴中等温反应2.5h，末端脱氧核苷酸转移酶将含有脱氧三磷酸鸟嘌呤核苷和脱氧三磷酸腺嘌呤核苷的混合脱氧三磷酸核糖核苷酸添加到短DNA序列的3’-羟基末端，催化混合脱氧三磷酸核糖核苷酸沿着短DNA序列的5 ’端到3 ’端延伸而形成聚富鸟嘌呤DNA序列；
(2)荧光法检测microRNA浓度:将2 μΜ Tb3+加入到生成的富G碱基DNA序列溶液中，室温孵育10 min后，Tb3+与富G碱基DNA发生螯合反应，在光程为I cm的石英池中、激发波长为290 nm、光谱扫描范围为450 nm-610 nm的条件下，测量发射波长545 nm处的荧光光谱；microRNA浓度越大，生成的长的富G碱基DNA序列越多，富G碱基DNA序列与Tb3+相互作用发生的能量共振转移越强，Tb3+在水中的荧光越强，根据Tb3+的荧光强度可实现microRNA的高灵敏检测。检测原理如图1所示。
[0016]由图2A可见，当存在microRNA-21，最佳激发波长为290 nm时，在545 nm处出现了强的荧光发射峰(曲线a)，对应于Tb3+的特征发射峰。当存在microRNA-21时，Tb3+之所以会出现强特征发射峰，是因为生成的大量的富G碱基DNA序列能够通过共振能量转移将能量传递给Tb3+，这也同时证明了在microRNA存在的情况下，通过双酶聚合反应生成了大量的富G碱基DNA序列。然而，在相同的反应条件下，当没有microRNA-21时，在545 nm处没有明显的荧光峰出现(曲线b)。以上结果表明，在没有microRNA-21时不能合成出为Tb3+提供能量的富G碱基DNA序列，因而在545 nm处没有Tb3+的荧光光谱峰出现。而当有microRNA-21存在时，在545 nm处有强的荧光光谱峰出现，表明合成了大量的可以与Tb3+进行共振能量转移的富G碱基DNA序列。进而通过一系列对照实验对检测方法的可行性进行分析，由图2B可见，只有当pDNA、microRNA、polymerases、dNTPs和Tb3+全部存在时，才生成富G碱基的DNA序列，才能产生显著的Tb3+的特征光谱，进而实现对microRNA的检测。
[0017]实施例2
考察了荧光光谱强度随着microRNA-21浓度的变化规律。由图3可见，Tb3+的荧光强度随microRNA-21浓度的增加而增强，在microRNA-21浓度为I pM到I nM范围内，Tb3+的荧光强度与mi croRNA-21浓度的对数呈良好的线性关系(内插图)，该方法对microRNA-21的检测限为100 fMo
[0018]实施例3
为了评估本方法对microRNA-21检测的特异性，我们开展了一系列对照实验，包括采用两种 microRNAs(microRNA_210和 microRNA-141)、单喊基错配(SM)microRNA_21 为阴性对照、以及不含mi croRNA-21的样品为空白对照(BI ank )，结果如图4所示。Mi cr oRNA_210和microRNA-141存在时，Tb3+的荧光强度与空白对照的荧光强度相比没有显著增加;单碱基错配microRNA-21存在时，Tb3+的荧光强度与空白对照的荧光强度相比有较小增强;然而，完全互补(PM)microRNA-21存在时，Tb3+的荧光强度与空白对照的荧光强度相比显著增强。由此可见，本方法可以区别完全互补和非互补的microRNA，即使它们只有一个碱基的差异也能区别出来，具有良好的特异性。
[0019]我们将本方法应用于定量检测从人类乳腺癌细胞(MCF-7)和人类肺癌表皮细胞(A549)提取的细胞溶解产物中microRNA-21的表达含量。由图5可见，A549细胞溶解产物中Tb3 +的荧光强度比空白对照的荧光强度有所增加，表明在A549肺癌细胞中含有少量microRNA-21。而MCF-7细胞溶解产物中Tb3+的荧光强度与空白对照的荧光强度相比显著增强，表明MCF-7乳腺癌细胞中microRNA-21的含量比较高。以上结果表明，本方法可用于细胞溶解产物等复杂生物样品中microRNA的定量分析，具有良好的应用前景。
【主权项】
1.一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb3+荧光的microRNA检测方法，其特征在于步骤如下: (1)双聚合酶延伸富鸟嘌呤DNA序列:将模板DNA和microRNA与三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液混合，在55 °(:退火杂交10 min，冷却至室温后，加入聚合酶Klenow片段和脱氧三磷酸腺嘌呤核苷，在37 ° C水浴中等温反应30 min，超滤除去过量的脱氧三磷酸腺嘌呤核苷后，向得到的溶液中加入含0.6 mM脱氧三磷酸鸟嘌呤核苷、0.4 mM脱氧三磷酸腺嘌呤核苷和9 U末端脱氧核苷酸转移酶的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲溶液，在37 °C水浴中等温反应2.5 h，生成富鸟嘌呤DNA序列； (2)荧光法检测microRNA浓度:将Tb3+加入到步骤(I)生成的富鸟嘌呤DNA序列溶液中，室温孵育10 min后，在光程为I cm的石英池中、激发波长为290 nm、光谱扫描范围为450nm-610 nm的条件下，测量发射波长545 nm处的焚光光谱;microRNA浓度越大，生成的长的富鸟嘌呤DNA序列越多，富鸟嘌呤DNA序列与Tb3+相互作用发生的共振能量转移越强，Tb3+的荧光越强，根据Tb3+的荧光强度可实现microRNA的高灵敏检测。2.根据权利要求1所述的一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb3+焚光的microRNA检测方法，其特征在于:当microRNA存在时，引物microRNA与模板DNA杂交形成引物-模板复合物;加入聚合酶Klenow片段使其绑定在引物-模板复合物中引物的3’-羟基末端，催化引物延伸反应，生成与模板DNA互补的短DNA序列;末端脱氧核苷酸转移酶将含有脱氧三磷酸鸟嘌呤核苷和脱氧三磷酸腺嘌呤核苷的混合脱氧三磷酸核糖核苷酸添加到短DNA序列的3’-羟基末端，催化混合脱氧三磷酸核糖核苷酸沿着短DNA序列的5’端到3’端延伸而形成聚富鸟嘌呤碱基序列；加入Tb3+，富鸟嘌呤DNA序列与Tb3+相互作用发生共振能量转移，增强了Tb3+的荧光，Tb3+的荧光强度随microRNA浓度的增加而增强，根据Tb3+的荧光强度判断microRNA的浓度，据此实现对microRNA的高灵敏检测。3.如权利要求1所述的一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb3+焚光的microRNA检测方法，其特征在于步骤(I)中，所述的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液的浓度为10 !1^，？!1为7.9，含50 mM NaCl和10 mM MgCl2。4.如权利要求1所述的一种基于富鸟嘌呤DNA敏化Tb3+焚光的microRNA检测方法，其特征在于步骤(I)中，所述的三羟甲基氨基甲烷醋酸盐缓冲溶液的浓度为20 !1^，？!1为7.9，含.50 mM KAc、10 mM Mg(Ac)2和0.25 mM CoCl2o
【文档编号】C12Q1/68GK106086183SQ201610441511
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】梁汝萍, 迟宝珠, 邱建丁
【申请人】南昌大学