固氮菌铵载体基因、突变体、固氮菌铵载体突变株及应用
【专利摘要】本发明涉及固氮菌铵载体基因、突变体、固氮菌铵载体突变株及应用，固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL?4A，已于2016年6月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.12588；固氮菌铵载体基因nrgA，能将固氮菌分泌到胞外的氨态氮运回胞内，维持固氮菌氮库的平衡，具有如SEQ ID No.1所示核苷酸序列。还包括固氮菌铵载体基因突变体、突变株。所述的突变株在缺氮或无氮环境中，能更好地利用空气中的氮气进行微生物固氮。同时，突变株保持了野生株良好的生长速度和泌铵能力，在贫瘠缺氮土壤中施用以达到增产或用于制备微生物菌肥，减少氮肥施用量，以防止由于过量施用氮肥导致的土壤酸化、温室气体排放和地下水硝酸盐污染等领域有很好的应用前景。CGMCC No. 1258820160602
【专利说明】
固氮菌铵载体基因、突变体、固氮菌铵载体突变株及应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物工程技术领域，尤其是涉及一种固氮菌铵载体基因、突变体、固氮 菌铵载体突变株及应用。
【背景技术】
[0002] 铵载体蛋白是一类存在于细胞膜上的疏水性蛋白质，在低铵的环境中，铵载体通 过主动运输的方式将胞外的铵离子运回细胞，确保细胞内的铵库稳定和细胞氮代谢的正常 运行。最早的铵载体是分离自酵母菌的mep基因，其后，从原核生物枯草芽孢杆菌和大肠杆 菌中分别克隆了铵载体nrgA和amtB基因，这2个基因序列相似性约为42%。近年来，分离铵 载体并研究其泌铵与转运机制已成为生物固氮领域的研究热点。
[0003] 在绝大多数细菌中，铵载体amtB基因和glnK基因同属于一个操纵元，glnK基因处 于amt基因的上游，两者紧密相连，共用一个启动子，它启动的转录受到氮素调控系统(ntr) 的调控，启动子为NtrC依赖型。GlnK蛋白为可溶性蛋白，它与AmtB蛋白形成复合物，起负调 控铵载体AmtB转运NH 3/NH4+活性的作用。在AmtB-GlnK的结合界面，GlnK蛋白亚基上的第47 位氨基酸即精氨酸(Arg47)与铵载体蛋白AmtB亚基上的第313位氨基酸即天冬氨酸(Asp 313) 形成盐桥。
[0004] 铵载体蛋白AmtB与GlnK蛋白的连接复合物晶体结构已经研究得比较透彻，到目前 为止已经鉴定出铵载体蛋白上与NH3/NH 4+结合的6个位点，即Aml-Am6。这些研究为从分子水 平改造铵载体以构建有效的泌铵固氮菌提供了理论依据。利用分子生物学手段，尤其是近 几年来出现的CRPSPR-Cas9基因编辑技术对铵载体基因进行定向突变，使其运载铵的能力 丧失或显著降低，理论上可以提高固氮菌的泌铵能力，作物可以直接吸收利用固氮菌分泌 到胞外的氨态氮，达到少施用化学氮肥或不施用氮肥就可以增产的目的，从而有效避免过 量施用氮肥造成的水体富营养化、土壤盐渍化等问题，实现农业的可持续发展，具有很好的 科学意义和实际应用价值。通过遗传工程改造和筛选在缺氮环境下具有较高固氮酶活性， 兼能高效泌铵的非豆科植物固氮菌成为当今微生物固氮领域的研究热点，以铵载体基因的 编辑改造为突破口无疑是实现这些目标的有效途径。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的，就是为了将玉米根际联合固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A的铵载体基因进行突变，通过CRPSPR-Cas9基因编辑技术，将该基因沉默，使之丧失 或显著降低运载铵离子的能力，达到既具有良好的生物固氮能力，又能有效泌铵。
[0006] 本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0007] 本发明采取的技术方案之一是：提供一种固氮菌，固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A，已于2016年6月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏登记号为CGMCC No. 12588。
[0008] 本发明采取的技术方案之二是：一种固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A 的铵载体基因，为具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列，该序列编码铵载体蛋白，通过该载体 蛋白能将固氮菌胞外的铵离子运回细胞内从而保证细胞氮库稳定和氮代谢的正常进行。
[0009] 所述铵载体基因序列的获取可通过PCR法扩增固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A基因组DNA实现。
[0010] 本发明采取的技术方案之三是:一种铵载体基因的突变，针对铵载体基因 DNA序列 的5'端设计2条sgRNA，以此为靶点，构建相应的Cas9-guide RNA表达载体，转化固氮菌 GXGL-4A，筛选阳性转化子。
[0011]本发明采取的技术方案之四是:一株有效的铵载体突变株，其是通过测定转化子 的固氮酶活性和胞外氨态氮含量综合筛选出来的突变株，并对涵盖nrgA-glnK基因结合区 域的DNA序列进行了测序验证。
[0012]本发明采取的技术方案之五是：对铵载体突变株进行无氮或氮限制条件下的应 用。通过采用乙炔还原法测定突变株的固氮酶活性，与野生株GXGL-4A相比，目标突变株在 Ashby无氮培养基中培养具有更高的固氮酶活性，其在富氮的LB培养基中培养，固氮酶活性 被有效抑制，显示出更好的耐低氮能力和对胞外环境的高度适应性。
[0013] 本发明的铵载体nrgA基因来源于固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A，其 突变体是在具有如序列表中SEQ ID No.l所示核苷酸序列经CRISPR-Cas9基因编辑技术突 变而来，包括多个位点的碱基取代突变获得的具有更好固氮活性功能的突变体。本发明中 的nrgA突变株Kosakonia radicincitans GXGL_4A(g5_l)在无氮Ashby培养基上的固氮酶 活性为346.32±4.16nmol C2H4/(mL · h)，而对照野生株K.radicincitans GXGL-4A的固氮 酶活性为205.14±6.21nmol C2H4/(mL · h)，两者差异达到极显著水平。同时，nrgA突变株保 持了野生株良好的生长速度和泌铵能力，在贫瘠缺氮土壤中施用以达到增产或用于制备微 生物菌肥，减少氮肥施用量，以防止由于过量施用氮肥导致的土壤酸化、温室气体排放和地 下水硝酸盐污染等领域有很好的应用前景。
【附图说明】
[0014] 图 1 是GXGL-4A固氮菌电镜照片（Tecnai G2spirit Biotwin，120kV Bio-TEM);
[0015] 图2是Kosakonia radicincitans GXGL-4A固氮菌铵载体nrgA基因的PCR扩增电泳 图谱；
[0016] 图3是构建的Cas9表达载体pET28a-cas9图谱；
[0017] 图4是Kosakonia radicincitans GXGL-4A固氮菌转化子的cas9基因检测PCR扩增 电泳图谱；
[0018] 图4中，M:marker为DL2000(TaKaRa);泳道1-4为突变株；
[0019]图5是铵载体突变株在LB培养基中的固氮酶活性筛选结果；
[0020]图5中，4A:GXGL-4A(CK)，野生株;5-1、5-2、5-3、5-4及5-11 为铵载体突变株；
[0021]图6是铵载体突变株在Ashby无氮培养基中的固氮酶活性筛选结果；
[0022]图7是铵载体突变株在Ashby无氮培养基上的生长情况；
[0023] 图8是铵载体基因突变株的生长曲线；
[0024] 图9是铵载体突变株nrgA基因突变区序列测定结果。
【具体实施方式】
[0025]下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
[0026]下列实施例中的菌种、试剂和材料来源：
[0027] 固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A，分离自广西桂林的玉米植株根上，为 联合固氮菌，革兰氏染色阴性。该菌种已于2016年6月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，简称CGMCC。地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物所;保藏登记号为CGMCC No. 12588。
[0028] 该Kosakonia radicincitans GXGL-4A电镜图如图1所不，图1中A为正二分裂的菌 群;B为二分裂中的单菌体。
[0029] Cas9表达载体pET28a_cas9由本实验室自行构建。
[0030] 细菌基因组提取纯化试剂盒购自美国上海普洛麦格生物产品有限公司；PCR产物 回收试剂盒购于德国凯杰生物技术(上海)有限公司;PCR反应所用试剂购于北京康维试剂 生物技术公司；碳酸钙、氯化钠、柠檬酸三钠、二水亚硝基铁氰化钠、苯酚、NaOH、（NH4) 2S〇4等 常规药品皆为国产分析纯。乙烯气体购于茂图气体设备(上海)有限公司。
[0031] 大肠杆菌BL21菌株购于北京全式金生物技术有限公司；实验纯化菌株GXGL-4A，质 粒pET-28a( + )为实验室保存;gRNA质粒VK001-03由北京唯尚立德生物科技有限公司惠赠； 大肠杆菌感受态细胞、低分子量蛋白质Marker、克隆载体pMD19-T、内切酶(notl、spel和 nheI)、T4DNA连接酶购于宝生物(大连)有限公司（TaKaRa);卡那霉素购于上海生工生物工 程有限公司（Sangon);质粒DNA小量提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司。
[0032] 实施例1:铵载体基因 nrgA PCR扩增
[0033]使用细菌基因组提取纯化试剂盒提取GXGL-4A菌株基因组总DNA作为模板，PCR正 向引物为nrgA-FG' -CGGGATCCATGAAAAACACAACATTAAAAACAGGTC-3')，反向引物为nrgA-R (5' -CCCAAGCTTTCAGGCGTTGTAGGCGTTTTCGCCG-3')。所用引物由上海生工生物工程公司合 成。PCR反应体系总体积为25yL，反应体系包括:2XTaq Master Mix 12.5yL、正向引物（10μ 111〇1/1)1.(^1^、反向引物（1(^111〇1/1)1.(^1^、(1(1!12〇9.541^、模板0嫩1.(^1^。？0?反应条件为 ： 94°C预变性5min;然后进行30个循环，每个循环为94°C变性lmin、55°C退火lmin和72°C延伸 2min;最后于72°C下最终延伸10min。
[0034] PCR扩增产物大小为1287bp (如图2所示，图2中左1为DL2000分子量标记物;泳道2-3为nrgA基因的PCR扩增产物），于1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测，在110V电压下电泳40min后 在凝胶成像系统(Gel Doc TM XR+型凝胶成像系统，Bi〇-rad，USA)紫外照射下成像拍照，检 查有无条带和非特异性扩增，电泳所用DNA Marker为DL2000(北京天根生化科技有限公 司）。目的条带回收纯化后由上海生工生物工程公司测序。
[0035] 实施例2:Cas9表达载体pET28a_cas9的构建
[0036] 根据nrgA基因 DNA序列，设计2条CRISPR/Cas9系统的gRNA，靶点序列见表1。将gRNA 连接到载体VK001-03,得到质粒VK001-03-G。然后，采用Notl和Spel双酶切，回收一段约为 6.6kb的长片段，与同样双酶切反应后的质粒pET-28a( + )产物连接，连接产物经电击转化入 大肠杆菌DH5a感受态细胞，采用PCR和酶切法鉴定出阳性转化子。提取转化子质粒pET28a-cas9(图3)，再电击转化K.radicincitans GXGL-4A菌株，筛选鉴定出目标转化子。
[0037] 表1固氮菌GXGL-4A基因组靶基因 gRNA靶点的设计
[0038]
[0039]实施例3:固氮菌转化子cas9基因的PCR检测
[0040]采用PCR法扩增cas9基因部分序列，筛选阳性转化子。PCR扩增引物为Cas9-SqF: 5 ' -ACAAGGACTTCCTGGACAATG-3 '、Cas9-SqR: 5 ' -CTCGGGCTTATGCCTTCCCAT-3 '。引物由上海 Sangon公司合成。PCR反应体系体积为25yL，包括2XTaq Master Mix 12.5yL、正向引物 Cas9-SqF( ΙΟμ mol/L) 1 · OyL、反向引物Cas9-SqR( ΙΟμ mol/L) 1 · 0yL、dd H20 9 · 5yL、转化子基 因组总DNA l.OyL。其中，2XTaq Master mix(北京康维试剂生物技术公司）产品组成为： 0.1U Taq polymerase/yL、500ymol/L dNTP each、20mmol/L Tris_HCl(pH 8.3)、100mmol/ L KCl、3mmol/L MgCl2、其它稳定剂与增强剂。
[0041 ] K.radicincitans GXGL-4A固氮菌转化子的cas9基因检测结果如图4所示，图4中， M: marker为DL2000 (TaKaRa);泳道 1 -4为突变株。
[0042]实施例4:突变株在LB(富氮)和Ashby(无氮)培养基中的固氮酶活性测定 [0043]本研究使用乙炔还原法(ARA)对固氮菌GXGL-4A进行检测，其原理是根据固氮酶使 乙炔还原为乙稀，最终以生成的乙稀量[nmol C2H4/(mL · h)]的多少来表示其固氮能力的大 小。
[0044] 将菌株接种于有橡胶塞封口的50mL三角瓶中，180r/min、28~30°C下培养24~ 48h。然后用10mL无菌注射器从每个瓶子中抽出2mL的气体，再分别注入2mL C2H2后，置于培 养箱中培养12~48h。从各培养瓶中分别取气样200yL，注入气相色谱仪中，检测C 2H4的生成 情况。观察气相色谱仪显示屏中C2H4峰值判断有无 C2H4的产生。以接种但未注入C2H2的培养 瓶作为对照1，以未接菌但注射C 2H2的培养瓶做对照2。以nmol C2H4/(mL · h)表示固氮酶活 性（N)。按下列公忒i+笪因氣_活性：
[0045]
[0046] 式中：hx---样品峰值；
[0047 ] hs---标准 C2H4 峰值；
[0048] C---标准〇2114浓度(nmol/mL);
[0049] V---试管体积(mL);
[0050] v---标准C2H4在测试时的体积(mL);
[0051] t 样品培养时间(h);
[0052] N---产生的C2H4浓度。
[0053] 经测定（图5、图6,图5、6中，4A:GXGL-4A(CK)，野生株；5-1、5-2、5-3、5-4、5-5、5-6、 5-7、5-8、5-9、5-10、5-11为铵载体突变株），从21个突变株中筛选出1株目标突变株85-1，其 在无氮环境中表现出了比野生株GXGL-4A更好的固氮酶活性，是一株可以在贫瘠土壤(缺 氮）中使用的突变株。
[0054]实施例5:铵载体突变株在Ashby固体培养基上的生长情况观察
[0055] 将IPTG诱导6h后的突变株菌液涂布于Ashby无氮培养基固体平板上，以Ashby无氮 培养基中添加硫酸铵作为对照，每个平板涂布200uL，于28°C恒温箱中培养，定期观察各菌 落生长情况。结果表明，与对照出发菌GXGL-4A相比，绝大多数铵载体突变株生长显著变缓， 个别的甚至不能生长，对碳源的利用能力降低，水解圈变小（图7)。
[0056]实施例6:铵载体突变株生长曲线测定
[0057]从_20°C分别取出保存的铵载体突变株于37°C、180r/min过夜活化，然后，以2%接 种量转接LB培养基，每小时测定1次其0D6QQ值，重复3次，绘制生长曲线图（图8)。
[0058]实施例7:铵载体突变株nrgA基因突变位点测序
[0059]为探明铵载体突变株靶基因序列突变情况，采用PCR法扩增nrgA基因 gRNA位点的 侧翼序列，分别在该位点的上下游各300bp左右处设计PCR引物，扩增一段长607bp的条带。 5 '-GCTGTACCGCGGTGCGGAATATAGCGTC-3 ' JCR扩增体系组成及扩增程序同实施例1中的nrgA 基因扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后送上海Sangon公司测序。，铵载体突变株 nrgA基因突变区与野生株GXGL-4A多序列比对如图9所示。
[0060]上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。 熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般 原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领 域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的 保护范围之内。
[0061]
【主权项】
1. 一种固氮菌铵载体基因 nrgA，其特征在于，能将固氮菌分泌到胞外的氨态氮运回胞 内，维持固氮菌氮库的平衡，具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列。2. -种固氮菌铵载体，其特征在于，含有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列编码的蛋白 质。3. -种固氮菌铵载体基因突变体，其特征在于，具有如SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经 多个位点的碱基取代突变后所得核苷酸序列，同时具有更好固氮活性功能。4. 一株包含如权利要求3所述的固氮菌铵载体基因突变体的突变株。5. -种如权利要求4所述的突变株的应用，其特征在于，在缺氮或无氮环境中，能利用 空气中的氮气进行微生物固氮，具有比野生株Kosakonia radicincitans GXGL-4A更高的 固氮生物活性。
【文档编号】C12N15/31GK106086042SQ201610498558
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】陈云鹏, 程杰杰, 孙帅欣, 李琼洁
【申请人】上海交通大学