一种益生型抗菌肽 Enterocin B 的制备方法及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种益生型抗菌肽Enterocin B基因工程菌的制备方法及其应用。本发明的一种益生型抗菌肽Enterocin B基因，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。益生型抗菌肽Enterocin B基因编码的成熟抗菌肽Enterocin B具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。本发明益生型抗菌肽Enterocin B的制备方法，包括如下步骤：(1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示的基因；(2)构建能高效表达的重组质粒；(3)构建基因工程菌；(4)利用基因工程菌表达抗菌肽Enterocin B。本发明对病原菌具有较强的抑菌活性，安全无毒，无副作用，无抗生素耐药性。
【专利说明】
一种益生型抗菌肽Enterocin B的制备方法及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种益生型抗菌肽Enterocin B的制备 方法及其应用。
【背景技术】
[0002] 近年来，抗生素在动物养殖业中的大量滥用，导致抗生素耐药性菌株不断出现、药 物残留、环境污染和生态破坏等诸多问题，严重威胁到人类健康和畜牧业的发展。因此，寻 找一种能替代抗生素的新型抗菌制剂迫在眉睫。抗菌肽具有抗菌效果好、热稳定性好、无 毒、无残留、无副作用、安全高效、对环境无污染且不易产生细菌耐药性等优点，有望成为解 决抗生素滥用这一难题的有效方法。
[0003] 抗菌肽是生物防御系统中产生的对抗外源性病原体的肽类物质，是生物天然的、 防御系统的重要组成部分。抗菌肽来源极其广泛，从植物、昆虫、鸟类、哺乳动物、微生物都 已被发现有抗菌肽的产生。迄今为止，已有近千种抗菌肽被相继分离纯化及鉴定。
[0004] 细菌产生的抗菌肽是在其代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活性 的多肽类物质。抗菌肽在益生菌中较为普遍。几乎所有的益生菌都能产生一种或几种抗菌 肽物质。近年来，国内外学者已从植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳 球菌等许多益生菌中分离纯化得到多种抗菌肽物质。
[0005] 抗菌肽Enterocin B是从屎肠球菌T136分离纯化获得的抗菌肽，命名为Enterocin B。抗菌肽Enterocin B的结构基因编码71个氨基酸的前肽。其前肽包括18个氨基酸的信号 肽和53个氨基酸的成熟肽。抗菌肽Enterocin B具有较广的抗菌谱，尤其对单核细胞增生李 斯特菌、金黄色葡萄球菌等病原菌有明显的抑制效果，具有较好的应用前景。
[0006] 抗菌肽Enterocin B在其产生菌屎肠球菌T136中含量极低，从产生菌中提取抗菌 肽产量低、费时长、工艺复杂且费用昂贵，无法实现大规模生产，从而制约抗菌肽Enterocin B的实际应用。
[0007] 目前，缺乏一种具有显著的抗病原菌作用的益生型抗菌肽Enterocin B的制备方 法及其应用。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是针对上述问题，提供一种具有显著的抗病原菌作用的益生型抗菌 肽Enterocin B的制备方法及其应用。
[0009] 为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种益生型抗菌肽 Enterocin B基因，具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
[0010]本发明所述的益生型抗菌肽Enterocin B基因编码的成熟抗菌肽Enterocin B具 有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0011]本发明所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制备方法，包括如下步骤：
[0012] (1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的基因；
[0013] (2)构建能高效表达抗菌肽Enterocin B的pNZ8148_Enterocin B重组质粒；
[0014] (3)用所述pNZ8148-Enterocin B重组质粒转化宿主菌，构建乳酸乳球菌NZ9000的 基因工程菌；
[0015] (4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表达抗菌肽Enterocin B;
[0016] (5)对抗菌肽Enterocin B的抑菌活性进行检测。
[0017] 进一步地，在步骤（1)中，人工合成两侧含pstl和Hindm的酶切位点Enterocin B 基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0018] 进一步地，在步骤(2)中，将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列与经限制性内切酶pst I和Hindm双酶切后线性化的pNZ8148质粒连接获得pNZ8148-Enterocin B连接产物，将连 接产物导入大肠杆菌MC1061，获得含pNZ8148-Enterocin B重组质粒。
[0019] 更进一步地，在步骤（3)中，所述宿主菌为乳酸乳球菌NZ9000;从含PNZ8148-Enterocin B重组质粒的大肠杆菌10061中提取重组质粒，经?0?和酶切鉴定正确的质粒采 用电转化转入乳酸乳球菌感受态细胞NZ9000进行抗菌肽Enterocin B的诱导表达，电转化 处理参数为2.01^、25以？、20(^、51^，经氯霉素抗性筛选、？0?验证、酶切鉴定得到正确的含 pNZ8148_Enterocin B重组质粒的乳酸乳球菌NZ9000的基因工程菌。
[0020] 进一步地，在步骤（4)中，将含pNZ8148_Enterocin B重组质粒的乳酸乳球菌 NZ9000的基因工程菌接种于GM17液体培养基，30°C培养至0D6mr?为0.5时，加入终浓度10ng/ ml的nisin诱导表达，培养4h后，4000g离心10min取上清液，将获得的上清液进行0.22μηι过 滤获得诱导后的无菌上清液，得到益生型抗菌肽Enterocin Β。
[0021] 进一步地，在步骤(5)中，采用琼脂扩散法对抗菌肽Enterocin B的抑菌活性进行 检测，抗菌肽Enterocin B对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌的抑菌活 性进行检测。
[0022] 本发明所述的益生型抗菌肽Enterocin B动物饲料中的应用。
[0023] 进一步地，所述动物饲料为饲料添加剂。
[0024] 有益效果:本发明对病原菌具有较强的抑菌活性，安全，无毒，无副作用，无抗生素 耐药性等优点，可用作动物饲料添加剂。本发明的所构建的基因工程菌不仅具有乳酸乳球 菌本身的益生作用，还具有抗菌肽Enterocin B明显的抗病原菌作用，可以更好的作为益生 型饲料添加剂安全有效地应用于动物饲料。
[0025] 与现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0026] (1)本发明的抗菌肽基因为益生菌肠球菌抗菌肽基因 Enterocin B，所编码的抗菌 肽Enterocin B是从益生菌肠球菌发酵上清液中分离得到的。本发明首先合成抗菌肽 Enterocin B的基因序列，并克隆到乳酸乳球菌表达载体中，构建得到重组表达载体;采用 电转化法导入乳酸乳球菌中进行抗菌肽Enterocin B的诱导表达，其对单核细胞增生李斯 特菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等病原菌均具有较强的抑菌活性。
[0027] (2)本发明的抗菌肽来自对动物有益生作用的肠球菌，这种抗菌肽基因为屎肠球 菌T136抗菌肽Enterocin B基因。预期用于动物饲料添加剂中对动物会有更好的作用和益 生效果，Enterocin B抗菌肽的成熟肽分子量大约为5.5KDa具有显著的抗病原菌作用。 [0028] (3)本发明所表达的抗菌肽Enterocin B来自于肠球菌，对动物体没有毒性，因此 用本发明的基因制备的抗菌肽与传统的抗生素药物相比，将是一种更为安全的抗病原菌的 短肽类物质。
[0029] (4)本发明以常用的益生菌乳酸乳球菌为宿主菌构建的基因工程菌，不仅具有乳 酸乳球菌本身的益生作用，还具有抗菌肽Enterocin B明显的抗病原菌作用，将Enterocin B基因导入益生菌乳酸乳球菌中获得基因工程菌并进行高效表达，将此基因工程菌作为发 酵菌株用于饲料发酵，可用作于动物饲料添加剂，提高饲料的营养价值和动物抗病能力。
【附图说明】
[0030] 图1是本发明的含目的基因大肠杆菌DH5a质粒双酶切电泳图；
[0031] 图2是本发明pNZ8148质粒经PstI和Hindm双酶切电泳图；
[0032]图3是本发明乳酸乳球菌重组菌PCR产物电泳图；
[0033] 图4是本发明含目的基因 Enterocin B乳酸乳球菌NZ9000重组质粒pNZ8148-Enterocin B提取电泳图；
[0034] 图5是本发明含目的基因 Enterocin B乳酸乳球菌重组质粒pNZ8148_Enterocin B 经PstI和Hindm双酶切电泳图；
[0035]图6是本发明重组基因工程菌对金黄色葡萄球菌的抑菌图，l-3:Nisin诱导表达后 重组基因工程菌上清液;对照:未诱导的重组基因工程菌上清液；
[0036] 图7是本发明重组基因工程菌对单核细胞增生李斯特菌的抑菌图，l-3:Nisin诱导 表达后重组基因工程菌上清液;对照:未诱导的重组基因工程菌上清液；
[0037] 图8是本发明重组基因工程菌对沙门氏菌的抑菌图，l_2:Nisin诱导表达后重组基 因工程菌上清液;对照:未诱导的重组基因工程菌上清液。
【具体实施方式】
[0038]以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释 和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。
[0039]本发明的一种益生型抗菌肽Enterocin B基因，具有SEQ ID No. 1所示的核苷酸序 列。
[0040] 本发明所述的益生型抗菌肽Enterocin B基因编码的成熟抗菌肽Enterocin B具 有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
[0041]本发明所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制备方法，包括如下步骤：
[0042] (1)人工合成核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的基因；人工合成两侧含pstl和Hind ΙΠ 的酶切位点Enterocin B基因具有SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。
[0043] (2)构建能高效表达抗菌肽Enterocin B的pNZ8148_Enterocin B重组质粒;将SEQ ID No.3所示的核苷酸序列与经限制性内切酶pstl和Hindm双酶切后线性化的pNZ8148质 粒连接获得pNZ8148-Enterocin B连接产物，将连接产物导入大肠杆菌MC1061，获得含 pNZ8148_Enterocin B重组质粒。
[0044] (3)用所述pNZ8148-Enterocin B重组质粒转化宿主菌，构建乳酸乳球菌NZ9000的 基因工程菌;所述宿主菌为乳酸乳球菌NZ9000;从含pNZ8148-Enterocin B重组质粒的大肠 杆菌MC1061中提取重组质粒，经PCR和酶切鉴定正确的质粒采用电转化转入乳酸乳球菌感 受态细胞NZ9000进行抗菌肽Enterocin B的诱导表达，电转化处理参数为2.0kV、25yF、200 Ω、5ms，经氯霉素抗性筛选、PCR验证、酶切鉴定得到正确的含pNZ8148-Enterocin B重组质 粒的乳酸乳球菌NZ9000的基因工程菌。
[0045] (4)利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表达抗菌肽Enterocin B;将含PNZ8148- Enterocin B重组质粒的乳酸乳球菌NZ9000的基因工程菌接种于GM17液体培养基，30°C培 养至0D6_m为0· 5时，加入终浓度10ng/ml的nisin诱导表达，培养4h后，4000g离心10min取上 清液，将获得的上清液进行〇.22μπι过滤获得诱导后的无菌上清液，得到益生型抗菌肽 Enterocin Β〇
[0046] ( 5 )对抗菌肽E n t e r o c i η B的抑菌活性进行检测。采用琼脂扩散法对抗菌肽 Enterocin B的抑菌活性进行检测，抗菌肽Enterocin B对金黄色葡萄球菌、单核细胞增生 李斯特菌或沙门氏菌的抑菌活性进行检测。
[0047]本发明所述的益生型抗菌肽Enterocin B动物饲料中的应用。
[0048]所述动物饲料为饲料添加剂。
[0049] 实施例1
[0050] 本发明所使用的主要材料
[0051 ] 菌株与载体：乳酸乳球菌NZ9000和PNZ8148质粒均购于德国Mo Bi Tec公司；DNA Marker购于上海捷瑞有限公司；单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌以及沙门氏菌均 为本实验室分离保存。抗菌肽Enterocin B基因由生工生物工程(上海)有限公司合成并转 入大肠杆菌DH5a;引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。
[0052]主要试剂与试剂盒:Ml 7肉汤培养基购自青岛海博公司；限制性内切酶Pst I和Hind ΙΠ 、Τ4 DNA连接酶、EX Taq购自TaKaRa Biotech公司；氯霉素、质粒提取和DNA凝胶回收试剂 盒购自天根生化科技(北京)有限公司;nisin购于Sigma公司。
[0053]主要试剂的配制：
[0054] GM17:M17肉汤培养基121°C高压灭菌15min，冷却后加入过滤除菌的葡萄糖至终浓 度为〇. 5 % (质量体积比）。
[0055] SGM17:M17肉汤加入终浓度为0.5M蔗糖、2.5%甘氨酸、0.5%葡萄糖117肉汤中加 入蔗糖和甘氨酸后121°C高压灭菌15min，冷却后加入0.22μπι过滤除菌的葡萄糖至终浓度为 0.5% (质量体积比）。
[0056] 0.5Μ蔗糖/10%甘油：17.115g蔗糖溶解于80ml超纯水中，加入10ml甘油后混匀定 容至100ml，0· 22μηι过滤除菌。
[0057] LB液体培养基：10g蛋白胨、5g酵母提取物、lg NaCl溶解于900ml蒸馏水中，调节pH 值至7.0后，定容至1L后121°C高压灭菌15min。
[0058] 主要仪器:高速冷冻离心机、移液器、PCR仪均购于德国Eppendorf公司；核酸电泳 槽、电泳仪、电转化仪购于Bio-Rad公司；凝胶成像仪购于上海天能有限公司；除菌过滤膜 (0·22μπι)购自What Man公司。
[0059] 目的基因获得：
[0060] 1.抗菌肽Enterocin B基因由生工生物工程(上海)有限公司合成，两侧加 PstI和 Hindm的酶切位点并导入大肠杆菌DH5a。按照质粒提取试剂盒提取由含目的基因的大肠杆 菌DH5a质粒。
[0061 ] 2.按照TaKaRa Biotech限制性内切酶PstI和Hindm双酶切，如图1所示，为本发明 步骤1中提取的质粒，酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳图，目的基因片段采用天根生化科技 (北京)有限公司DNA回收试剂和操作方法进行胶回收，-20°c保存备用。
[0062] 质粒pNZ8148线性化：
[0063] 如图2所示，为本发明采用TaKaRa Biotech限制性内切酶PstI和Hindm操作说明 书对PNZ8148质粒进行双酶切，线性化产物经1%琼脂糖凝胶电泳图，目的基因片段采用天 根生化科技(北京)有限公司DNA回收试剂和操作方法进行胶回收，-20°C保存备用。
[0064]回收的目的基因和线性化质粒连接
[0065] 按照TaKaRa Biotech的T4DNA连接酶试剂盒操作说明书对回收目的基因和质粒进 行连接。
[0066] 实施例2
[0067] 制备大肠杆菌MC1061感受态细胞
[0068]本实施例制备大肠杆菌MC1061感受态细胞，具体步骤如下：
[0069] 1、1 %接种MCI 061的LB液体培养基，于37 °C振荡过夜培养；
[0070] 2、取过夜培养菌液1 %接种于LB液体培养基，37°C下振荡培养4h(此时细菌处于对 数生长期），冰上放置lOmin;
[0071] 3、400(^，4°(：离心1〇1^11收集对数期细胞，弃上清，收集细菌细胞沉淀；
[0072] 4、用1/10于之前液体培养基体积的预冷的0.1M CaCl2菌体，冰上放置30min;
[0073] 5、4000g，4°C离心5min弃上清，收集细菌细胞沉淀；
[0074] 6、用1/100于之前液体培养基体积的含0.1M CaCl2溶液重悬菌体；
[0075] 7、吸取200yL分装于离心管，-8(TC保存。
[0076] 实施例3
[0077]连接产物转化大肠杆菌MC1061感受态细胞
[0078]本实施例为连接产物转化大肠杆菌MC1061感受态细胞，具体步骤如下：
[0079] (1)取100μΙ大肠杆菌MCI061感受态细胞与1.5ml离心管中，加入10μ1连接产物，轻 柔混勾后，冰浴30min;
[0080] (2)将1.5ml离心管放入预热至42Γ的水浴中90S;
[0081 ] (3)快速将1.5ml离心管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3min;
[0082] (4)每管加900μ1 LB培养液体基，37°C摇床温和震荡培养1.5h，使细菌复苏并充分 表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；
[0083] (5)吸取100μΙ复苏培养菌液分别涂布于含10yg/mL氯霉素的LB培养基平板上；
[0084] (6)将平板置于室温至液体吸收，倒置平板，37°C培养12-24h直至出现单菌落。
[0085] 实施例4
[0086] 大肠杆菌MC1061重组质粒菌落PCR及双酶切鉴定
[0087]本实施例为大肠杆菌MC1061重组质粒菌落PCR及双酶切鉴定。
[0088] 1.挑取上步骤获得的单菌落进行PCR鉴定
[0089] 用于PCR扩增的引物
[0090] 正向引物：AAAACTGCAGTTATGCAAAATGTAAAAGAATTAAGTAC
[0091] 反向引物：CCCAAGCTTTTAGTTGCATTTAGAGTATACATT [0092]扩增目的片段长度为237bp。
[0093] 2.以单菌落为DNA模板的PCR反应体系如下： 正向引物（10 μΜ) 1 μL, 反向引物（10 μΜ) 1 μL. dNTP Mixture 2 μL^
[0094] lOxPCR EiuITcr 2.5 μL TaqDNA 聚合酶（51；/μυ 0.2'uL ddHaO 补足至25pL
[0095] 扩增程序：94°(：，511^11，然后30个循环（94°(：，11^11;58°(：，503 ;72°(：，11^11);72°(：延 伸1 Omin。PCR产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳。
[0096] 3.重组质粒酶切鉴定：
[0097]挑取经PCR验证正确的单菌落于LB液体培养基于37 °C振荡培养好的菌液，按照天 根生化科技(北京)有限公司质粒提取试剂盒操作说明书提取质粒后进行1%琼脂糖凝胶电 泳，提取质粒采用TaKaRa Biotech限制性内切酶PstI和Hindm操作说明书双酶切质粒，产 物经1 %琼脂糖凝胶电泳。
[0098] 实施例5
[0099] 制备乳酸乳球菌NZ9000感受态细胞
[0100] 1、乳酸乳球菌1%接种于SGM17(GM17含0.5M蔗糖，2.5%甘氨酸），培养至006〇〇1?~ 0·5_0·8;
[0101] 2、5000g，4°C 离心 lOmin 收集菌体；
[0102] 3、用冰预冷的含10 %甘油的0.5M蔗糖的溶液洗涤菌体2次；
[0103] 4、用1/100与之前培养基体积的含10%甘油的0.5M蔗糖溶液重悬菌体，于-80 °C保 存。
[0104] 乳酸乳球菌电转化：
[0105] 取2yL重组质粒与40yL感受态细胞混合后，转入预冷的电转杯中，冰上放置lOmin。 电转化条件：电压2000V，电容25yF，电阻200Ω。电击完毕后，立即往电转杯中加入lmL GM17 培养基(含20mM MgCl2,2mM CaCl2)，30°C静置培养2h，涂布于含5μg/ml氯霉素的GM17平板 上，30 °C培养直至出现单菌落。
[0106] 实施例6
[0107] 正向引物：AAAACTGCAGTTATGCAAAATGTAAAAGAATTAAGTAC
[0108] 反向引物：CCCAAGCTTTTAGTTGCATTTAGAGTATACATT
[0109] 扩增目的片段长度为237bp。
[0110] 2.以单菌落为DNA模板的PCR反应体系如下： 正向引物（10 μΜ) l pL 反向引物（10 μΜ) 1 μL ciNTP Mixture 2 pL
[0111] lOxPCR Buffer 2 5 μΕ Taq DNA 聚合酶（5 U/pL ) 0.2 μL dclH：0 补足至 25pL
[0112] 扩增程序：94°C，5min，然后 30 个循环（94°C，lmin;58°C，50S;72°C，lmin);72°C 延 伸lOmin。如图3所示，为本发明的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
[0113] 挑取经PCR验证正确的单菌落于GM17液体培养基于30°C振荡培养好的菌液，如图4 所示，为本发明按照天根生化科技(北京)有限公司的质粒提取试剂盒操作说明书提取质粒 后进行1%琼脂糖凝胶电泳，如图5所示，为本发明的提取质粒采用TaKaRa Biotech限制性 内切酶PstI和Hindm操作说明书双酶切质粒，产物经1%琼脂糖凝胶电泳图。
[0114] 实施例7
[0115] 乳酸乳球菌NZ9000重组菌的诱导表达
[0116] 重组菌4%接种于含5μg/ml氯霉素的GM17液体培养基待生长至0D6Mr?约为0.5时加 入终浓度为l〇ng/ml nisin诱导培养4h获得培养菌液，4000g离心10min取上清液，将获得的 上清液进行〇.22μπι过滤获得诱导后的无菌上清液，用于下一步的抑菌实验。
[0117] 实施例8
[0118] 重组抗菌肽抑菌实验
[0119] 1、重组抗菌肽抑菌实验
[0120] 本实验采用琼脂扩散法对重组表达的抗菌肽Enterocin Β的抑菌活性进行检测。 将处于对数生长期的金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌培养物各取l〇〇yL 涂布于20ml LB固体培养基平板中，再用8mm的打孔器打孔，加入200yL的待测样品上清液， 以未经nisin诱导的含有抗菌肽Enterocin B基因的乳酸乳球菌上清为对照，37°C培养观 察。
[0121] 2、抑菌实验结果
[0122] 采用琼脂扩散法对重组抗菌肽的抑菌活性进行检测，经37°C培养后，结果如图6所 示，为本发明重组基因工程菌对金黄色葡萄球菌的抑菌图，l-3:Nisin诱导表达后重组基因 工程菌上清液;对照:未诱导的重组基因工程菌上清液;如图7所示，为本发明重组基因工程 菌对单核细胞增生李斯特菌的抑菌图，l-3:Nisin诱导表达后重组基因工程菌上清液;对 照:未诱导的重组基因工程菌上清液;如图8所示，为本发明重组基因工程菌对沙门氏菌的 抑菌图，l-2:Nisin诱导表达后重组基因工程菌上清液;对照：未诱导的重组基因工程菌上 清液。
[0123] 如图6至图8所示，本发明的重组抗菌肽Enterocin B的基因工程菌对沙门氏菌、金 黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌的抑菌效果明显。
[0124] 根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方 法进行适当的变更和修改。因此本发明并不局限于上面揭示和描述的【具体实施方式】，对本 发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书 使用了一些特定的术语，但是这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
【主权项】
1. 一种益生型抗菌肽Enterocin B基因，其特征在于具有SEQ ID No.l所示的核苷酸序 列。2. 权利要求1所述的益生型抗菌肽Enterocin B基因编码的成熟抗菌肽Enterocin B具 有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。3. 权利要求1所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制备方法，其特征在于包括如下步 骤： (1) 人工合成核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的基因； (2) 构建能高效表达抗菌肽Enterocin B的pNZ8148_Enterocin B重组质粒； (3) 用所述pNZ8148-Enterocin B重组质粒转化宿主菌，构建乳酸乳球菌NZ900的基因 工程菌； (4) 利用所述基因工程菌乳酸乳球菌表达抗菌肽Enterocin B; (5) 对抗菌肽Enterocin B的抑菌活性进行检测。4. 根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制备方法，其特征在于:在步骤 (1) 中，人工合成两侧含pst I和HindlH的酶切位点Enterocin B基因具有SEQ ID Νο·3所示 的核苷酸序列。5. 根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin Β的制备方法，其特征在于:在步骤 (2) 中，将SEQIDN0.3所示的核苷酸序列与经限制性内切酶pStI和HindIΠ 双酶切后线性 化的PNZ8148质粒连接获得pNZ8148-Enterocin B连接产物，将连接产物导入大肠杆菌 MC1061，获得含pNZ8148-Enterocin B重组质粒。6. 根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制备方法，其特征在于:在步骤 (3) 中，所述宿主菌为乳酸乳球菌NZ9000;从含pNZ8148-Enterocin B重组质粒的大肠杆菌 MC1061中提取重组质粒，经PCR和酶切鉴定正确的质粒采用电转化转入乳酸乳球菌感受态 细胞NZ9000进行抗菌肽EnterocinB的诱导表达，电转化处理参数为2.0kV、25μF、200Ω、 51118，经氯霉素抗性筛选、？0?验证、酶切鉴定得到正确的含卩似8148411丨61'〇〇;[1113重组质粒 的乳酸乳球菌NZ9000的基因工程菌。7. 根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制备方法，其特征在于:在步骤 (4) 中，将含pNZ8148-Enterocin B重组质粒的乳酸乳球菌NZ9000的基因工程菌接种于GM17 液体培养基，30°C培养至OD6_ mS〇. 5时，加入终浓度10ng/ml的nisin诱导表达，培养4h后， 4000g离心10min取上清液，将获得的上清液进行0.22μπι过滤获得诱导后的无菌上清液，得 到益生型抗菌肽Enterocin Β。8. 根据权利要求3所述的益生型抗菌肽Enterocin B的制备方法，其特征在于:在步骤 (5) 中，采用琼脂扩散法对抗菌肽Enterocin B的抑菌活性进行检测，抗菌肽Enterocin B对 金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌的抑菌活性进行检测。9. 权利要求2-8任一项所述的益生型抗菌肽Enterocin B动物饲料中的应用。10. 根据权利要求9的应用，所述动物饲料为饲料添加剂。
【文档编号】C12N15/74GK106086041SQ201610490117
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】杨旭, 方华, 季春源, 沈城, 郭子好
【申请人】江苏盐城源耀生物科技有限公司