水稻苗期叶片白化性状基因Oscaac1及其应用

水稻苗期叶片白化性状基因Oscaac1及其应用
【专利摘要】本发明公开了水稻苗期叶片白化性状基因Oscaac1及其应用，属于水稻育种领域。本发明从一个苗期第一、第二片叶白化性状突变体中图位克隆了突变基因Oscaac1，其基因组序列如SEQ ID NO.4所示；其野生型基因编码一个叶绿体被膜ATP/ADP转运蛋白。将Oscaac1基因导入到水稻保持系、不育系中，培育具有苗期白化叶片性状的三系和/或两系不育系；当制种获得的杂交F1代进行幼苗期鉴定时，出现白化叶片的植株为不育系自交的假杂种。本发明公开的Oscaac1基因在水稻育种的杂交F1代杂种纯度鉴定和不育系自交繁殖保种纯度鉴定工作中具有应用前景，对提高种子纯度、减少杂交水稻生产风险具有重要的意义。
【专利说明】
水稻苗期叶片白化性状基因 Oscaacl及其应用
技术领域
[0001]本发明属于水稻育种领域，具体涉及水稻苗期叶片白化性状基因 Oscaacl及其应 用。
【背景技术】
[0002] 高等植物叶绿体基因组一般编码大约100个蛋白质，而叶绿体中含有的蛋白质至 少超过2000个。因此，绝大多数的叶绿体蛋白是由核基因编码的，在细胞质中翻译后运输到 叶绿体中(Abdallah et al. ,2000)。质体基因的转录是由两类RNA聚合酶来完成的，即质体 编码的RNA聚合酶(PEP)和核基因编码的RNA聚合酶(NEP)(Maliga，1988 ;Hajdukiewiczet al.，1997;Hedtke et al. ,1997)。这两种RNA聚合酶各自负责不同类别的叶绿体基因的转 录(Allison et al.，1996;Hajdukiewicz et al.，1997)，如与光合作用密切相关的基因是 由PEP转录，而持家基因则由NEP转录。但是，少数叶绿体基因如atpB可以被PEP和NEP同时转 录。核基因和质体基因的协同表达是叶绿体发育所必需的。
[0003] 叶色复绿(Virescent)突变体是指叶片发育早期叶绿素含量降低，到成熟时期叶 片叶绿素含量几乎恢复正常的一类突变体(Archer and Bonnett, 1987)。与其它叶色突变 体不同，这类突变是非致死的，纯合突变体个体能够存活和结实，是研究叶绿体发育的良好 材料。目前只有少数的水稻virescent突变体的基因被鉴定，它们的功能尚未完全阐明。
[0004] 水稻在我国粮食生产中占有极其重要的地位。据联合国粮农组织统计，近四十年 来，我国水稻历年播种面积均为4.7亿亩，最高为5.4亿亩，占粮食作物播种面积的2.15% ; 稻谷产量平均为10419.7万吨，最高为17825万吨占粮食产量的43.7%。水稻生产关系到国 计民生，在粮食生产中举足轻重。
[0005] 目前，我国杂交水稻面积占水稻生产面积的50%左右，其技术体系以三系法和两 系法并存，仍以三系法杂交水稻为主。伴随杂交水稻的大面积推广，在生产实践中，杂交稻 仍面临亲本繁殖和制种两大环节中纯度保持技术上的困难，这是限制一些强优组合生产应 用的主要障碍。杂交稻科种子真伪不易辨认，种子纯度鉴定困难等造成的真假杂种不易识 另IJ、杂种纯度不易保证的问题十分突出，给农民造成重大损失的事件时有发生。为此，广大 育种工作者在培育优质高产杂交稻的同时，也在谋求解决杂交稻种子和亲本的纯度鉴定和 真假种子识别的办法。随着生物科学技术的不断发展，同工酶法、DNA指纹技术在真假杂种 识别上已获成功，但这些分子生物学手段技术含量高，需要精密仪器设备，投入大，花费昂 贵，一般种子生产和销售单位难以掌握和应用于实际。因此，需要一种简便可靠的办法来解 决杂交稻亲繁和制种的纯度检测问题。
[0006] 水稻形态标记性状在真假杂种识别上具有直观、可靠、简便易行等优点，已为一些 育种工作者所采用。水稻形态标记性状有多种，主要性状如穗色、穗形、着粒密度、籽粒颜 色、芒的有无等;细微性状如种子的大小、形状(长宽比）、程尖色、浮毛长短、柱头外露遗迹 等;特有性状如红色或紫红色的颖壳和米粒以及香味等;易变性状如株高、穗长、分蘖力、开 花抽穗期、生育期、叶片长短、叶色深浅等。水稻叶色标记性状属于特有性状，常见的有紫 叶、红叶、淡绿叶、黄叶、斑马叶、白化转绿叶等。
[0007]在叶色标记性状用于杂交水稻育种研究上，中国水稻研究所董凤高等（1994)通过 连续回交将隐性的淡绿叶形态标记导入光、温敏不育系，以期解决由于籼型光、温敏核不育 系育性不稳而导致的杂交水稻制种纯度难以保证的问题。曹立勇等（1999)将隐性紫叶形态 标记性状回交转入温敏不育系育成中紫S。浙江大学核农所应用核辐射技术培育出带叶色 标记杂交水稻不育系全龙A等。叶荣国（1999)筛选出了周缘白化，黄白叶片的不育系。牟同 敏等（1995)选育出了紫叶标记光温敏互作不育系，并对紫叶性状的遗传特性进行了分析。 南京红太阳种业有限公司和安徽肥东良种繁育总场成功应用辐射及化学诱变技术，选育出 幼苗叶片带隐性白化标记的水稻两系、三系不育系及其具有推广价值的新品种（系），其中 新组合"红优Γ是使用白化标记不育系庐86A与恢复系166配组而成，已在生产上示范推广。 [0008] 参考文献：
[0009] Abdallah F,Salamini F,Leister D(2000)A prediction of the size and evolutionary origin of the proteome of chloroplasts of Arabidopsis.Trends Plant Sci.5:141-142.
[0010] Allison LA,Simon LD,Maliga P(1996)Deletion of rpoB reveals a second distinct transcription system in plastids of higher plants .ΕΜΒ0 J.15:2802-2809.
[0011] Archer EK,Bonnett HT(1987)Characterization of a virescent chloroplast mutant of tobacco.Plant Physiol.83:920-925.
[0012] Hajdukiewicz PT,Allison LA,Maliga P(1997)The two RNA polymerases encoded by the nuclear and the plastid compartments transcribe distinct groups of genes in tobacco plastids.ΕΜΒ0 J.16:4041-4048.
[0013] Hedtke B, BornerT,ffeihe A(1997)Mitochondrial and chloroplast phage-type RNA polymerases in Arabidopsis.Science.277:809-811.
[0014] Maliga P,Svab Z,Harper EC,Jones JD(1988) Improved expression of streptomycin resistance in plants due to a deletion in the streptomycin phosphotransferase coding sequence.Mol Gen Genet.214:456-459.
[0015] 毛昌祥.我国杂交水稻的形势与战略.杂交水稻，1994，（ 1): 23-28。
[0016] 王忠安.两系杂交水稻亲本间多态性的SSR分析.杂交水稻，2004，，19(2): 59-61。 [0017]方宜钧，吴为人，唐纪良.作物标记DNA辅助育种.北京:科学出版社，2001。
[0018]叶荣国.带叶色标记性状三不育系的选育.浙江农业科学，1996(6): 236-241。
[0019]李玉湘.玉米叶绿体突变系叶绿素蛋白复合体的研究.遗传学报，1982，9 : 221-227。
[0020]李晓辉，李新海.SRS标记在玉米杂交种种子春都测定中的应用，作物学报，2003， 1,63-68〇
[0021 ] 刘建丰.水稻超高产育种研究概况及问题探讨.杂交水稻，2000，15:19-24。
[0022]牟同敏，李春海，杨国才，卢兴桂.紫叶水稻苗期叶色遗传研究.中国水稻科学， 1995,9:45-48。
[0023]朱立宏.作物育种学.北京:农业出版社，1981。
[0024] 肖层林.两系杂交水稻种子的纯度影响因素与保纯技术.杂交水稻，2000，1: 545-50 〇
[0025] 沈圣泉，舒庆尧.实用转绿型叶色标记不育系白丰A的应用研究.中国水稻科学， 2004,18:34-38。
[0026] 陈忠明，王秀娥.两优培九种子纯度的RAH)快速鉴定.杂交水稻，2003，18:55-56。
[0027] 陈温福，徐正进.水稻超高产育种研究进展与前景.沈阳农业大学学报，1998，29 (2)：101-105〇
[0028]吴爱忠.上农特种稻植株色泽遗传的初步研究.上海农学学报，1994,12(2):104-106〇
[0029]吴殿星.植物叶绿素突变体的研究及应用探讨.中国农学通报，1995。
[0030]吴殿星.转绿型白化突变系w25转绿过程中幼苗叶片内碳水化合物和氨基酸组分 的变化.植物生理学报，1997，23:299-305。
[0031]吴跃进.水稻温敏型叶绿素突变体遗传及超微结构研究.安徽农学院报，1991，18: 189-202。
[0032]吴殿星.水稻转绿型白化突变系w25的叶绿体超微结构研究.浙江农业大学学报， 1997,23(4):45卜452〇
[0033] 郑康乐，黄宁.标记辅助选择在水稻改良中的应用前景.遗传，1997，19(2):40-44。

【发明内容】

[0034]本发明的目的在于提供一种控制水稻苗期叶片白化性状的新基因 Oscaacl及其应 用。
[0035] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0036] 一种水稻苗期叶片白化性状基因 Oscaacl，为ATP/ADP carrier基因（文中将该基 因命名为OsCAACl基因）的突变基因。所述的ATP/ADP carrier基因编码的蛋白质的氨基酸 序列如SEQ ID N0.3所示，该蛋白质属于线粒体转运蛋白质家族;ATP/ADP carrier基因的 基因组序列如SEQIDN0.1所示，编码核苷酸（cDNA)序列如SEQIDN0.2所示。所述的突变 基因指在ATP/ADP carrier基因的编码核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核 苷酸而生成的等位基因。
[0037]优选的，所述的水稻苗期叶片白化性状基因 Oscaacl的基因组序列如SEQ ID N0.4 所示。
[0038]本发明的水稻苗期叶片白化性状基因 Oscaacl是从一个水稻苗期白叶突变体 caacl mutant中发现的，突变体caacl mutant的表型为苗期第一叶和第二叶白化，且为隐 性突变。本发明利用图位克隆的方法将Oscaacl基因初步定位在第6号染色体长臂介于 RM6298和RM7434两个标记之间，进一步设计SSR标记将其精确定位在80kb的区段。对该区段 内的基因进行测序，初步将一个ATP/ADP carrier基因定位为OsCAACl的候选基因。构建能 表达该候选基因的互补载体，通过农杆菌将互补载体转入突变体caacl mutant后，其幼苗 第一叶和第二叶均表现为正常的绿色，由此确认了突变体caacl mutant第一叶和第二叶白 化现象是由OsCAACl基因的缺失造成的。这些结果表明Oscaacl基因能控制水稻叶片叶绿体 早期发育。
[0039] 因此，基于Oscaacl基因产物调控水稻叶绿体发育，从而产生苗期叶片白化的标记 性状，其具有在杂交水稻F1代杂种纯度鉴定和/或不育系自交种子纯度鉴定方面的应用。
[0040] 本发明还同时提供了一种杂交育种去除假杂种的方法，该方法包括如下步骤:将 Oscaacl突变体植株与水稻保持系、不育系材料杂交、回交，进而将Oscaacl基因导入到水稻 保持系、不育系中，培育具有苗期白化叶片性状的三系和/或两系不育系；当制种获得的杂 交?:代进行幼苗期鉴定时，出现叶片表型为白化叶片的植株为不育系自交的假杂种，应作 去除处理，从而实现去除假杂种的目的。
[0041] 备注说明：因为突变体的表型为第一叶和第二叶白化，且为隐性突变，所以杂合子 和野生型一样，为正常表型。将突变体基因导入水稻保持系和不育系，因为是突变体，外在 表型是第一叶和第二叶白化。而杂交稻为杂合子，表型正常。
[0042]本发明的杂交育种去除假杂种的方法适应于三系、两系法杂交育种的所有水稻品 种。
[0043]本发明的有益效果是：本发明提供的控制水稻苗期叶片白化性状的新基因 Oscaacl在水稻育种的杂交F1代杂种纯度鉴定和不育系自交繁殖保种纯度鉴定工作中具有 应用前景，其对提高种子纯度、减少杂交水稻生产风险具有重要的意义。
【附图说明】
[0044]图1是水稻苗期白叶突变体caacl mutant与幼苗在二叶期与三叶期的植株叶色表 型图。突变体caacl mutant和9311幼苗在二叶期与三叶期的植株叶色比较：突变体caacl mutant在二叶期的叶片表现出白化特征，而9311的叶片为正常的绿色；在三叶期，突变体 caacl mutant的第三片叶子恢复正常，和9311的第三片叶一样为绿色。
[0045]图2是OsCAACl基因在水稻第6染色体上的定位示意图。利用突变体caacl mutant 和RPY粳杂交后代的?2群体中的突变重组植株，根据数据库中的SSR标记，将OsCAACl基因初 步定位在第6号染色体上RM6298和RM7424这两个标记的区间内。在此区间内自行开发出P1、 P2、P3、P4和P5这几个新的SSR标记，进行精细定位，将OsCAACl基因定位在一段80kb范围的 区间内，该区间内有13个基因，分别测序验证后发现，第五个基因发生了碱基缺失造成移码 突变，因此作为OsCAACl基因的候选基因。
[0046]图3是pBWA(V)H-〇sCAACl载体图谱。该载体为转基因互补材料的转化载体，将正常 的OsCAACl基因序列导入突变体caacl mutant中。
[0047]图4是功能互补实验1^代转基因水稻的表型图；caacl为突变体，1-3为转入互补载 体pBWAW^-OsCAACU^Ti代植株。从互补1\代阳性材料中随机选取三个株系，其幼苗第一叶 和第二叶均表现为正常的绿色，由此可以确认白叶现象是由OsCAACl基因的缺失造成的。
【具体实施方式】
[0048]下面结合实施例对本发明做进一步的描述，应理解，这些实施实例仅仅是说明性 的、而不用于限制本发明的范围。
[0049] 实施例1 Oscaacl基因的定位 [0050] 1、材料与方法
[00511 水稻苗期白叶突变体caacl mutant(该突变体又命名为水稻斑点突变体caacl，保 存于湖北省农业科学院粮食作物研究所的湖北省农作物种质资源中期库（保存号 HB216002,日期2016年5月20日）来自于珍汕97/成恢178杂交后代，其表型如图1所示。与 9311相比，突变体caacl mutant幼苗在二叶期的叶片表现出白化特征，而9311的叶片为正 常的绿色;在三叶期，突变体caacl mutant的第三片叶子恢复为正常，和9311的三叶一样为 绿色。
[0052]培养方法及条件:水稻种子经盐水选种后，放置于培养皿中，37°C黑暗条件下浸种 2天至露白，然后将种子均匀的铺在培养盆的泥土上，在光温可控水稻培养箱中生长至二叶 期。培养箱的具体条件为:温度控制：白天28°C，夜晚24°C ;光照时间：7 :00-20:00 ;光照强 度：100μηιο1 · m-2 · s-、
[0053] 2、遗传分析和定位群体
[0054] caacl mutant突变体作为母本和RPY粳、MP3、培矮64S、CPSL017分别作为父本杂 交，Fi自交，F2水稻按上述条件培养，二叶期时统计正常绿叶幼苗和白叶突变体幼苗的数目， 并用统计学方法计算分离比例。实验结果如表1所示，这些杂交组合^植株具有正常的叶色 表型，F 2植株中的正常绿苗和白化突变体的分离比符合孟德尔单基因隐性突变的分离比， 说明Oscaacl为单隐性基因。
[0055] 表1.不同杂交组合F2植株幼苗表型株数
[0056]
[0057] F2定位群体是由caac 1 mutant突变体(籼稻）和粳稻品种(RPY粳）杂交获得，总共 鉴定出1430个叶色突变表型的F2个体，单株取叶片，用来提取基因组DNA。
[0058] 3、通过SSR(Simple Sequence Repeat，简单重复序列）标记定位Oscaacl基因
[0059] 采用CTAB法提取水稻叶片的基因组DNA。取大约0.2g水稻幼嫩叶片，经组织研磨机 破碎，提取总DNA，获得的DNA溶解于50yL无菌水中。每个SSR反应用lyL DNA样品。
[0000]在Oscaac 1基因的初步定位试验中，对44个F2个体进行SSR分析。根据公布的粳稻 和籼稻创建的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各条染色体上的SSR引物（SSR标记包括 RM583、RM5497、RM4355、RM13678、RM14795、RM5488、RM16589、RM1359、RM17954、RM18926、 RM4332、RM494、RM21161、RM1306、RM22761、RM23409、RM23759、RM5786、RM25181、RM25754、 1?17283、冊26937、冊101、冊28466)，根据已知的反应条件进行？0財广增，然后在3%的琼脂糖 凝胶电泳分离，检测PCR产物的多态性，进而进行初步定位分析。定位结果表明，Oscaac 1基 因初步定位在第6号染色体长臂介于RM6298和RM7434两个标记之间。
[0061 ]精细定位Oscaacl基因时，对由1430fF2突变个体组成的群体进行SSR分析。根据 分子标记RM6298和RM7434之间的粳稻和籼稻序列的差异，设计了5个新的SSR标记(P1-5)， 引物序列见表2。利用这些分子标记，将Oscaacl基因精确定位于P1和P5之间80kb的区段（图 2) 〇
[0062] 表2.0scaacl精细定位及互补载体构建引物序列信息
[0063]
[0064] 5、基因预测和比较分析
[0065] 根据精细定位的结果，Oscaacl基因位于第6号染色体的P1和P5标记之间80kb范围 之内。对该区段内的13个基因测序发现，一个ATP/ADP carrier基因的第一个外显子发生了 4个碱基的缺失（图2)，因此将该基因定位为Oscaacl的候选基因。
[0066] OsCAACl基因的基因组核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所不，编码的蛋白质的氣基酸序列SEQ ID NO.3所不。有4个喊基缺失的Oscaacl基因的 基因组序列如SEQ ID N0.4所示。
[0067] 实施例20scaacl基因功能互补实验
[0068] 构建了以OsCAACl基因自身的启动子、基因片段及终止子全长5759bp的互补载体， 艮p pBWA(V)H-0sCAAC 1 (图3)。利用高保真酶以水稻品种9311的基因组DNA为模板扩增 OsCAACl基因自身的启动子、基因片段及终止子全长5759bp的片段（所用引物见表2)，用 Bsal酶切该片段和pBWA(V)H载体(武汉伯远生物科技有限公司提供），然后用T4连接酶链接 酶切片段和pBWA(V)H载体骨架，得到转基因载体pBWA(V)H-〇sCAACl。将pBWA(V)H-〇sCAACl 转入大肠杆菌中扩增，并提取其载体质粒pBWA(V)H-〇sCAACl。
[0069] 用互补载体pBWA(V)H-〇sCAACl转化到农杆菌EHA105中，转化水稻caacl mutant突 变体，转化方法为农杆菌介导法。从互补!^代阳性材料中随机选取三个株系，按实施例1中 的条件进行培养，其幼苗第一叶和第二叶均表现为正常的绿色（图4)，即互补载体能够完全 恢复突变体caacl mutant的突变表型，由此可以确认白叶现象是由OsCAACl基因的缺失造 成的。
[0070] 以上所述仅为本发明的若干个【具体实施方式】，应当指出，对于本领域的普通技术 人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范 围。
【主权项】
1. 一种水稻苗期叶片白化性状基因 fccaad，其特征在于：为基因组序列如SEQ ID NO. 1所示的基因的突变基因。2. 根据权利要求1所述的水稻苗期叶片白化性状基因 Oscaad，其特征在于：其基因组 序列如SEQ ID NO.4所示。3. 权利要求1或2所述的水稻苗期叶片白化性状基因 Oscaad在杂交水稻Fi代杂种纯度 鉴定和/或不育系自交种子纯度鉴定中的应用。4. 一种杂交育种去除假杂种的方法，其特征在于:包括如下步骤:将包含权利要求1或2 所述的水稻苗期叶片白化性状基因 fccaad的突变体植株与水稻保持系、不育系材料杂交、 回交，进而将fccaad基因导入到水稻保持系、不育系中，培育具有苗期白化叶片性状的三 系和/或两系不育系；当制种获得的杂交Fi代进行幼苗期鉴定时，出现叶片表型为白化叶片 的植株为不育系自交的假杂种，作去除处理。
【文档编号】C12Q1/68GK106086036SQ201610554461
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】胡道恒, 李阳生, 阳菁
【申请人】武汉大学