一种类芽孢杆菌β?1,3?1,4?葡聚糖酶及其编码基因与应用

一种类芽孢杆菌β?1,3?1,4?葡聚糖酶及其编码基因与应用
【专利摘要】本发明涉及一种类芽孢杆菌β?1,3?1,4?葡聚糖酶及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质具有β?1,3?1,4?葡聚糖酶活性，比酶活力431.8U·mg?1，最适反应pH为6.0，在pH 3.5—9保持稳定；最适反应温度为55℃，在55℃以下保持较高酶活力，具有较好的耐热性；底物专一性较强，具有良好的β?1,3?1,4?葡聚糖酶酶学性质；在食品、饲料行业中具有良好的应用价值。该蛋白质在麦芽糖化过程中可以显著降低粘度、缩短过滤时间；在燕麦麸皮β?葡聚糖水解过程中可以显著提高β?葡寡糖得率,对外源酶失活的燕麦麸皮水解时，可以获得相对含量较高的葡三糖和葡四糖；作为β?1,3葡聚糖酶还可以用于制备可得然寡糖。
【专利说明】
一种类芽孢杆菌β-1 ,3-1 ,4-葡聚糖酶及其编码基因与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体说是一种类芽孢杆菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶及其编 码基因与应用。
【背景技术】
[0002] β-葡聚糖酶是一类能够降解谷物中β-葡聚糖的酶类，包括β-1，3-1，4-葡聚糖酶 (地衣多糖酶，EC 3.2.1.73)、β-1，4-葡聚糖酶(纤维素酶，EC 3.2.1.4)、β-1，3-葡聚糖酶 (昆布多糖酶，EC 3.2.1.39)和 β-l, 3(4)-葡聚糖酶（EC 3.2.1.6)(McCarthy，et al·， International Journal of Biological Macromolecules，2003，33:141-148) 〇其中，β_1， 3- 1，4-葡聚糖酶具有严格的底物特异性，其水解β-葡聚糖的3-0-取代葡萄糖残基上的β-1， 4- 糖苷键，生成主要包含3-0-β-纤维二糖基-D-葡萄糖和3-0-β-纤维三糖基-D-葡萄糖的水 解产物（Yang,et al. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56:5345-5351)〇
[0003] 0-1，3-1，4-葡聚糖酶广泛应用于啤酒生产和饲料工业中。在啤酒生产中，0_1，3-1，4-葡聚糖酶能够专一分解大麦β-葡聚糖，使大麦胚乳细胞壁疏松，促进细胞内容物外溢， 进而提高大麦的利用率，同时使糖化醪粘度降低，大大减少麦芽汁的过滤时间，使啤酒产量 增加，改善了啤酒的混池度，提高啤酒的质量(Furtado，et al ·，Process Biochemistry， 2011,46(5): 1202-1206.)。在饲料工业中，β-l，3-l，4-葡聚糖酶能特异性地将β-1，3-l，4-葡聚糖水解为低分子糖，使植物细胞壁的构造遭到破坏，进而释放出营养物质。由于不具有 亲水性和黏性，降解后的葡聚糖在畜禽肠道中不会发生膨胀黏连，因此使食糜的消化率 和饲料的能量利用率均有所提高（Smits，et al.，Worlds Poultry Science Journal 1996,52(2) :203-221 )。另外，β-葡聚糖水解物可以提高肠道益生菌的生长(Jaskari，et al.Applied Microbiology and Biotechnology, 1998,49(2):175_181)，还可以减缓衰老， 改善营养物吸收速率并提供抗高胆固醇作用(Bode，2009，67( 11): S183-S191)。
[0004] 由于β-l，3-1，4-葡聚糖酶具有重要的工业应用价值，国内外研究者对其进行了大 量研究。目前，已从多种微生物中分离并鉴定了 β-1，3-1，4-葡聚糖酶，其中大多数来源于细 菌，包括芽孢杆菌（Bacillus species)，如枯草芽孢杆菌（Β · subtil is) (Tang，et al ·， Bioresource Technology ,2004 ,93(2) : 175-181)、解淀粉芽抱杆菌 (Β · amyloliquefaciens) (Hofemeister，et al ·，Gene，1986,49:177-187)、地衣芽抱杆菌 (B.licheniformis)(Chaari,et al.,Process Biochemistry,2012,47(3):509-516)等；或 其它细菌，如热纤梭菌（Clostridium thermocellum)(Ribeiro，et al·,British Poultry Science ,2012,53(2) :224-234)等。在一些真菌中也分离和鉴定了β-1,3-1,4-葡聚糖酶，如 嗜热拟青霉（Paecilomyces thermophila) (Yang,et al. , Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008,56( 13): 5345-5351)、米黑根毛霉（Rhizomucor miehei) (Tang，et al.，Journal of Agricultural and Food Chemistry,2012,60(9):2354-2361)等。
[0005] 为了提高β-1，3-1，4-葡聚糖酶的产量和热稳定性，在不同的宿主和载体中表达了 细菌或真菌β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因。例如，在大肠杆菌中表达了来自枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)(Qiao,et al.,Applied Biochemistry and Biotechnology,2009,152(2): 334-342)、解淀粉芽抱杆菌（B.amyloliquefaciens)(Sun, et al·, Annals of Microbiology ,2012,62(3): 1235-1242)、多粘类芽抱杆菌（Paenibacci llus polymyxa) (Wen，et al.，Scientia Agricultura Sinica,2010,43(22):4614-4623)的β_1,3-1,4-葡 聚糖酶基因；在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达了来自枯草芽孢杆菌(B. subtilis) (Qiao，et al.，Biologia, 2010,65(2):191-196)、产琥泊酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes)(Huang,et al.,Applied Microbiology and Biotechnology,2008,78(1): 95-103)和嗜热拟青霉（Paecilomyces thermophila)(Hua,et al·,Applied Microbiology and Biotechnology ,2010,88(2) :509-518)的β_1,3-1,4-葡聚糖酶基因。一些专利公开了 β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因及其表达。例如，在CN 104561060 Α中公开了来自枯草芽孢杆菌 (B.subtilis)的β-1，3-1，4-葡聚糖酶基因及其在大肠杆菌中的表达;在CN 101775385 A中 公开了来自嗜热拟青霉的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因及其在毕赤酵母(P.pastoris)中的表 达。为了使β-1，3-1，4-葡聚糖酶能够更好的适应工业生产条件，一些专利进一步公开了改 善β-1，3-1，4_葡聚糖酶的性质的方法。例如，CN 103045560 Α公开了定向突变获得的酸性 β-l，3-1，4-葡聚糖酶，在保持其它酶学性质基本不变的情况下，其最适pH由7.0改变为5.0; CN 101684475 A中公开了在毕赤酵母（P.pastoris)中表达由解淀粉芽孢杆菌 (B.amyloliquefaciens)P-l ,3-1,4-葡聚糖酶基因的氨基端107个氨基酸残基和浸麻芽孢 杆菌(B.macerans)P-l ,3-1,4-葡聚糖酶基因的羧基端107个氨基酸残基组成的杂合基因， 使其在酸性环境中的热稳定性大大高于单一野生型葡聚糖酶。
[0000]类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)是自然界广泛分布的一类兼性厌氧细菌，目前 已报道从Paenibacillus sp.S09(Cheng，et al.，2014，Biotechnology Letters,36:797-803)、Paenibacillus sp.X4(Na，et al.，2015，Biotechnology Letters,37:643-655)和 Paenibacillus sp.F_40(Yang，et al.,Journal of Microbiology and Biotechnology, 2007，17 : 58-66)中克隆和表达了一些β_1，3-1，4-葡聚糖酶。Osman等人（Osman，et al ·， International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2006,56: 1509-1514)从喷气推进实验室飞行器组装厂（Jet Propulsion Laboratory Spacecraft Assembly Facility)分离出了巴伦葛兹类芽抱杆菌(Paenibacillus barengoltzii)。本研 究组从南海海水中分离出了巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904,并从中克隆和表达了两种几丁质 酶（Yang，et al.，Food Chemisty，2016，192:1041_1048;Fu et al.，Biotechnology for Biofuels,2014,7)〇
[0007] 尽管目前已开展了许多β-1，3-1，4-葡聚糖酶的研究，但由于食品、饲料等行业生 产的实际需要，克隆和表达具有良好酶学性质和底物特异性的新型β-1，3-1，4-葡聚糖酶对 上述行业具有重要的意义。

【发明内容】

[0008] 针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种类芽孢杆菌β-l，3-1，4-葡聚糖酶及其编码基因与应用。
[0009] 本发明所提供的β-1，3_1，4-葡聚糖酶，来自巴伦葛兹类芽孢杆菌(Paenibacillus barengoltzii)，是以下（1)或(2)或(3)或(4)的蛋白质：
[0010] ⑴序列表序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011] (2)序列表序列2自氨基末端第31至416位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0012] (3)在所述(2)的羧基末端添加 Poly-His标签的蛋白质；具体为在所述(2)的羧基 末端添加了 ΑΑΑΙ?ΗΗΗΗΗΗ的蛋白质；
[0013] (4)将所述（1)或(2)或(3)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加所获得的具有相同功能的由（1)或(2)或(3)衍生的蛋白质。
[0014] 为了使（1)或（2)或（3)或(4)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表序列2所示的氨 基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0015] 表1标签的序列
[0016]
[0017]上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述蛋白 质的编码基因可通过将序列表序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码 子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标 签的编码序列得到。
[0018] 本发明保护上述蛋白质的编码基因。
[0019] 所述编码基因为以下(a)或(b)或(c)或(d)的DNA分子：
[0020] (a)序列表序列1所示的DNA分子；
[0021] (b)序列表序列1的第91至1248位所示的DNA分子；
[0022] (c)在严格条件下与（a)或（b)所限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质的DNA分 子；
[0023] (d)与(a)或(b)或(c)限定的DNA分子具有至少75%的序列同一性且编码所述蛋白 质的DNA分子。
[0024] 上述严格条件可为在6 X SSC，0.5 % SDS的溶液中，在65 °C下杂交，然后用2 X SSC， 0 · 1 % SDS和 1 X SSC，0· 1 % SDS各洗膜一次。
[0025]本发明保护含有以上任一所述编码基因的重组载体（即重组质粒）、表达盒、转基 因细胞系或重组菌。
[0026] 所述重组载体具体可为在载体pET_28a( + )的Nco I和Not I位点间插入了序列表 序列1中第91至1248位所示的DNA片段后获得侧重组质粒；
[0027]所述重组菌具体可为含有所述重组载体的大肠杆菌DH5a或大肠杆菌BL21(DE3)。
[0028] 本发明保护以上任一所述编码基因全长或其任意片段的引物对。
[0029] 本发明保护以上任一所述蛋白质在作为β-1，3_1，4-葡聚糖酶中的应用。
[0030] 该应用包括对β-l，3-1，4-葡聚糖进行水解的步骤；
[0031]和/或，所述β-1，3_1，4-葡聚糖为大麦β-葡聚糖、燕麦β-葡聚糖和地衣多糖中的至 少一种。
[0032]本发明保护以上任一所述蛋白质在作为β-1，3_葡聚糖酶中的应用。
[0033] 该应用包括对β-l，3-葡聚糖进行水解的步骤；
[0034] 和/或，所述β-1，3_葡聚糖为昆布多糖和可得然多糖中的至少一种。
[0035] 在上述应用中，
[0036]所述水解的pH 值可为3-10.5，或3.5-9.0，如3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、 6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5〇
[0037]和/或，所述水解的温度可为40-75 °C，或40-55 °C，如40°C、45 °C、50°C、55 °C、60 Γ、65Γ、70Γ、75Γ。
[0038] 在上述应用中，所述应用为在麦芽糖化中的应用；
[0039] 和/或，在燕麦麸皮水解中的应用；
[0040] 和/或，在制备可得然寡糖中的应用。
[0041] 本发明保护所述编码基因及所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在制 备β-l，3-1，4-葡聚糖酶和/或β-l，3-葡聚糖酶中的应用。
[0042]实验证明，本发明所提供的蛋白质（在实施例中具体为重组蛋白R_PbBglul6A)具 有β-l，3-1，4-葡聚糖酶活性，具有431.8U · mg4的比酶活力，最适反应pH为6.0，并且在较宽 的pH范围内（pH3.5-9)保持稳定;最适反应温度为55°C，并且在55°C以下保持较高酶活力， 具有较好的耐热性;底物专一性较强，在麦芽糖化过程中加入该蛋白质可以显著降低粘度、 缩短过滤时间；在燕麦麸皮β-葡聚糖水解过程中加入该蛋白质，可以显著提高β-葡寡糖得 率，该蛋白质对外源酶失活的燕麦麸皮水解时，可以获得相对含量较高的葡三糖和葡四糖； 另外，该蛋白质作为β_1，3葡聚糖酶还可以用于制备可得然寡糖。本发明提供的蛋白质具有 良好的β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶学性质;在食品、饲料行业中具有良好的应用价值。
【附图说明】
[0043]本发明有如下附图：
[0044]图1为SDS-PAGE电泳图，其中泳道Μ:低分子量标准蛋白；泳道1:粗酶液;泳道2:纯 化的重组蛋白R-PbBglul6A的溶液。
[0045] 图2为重组蛋白R-PbBglul6A的最适pH测定结果。
[0046] 图3为重组蛋白R-PbBglul6A的pH稳定性测定结果。
[0047]图2和图3中的"?"表示柠檬酸-柠檬酸缓冲液；" ▲"表示MES缓冲液；" "表示 MOPS缓冲液；"〇"表示Tris-HCl缓冲液；"□"表示甘氨酸-NaOH缓冲液。
[0048]图4为重组蛋白R-PbBglul6A的最适温度测定结果。
[0049] 图5为重组蛋白R-PbBglul6A的温度稳定性测定结果。
[0050] 图6为不同水解时间下重组蛋白R-PbBglul6A水解燕麦麸皮和内源酶失活的燕麦 麸皮的葡寡糖得率测定结果。其中，"?"表示加入150U/g燕麦麸皮的重组蛋白R-PbBglul6A时，燕麦麸皮水解后β-葡寡糖得率；"〇"表示加入150U/g燕麦麸皮的重组蛋白R-PbBglul6A时，内源酶失活的燕麦麸皮水解后β-葡寡糖得率；"·"表示不加重组蛋白R-PbBglul6A时，燕麦麸皮水解后β-葡寡糖得率；"□"表示不加重组蛋白R-PbBglul6A时，内源 酶失活的燕麦鼓皮水解后β_匍寡糖得率。
[0051 ]图7为重组蛋白R-PbBglul6A水解燕麦麸皮后水解产物的薄层色谱(Thin Layer Chromatography，TLC)分析结果。其中，G1、G2、G3和G4分别表示葡萄糖、纤维二糖、纤维三糖 和纤维四糖;Gn表示寡糖标准;0B+表示加入重组蛋白R-PbBglul6A时燕麦麸皮的水解产物； 0B-表示未加重组蛋白R-PbBglul6A时燕麦麸皮的水解产物；D0B+表示加入重组蛋白R-PbBg lu 16A时内源酶失活的燕麦麸皮的水解产物。
[0052]图8为重组蛋白R-PbBglul6A水解可得然多糖后水解产物的TLC分析结果。其中， 61、1^、1^、1^丄5和1^分别表示葡萄糖、昆布二糖、昆布三糖、昆布四糖、昆布五糖和昆布六 糖；Μ表示寡糖标准；0、15、30、60、120、240min分别指在不同水解时间下重组蛋白R-pbBglul6A水解可得然多糖的水解产物。
【具体实施方式】
[0053]以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
[0054] 以下实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明均为可从商业途径获得。
[0055] 以下实施例中，参照 Yang 等（Yang, et al·，Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology 2014,41(10): 1487-1495)的方法，测定β-l，3_1，4_葡聚糖 酶的酶活力：添加50yL 1 % (w/v)的大麦β-葡聚糖于小试管中，55°C预热3min，然后加入150 yL适当稀释的待测酶液（即待测蛋白的溶液），55°C反应10min后加入200yL DNS试剂(每1L 水溶液包含1(^3,5-二硝基水杨酸(0吧），1(^似0!1和28苯酚），煮沸151^11后加入20(^饱 和酒石酸钾钠溶液，冷却后于540nm波长下测定吸光值，以葡萄糖作为标准。
[0056] β-l，3-1，4-葡聚糖酶活力单位的定义为:在上述条件下每分钟水解大麦β-葡聚糖 生成Ιμπιο?葡萄糖所需要的酶量。
[0057]巴伦葛兹类芽抱杆菌（Paenibacillus barengoltzii)CAU904在文献"Fu X.et al.，Biotechnology for Biofuels.2014,7:174"中公开，公众可从中国农业大学获得。 [0058] 琼脂糖Ni-IDA亲和柱购自美国GE公司，产品目录号为17-0575-01。
[0059] 实施例1.基因 PbBglul6A及蛋白PbBglul6A的获得
[0060]设计上游引物 PbBglul6AncoF:
[0061 ] 5 ' -TGACTCCATGGGCGCTCCCAACTGGCAGTTG-3 '（下划线示Nco 頂每切位点，下划线后 前两个碱基用来补全目的载体上的甘氨酸读码框，第3位至最后碱基与序列表序列1中第 91一108位相同）；
[0062] 和下游引物 PbBglul6AnotR:
[0063] 5 ' -TGACTGCGGCCGCGTTTACCTTCGTAAACATCCACTT-3 '（下划线示Not I酶切位点，下 划线后序列与序列表序列1中的第1225-1248位相匹配）；
[0064]并以巴伦葛兹类芽孢杆菌CAU904的基因组DNA为模板，PCR扩增成熟蛋白的氨基酸 的编码基因序列。
[0065] PCR扩增条件为:94°C预变性5min;94°C变性30s，54°C退火30s，72°C延伸80s，循环 35次；最后72°C后延伸5min。
[0066] PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳回收，以Nco I和Not I双酶切。将该双酶切后的 产物与经相同双酶切过的原核表达载体pET-28a(+)的载体骨架片段以T4 DNA连接酶进行 连接，转化至宿主大肠杆菌DH5a。挑选菌落PCR(PCR所用的引物和扩增条件与本段前述PCR 的相同）验证为阳性的转化子测序。
[0067]结果：阳性转化子中的重组质粒为在载体pET_28a( + )的Nco I和Not I位点间插入 了序列表序列1中第91至1248位所示的DNA片段，所述阳性转化子即重组菌A为含有所述重 组质粒的大肠杆菌DH5a。
[0068] 将序列表序列1中第1至1251位所示的基因命名为基因 PbBglul6A，将该基因所编 码的蛋白命名为蛋白PbBglul6A，其氣基酸序列如序列表序列2所不。
[0069] 实施例2.重组蛋白R-PbBglul6A的表达和纯化
[0070]提取实施例1获得的重组菌A中的所述重组质粒，转化表达至宿主大肠杆菌BL21 (DE3)。将阳性转化子接种至1L LB液体培养基(含50yg ml/1卡那霉素）。在37°C，200rpm条件 下培养至〇D6qq在0.6-0.8之间，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)至终浓度为ImM，30 °C 诱导过夜。离心收集菌体后，将菌体按照1:10(v/v)的比例，用缓冲液A(20mM pH 8.0磷酸缓 冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑）重悬浮，然后于冰水浴中超声破碎(200W，超声3s，间歇4s，120 次），再离心收集上清液即为粗酶液。
[0071]基于载体pET28-a( + )中有编码His-Tag标签蛋白的序列，使用琼脂糖Ni-IDA亲和 柱纯化重组蛋白R-PbBglul6A(其氨基酸序列为在序列表序列2中第31至416位所示氨基酸 序列的羧基末端添加了AAALEHHHHHH)。具体纯化步骤如下：
[0072]将粗酶液上样于Ni-IDA柱进行纯化。纯化过程为(流速为lmL mirT1):先用缓冲液A (20mM pH 8.0磷酸缓冲液，0.5M NaCl，20mM咪唑）洗脱至0D28q小于0.05,然后用缓冲液B (20mM pH 8.0磷酸缓冲液，0.5M NaCl，50mM咪唑）洗脱至0D，小于0.1，最后用缓冲液C (50mM pH 8.0磷酸缓冲液，0.5M NaCl，200mM咪唑）洗脱。收集缓冲液C洗脱部分，得到纯化 的重组蛋白R-PbBglul 6A的溶液。
[0073] 经SDS-PAGE(Laemmli，U.K.Nature ,1970,227(5259) :680-685)检测蛋白纯度（图 1)。测定纯化的重组蛋白R-PbBglul6A的溶液以及未经纯化的相应粗酶液中总蛋白量、β-1， 3-1，4-葡聚糖酶的酶活力以及比酶活力；以粗酶液的总酶活力为100%，计算纯化回收率； 以粗酶液的纯化倍数为1，计算纯化倍数，结果如表2所示。
[0074] 其中，蛋白含量的测定米用lowry法（Lowry，0.H.et al ·，Journal of Biological Chemistry，1951,193(1) :265-275)，并使用牛血清白蛋白作为标准蛋白。
[0075] 表2重组蛋白R_PbBglul6A纯化表
[0076]
[0077]实施例3.重组蛋白R_PbBglul6A作为β-1，3_1，4-葡聚糖酶的性质
[0078] -、最适pH测定
[0079] 将重组蛋白R_PbBglul6A和底物大麦β-葡聚糖分别溶于以下5种具有不同pH值的 缓冲体系：柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(pH 3.〇-6.〇);腿3(2-0-吗啉代）乙磺酸)缓冲液(？!1 5.5-7.0) ;M0PS(2-(N-吗啉代）丙磺酸）缓冲液(pH 6.0-8.5) ;Tris-HCl缓冲液(pH 7.0- 9.0);甘氨酸/NaOH缓冲液(pH 8.5-10.5)。然后，55°C下测定β_1，3-1，4_葡聚糖酶酶活力， 以酶活力最高值作为100%，分别计算各pH下测定的相对酶活力，结果如图2所示。
[0080] 图2显示:重组蛋白R-PbBglul6A作为β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最适pH值为6.0(柠檬 酸/柠檬酸钠缓冲液)。
[0081 ] 二、pH稳定性测定
[0082] 分别用步骤一中5种具有不同pH值的缓冲体系稀释重组蛋白R-PbBglul6A，将稀释 好的重组蛋白R_PbBglul6A溶液进行如下处理:在50°C恒温水浴锅中保温30min，然后在冰 水浴中冷却30min;
[0083] 在55°C和pH 6.0条件下测定β-1，3-1，4_葡聚糖酶酶活力，以经相同缓冲体系稀释 但未经上述处理的稀释好的重组蛋白R-PbBglul6A溶液的β-l，3-1，4_葡聚糖酶酶活力为对 照;分别计算经不同缓冲体系处理后的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百分比 计算相对酶活力。
[0084] 结果如图3所示。图3表明：重组蛋白R-PbBglul6A作为β-1，3-1，4-葡聚糖酶具有较 宽的pH稳定范围，当pH为3.5-9.0时，残余的相对酶活力都在80%以上。
[0085] 三、最适反应温度测定
[0086]将重组蛋白R_PbBglul6A在50mM柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中适当稀释，然 后分别在40-75Γ温度下测定β-1，3-1，4-葡聚糖酶的酶活力，以酶活力的最高值作为 100%，分别计算各个温度下测定的相对酶活力，结果如图4所示。
[0087]图4表明：重组蛋白R-PbBglul6A作为β-1，3-1，4-葡聚糖酶的最适温度为55°C。 [0088]四、温度稳定性测定
[0089]将重组蛋白R-PbBglul6A在50mM的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)中适当稀释 后，进行如下热处理:分别在40_75°C下保温30min，随后立即在冰水浴中冷却30min;
[0090] 最后在55°C和pH 6.0条件下测定β-l，3-1，4_葡聚糖酶的酶活力，以未经热处理的 经上述稀释后的重组蛋白R-PbBglul6A溶液作为对照，分别计算不同温度下热处理后经上 述稀释后的重组蛋白R_PbBglul6A溶液中的残余酶活力。以残余酶活力占对照酶活力的百 分比计算相对酶活力。结果如图5所示。
[0091] 图5显示：重组蛋白R-PbBglul6A作为β-1，3-1，4-葡聚糖酶在55°C以下较为稳定， 相对酶活力能保持80%以上。
[0092] 五、底物特异性
[0093]使用多种聚糖和人工合成的对硝基苯酚-糖苷(pNP-糖苷)作为底物测定重组蛋白 R-PbBglul6A的底物特异性。
[0094]聚糖包括:大麦β-葡聚糖、地衣多糖、燕麦β-葡聚糖、昆布多糖、桦木木聚糖、普鲁 兰糖、可溶性淀粉、刺槐豆胶和羧甲基纤维素钠；
[0095] pNP-糖苷包括:ρΝΡ-β-木吡喃糖苷、ρΝΡ-β-半乳糖吡喃糖苷、ρΝΡ-α-半乳糖吡喃糖 苷、ρΝΡ-β-吡喃葡萄糖苷和ρΝΡ-α-吡喃葡萄糖苷。
[0096]具体测定方法如下：
[0097]对于聚糖作为底物，将上述不同的聚糖作为测试底物用50mM pH 6.0柠檬酸/柠檬 酸钠缓冲液配制为l%(w/v)的浓度，根据上述β-1，3-1，4-葡聚糖酶酶活力的测定方法测 定；
[0098]对于人工合成的ρΝΡ-糖苷作为底物，将上述不同的人工合成的ρΝΡ-糖苷用50mM pH 6.0柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液配制成5mM浓度，在55°C下反应lOmin，测定410nm处的吸光 值，此时酶活力单位(U)定义为在上述反应条件下每分钟水解底物释放Ιμπιο? ρΝΡ所需要的 酶量。
[0099] 以大麦β-葡聚糖为底物时测定的酶活力为对照（100%)，计算其它底物条件下的 相对酶活力，结果如表3所示，其中未在表3中列出的上述底物表示以其为底物时，重组蛋白 R-PbBglul6A的相对酶活力低于5%。
[0100] 表3中的结果表明：重组蛋白R-PbBglul6A对由β-1，3糖苷键和β-1，4糖苷键组成的 大麦β-葡聚糖、燕麦β-葡聚糖及地衣多糖表现出较高活性，相对酶活力分别为100 %、 92.3%及49.8%。重组蛋白1?-?匕8811116六也能水解由0-1，3糖苷键连接的昆布多糖，其相对 酶活力为20.5%。但是重组蛋白1?-?匕8811 116六不能水解木聚糖、羧甲基纤维素钠、普鲁兰糖、 可溶性淀粉和刺槐豆胶等其他聚糖，同时也不能水解人工合成的ρΝΡ-糖苷。
[0101] 表3重组蛋白R-PbBglul6A作为β-1，3-1，4-葡聚糖酶的底物特异性
[0102]
[0103]实施例4.重组蛋白R-PbBglul6A在麦芽糖化中的应用
[0104] -、麦芽汁的制备
[0105] 麦芽汁制备采用协定糖化，具体如下：
[0106] 称取50.0g麦芽细粉(粒径〈0.2mm)于已知重量的糖化杯中，加入200mL 45°C的水， 于45°C水浴锅中保温30min(实验组按照表4加入一定量的重组蛋白R-PbBglul6A的水溶 液），不断搅拌。然后使醪液以l°C/min的速度在25min内升温至70°C，再往糖化杯中加入 100mL 70°C的水，并在70°C下保温lh。糖化结束后，将醪液在10-15min内迅速冷却至室温， 用蒸馏水将醪液补重至450.0g，然后用中速滤纸过滤，将最初收集的100ml滤液倒回重滤， 直至滤层表面没有液体为止，所收集的滤液即为协定麦芽汁。
[0107] 二、麦芽汁过滤时间的测定
[0108]在步骤一中的协定糖化结束后，将补重至450.0g的醪液迅速倾倒在罩有中速滤纸 的漏斗中（滤纸共18折，漏斗直径15cm)，将最初收集的100mL滤液倒回重滤，记录收集200mL 滤液所需的时间即为麦芽汁的过滤时间。
[0109]三、麦芽汁比重及浸出物含量的测定
[0110]根据EBC(欧洲酿造协会)标准方法测定麦芽汁浸出物含量，具体如下：
[0111]将煮沸后冷却至15°C的水注满干燥、恒重的比重瓶(m)，并置于20°C水浴锅中至恒 温，称量装满水的比重瓶的重量(nu)。在相同的比重瓶中，加入"实施例4步骤一"中制备好 的麦芽汁，以相同方法称量装满麦芽汁的比重瓶的重量(m2)。麦芽汁在20°C的比重根据下 式(1)计算：
[0112]
[0113] 其中，表示麦芽汁20°C的比重。
[0114] 根据比重查相对密度与浸出物含量对照表可得麦芽汁浸出物含量G。
[0115] 四、麦芽汁粘度的测定
[0116]采用HAAKE落球式粘度计测定，记录落球从落球管上端刻度线到落至下端刻度线 所需的时间。麦芽汁的粘度根据下式(2)计算：
[0117] n=K(pi-P2)t (2)
[0118] 其中，K表示落球式粘度计的落球系数，0.01006mPa · S · cm3/g · S;P1表示落球式 粘度计的落球密度，2.221g/cm3;p2表示麦芽汁的密度(g/cm3)，其可以通过乘以水的密 度获得;t表示落球时间（s)。
[0119] 按照下式(3)，将以上计算获得的粘度换算成为麦芽汁百分浓度为8.6时的粘度：
[0120]
[0121] 其中，E表示麦芽汁百分浓度为8.6时的粘度(mPa · s);n表示落球式粘度计测定出 来的麦芽汁粘度(mPa · s);G表不麦芽汁的浸出物含量(g)。
[0122] 五、结果
[0123] 重组蛋白R-PbBglul6A对麦芽糖化的影响如表4所示。结果表明随着重组蛋白R-PbBglul6A用量的增大，麦汁的过滤时间和粘度均有所降低，当该重组蛋白R-PbBglul6A的 添加量为80U/g麦芽时，麦芽汁粘度减少了3.38%，过滤速度提高了 14.04%。
[0124] 表4重组蛋白R-PbBglul6A对麦芽糖化的影响
[0125]
[0126]
[0127]实施例5.重组蛋白R_PbBglul6A在水解燕麦麸皮β-葡聚糖中的应用
[0128] 本实施例所用的燕麦麸皮为常规脱油燕麦麸皮，粒径在10-200目之间。
[0129] -、酶解燕麦麸皮β-葡聚糖的方法
[0130] 本实施例比较了重组蛋白R-PbBglu 16Α水解燕麦麸皮以及内源酶失活的燕麦麸皮 中葡聚糖的效果。其中，内源酶失活的燕麦麸皮是通过将燕麦麸皮以l:l〇(w/v)加入80% 乙醇，并在75°C下加热回流2h制备获得的。
[0131]水解过程具体如下：将1.5g燕麦麸皮或内源酶失活的燕麦麸皮加入30ml 50mM柠 檬酸/柠檬酸钠冲液(pH 6.0)中，然后不加或以150U/g燕麦麸皮的比例加入重组蛋白尺-PbBglul 6A。将混合物置于50°C水浴振荡12h进行水解。
[0132] 二、水解产物检测
[0133] 于步骤一水解时间为0、0.5、1、2、4、8和12h时分别取样。将样品在沸水浴中保持 5min使酶失活，然后离心去上清液通过DNS法测定还原糖含量。将β-葡寡糖得率定义为lg燕 麦麸皮所获得的还原糖，并根据以下公式进行计算：
[0134]
[0135] 通过TLC分析比较水解产物。TLC分析操作如下：取lyL不同水解液分别点样于TLC 层析板，将TLC层析板置于展层剂(正丁醇：乙酸:水=2:1:1)中。待展层结束后用显色剂(硫 酸：甲醇=5:95) 130 °C烘烤显色。
[0136]三、结果
[0137] 如图6所示，对于燕麦麸皮，加入重组蛋白R_PbBglul6Al 50U/g燕麦麸皮水解燕麦 麸皮8h可获得最高的β-葡寡糖得率(9.5% )，不加重组蛋白R-PbBglul6A时，β-葡寡糖得率 为5.3 % (由于内源酶的作用）。而对于内源酶失活的燕麦麸皮，加入150U/g燕麦麸皮的重组 蛋白R-PbBglul6A水解燕麦麸皮8h可获得最高的β-葡寡糖得率(7.0% )，而不加重组蛋白R-PbBglul6A时的β-葡寡糖得率小于1 %。
[0138] 如图7所示，对于燕麦麸皮水解产物，加重组蛋白R-PbBglul6A时的水解产物包括 二糖、三糖和四糖等一系列寡糖，而不加重组蛋白R_PbBglul6A时的水解产物主要为二糖和 三糖，并包含少量四糖；而对于内源酶失活的燕麦麸皮，加入重组蛋白R_PbBglul6A的水解 产物以三糖和四糖为主。
[0139] 以上结果表明：对于燕麦麸皮中β-葡聚糖的水解过程来说，通过加入重组蛋白R-PbBglul6A可以有效提高β-葡寡糖得率，而对于内源酶失活的燕麦麸皮中β-葡聚糖的水解 过程来说，通过加入重组蛋白R _PbBglul6A可以获得相对$父尚的β-匍寡糖得率，同时β-匍寡 糖的组成以功能性三糖和四糖为主，因而对于β-葡寡糖的生产具有较好的工业应用价值。
[0140] 实施例6.重组蛋白R-PbBglul6A在制备可得然寡糖中的应用
[0141] -、酶解可得然多糖方法
[0142] 重组蛋白R-PbBglul6A具有较宽泛的底物特异性，不仅对β-1，3_1，4-葡聚糖(如大 麦葡聚糖、地衣多糖)有很高水解活力，也对β-1，3_葡聚糖(如昆布多糖)有水解活力。本 实施例是利用重组蛋白R-PbBglul6A的β-1，3-葡聚糖酶活性水解可得然多糖（英文名 Curdlan，中文译名有可得然多糖、可的兰多糖、可得然胶、可的兰胶、凝胶多糖、热凝胶多 糖)制备低聚糖。
[0143] 具体操作为，将5g可得然多糖加入100ml 20mM醋酸盐缓冲液(pH 6.0)中，lOOrpm 条件下，50°C预热30min，使得混合物成为胶状悬液，随后加入重组蛋白R-PbBglul6A的水溶 液，使重组蛋白R_PbBglul6A的初始浓度为0.5U/mL(以昆布多糖酶活力计，昆布多糖酶的活 力测定方法及定义与上述β-l，3-1，4-葡聚糖酶的酶活力测定方法及定义相同，但将底物换 为昆布多糖），混匀后将混合物置于50°C水浴4h进行水解。
[0144] 二、水解产物检测
[0145] 于步骤一水解时间为0、15、30、60、120、240min分别从水解液中取样，将样品在沸 水浴中保持5min使酶失活，然后离心去上清液，通过TLC分析比较水解产物。TLC分析操作： 取UiL不同水解液分别点样于TLC层析板，将TLC层析板置于展层剂(正丁醇：乙酸:水= 2:1: 1)中。展层结束后用显色剂(硫酸：甲醇= 5:95)130°C烘烤显色。
[0146]三、结果
[0147] 如图8所示，5%(w/v)的可得然多糖悬液在加入重组蛋白R_PbBglul6A后，4h左右 可以被完全水解。TLC分析显示重组蛋白R-PbBglul6A水解可得然多糖获得的寡糖水解产物 随着水解反应进行逐渐积累，最终水解产物主要含葡萄糖、昆布二糖、昆布三糖、昆布四糖 和少量的更高聚合度寡糖。
[0148] 本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
【主权项】
1. 一种蛋白质，是以下（1)或(2)或(3)或(4)的蛋白质： (1) 序列表序列2所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (2) 序列表序列2自氨基末端第31至416位所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (3) 在所述(2)的羧基末端添加 Po ly-Hi s标签的蛋白质； (4) 将所述（1)或(2)或(3)的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加所获得的具有相同功能的由（1)或(2)或(3)衍生的蛋白质。2. 权利要求1所述蛋白质的编码基因。3. 如权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因为以下(a)或(b)或(c)或 (d)的DNA分子： (a) 序列表序列1所示的DNA分子； (b) 序列表序列1的第91至1248位所示的DNA分子； (c) 在严格条件下与（a)或(b)所限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质的 DNA分子； (d) 与（a)或(b)或（c)限定的DNA分子具有至少75%的序列同一性且编码权利要求1所 述蛋白质的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。5. 权利要求1所述蛋白质在作为β_1,3-1,4-葡聚糖酶中的应用。6. 如权利要求5所述的应用，其特征在于:所述应用包括对β-l，3-1，4-葡聚糖进行水解 的步骤； 和/或，所述β-1，3-1，4-葡聚糖为大麦β-葡聚糖、燕麦β-葡聚糖和地衣多糖中的至少一 种。7. 权利要求1所述蛋白质在作为β_1,3-葡聚糖酶中的应用。8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于:所述应用包括对β-l，3-葡聚糖进行水解的步 骤； 和/或，所述β-1，3-葡聚糖为昆布多糖和可得然多糖中的至少一种。9. 如权利要求5-8中任一所述的应用，其特征在于:所述水解的pH值为3-10.5; 和/或，所述水解的温度为40-75°C ; 和/或，所述应用为在麦芽糖化中的应用； 和/或，所述应用为在燕麦麸皮水解中的应用； 和/或，所述应用为在制备可得然寡糖中的应用。10. 权利要求2和3所述编码基因及权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或 重组菌在制备β-l，3-1，4-葡聚糖酶和/或β-l，3-葡聚糖酶中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK106085989SQ201610416008
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月14日 公开号201610416008.5, CN 106085989 A, CN 106085989A, CN 201610416008, CN-A-106085989, CN106085989 A, CN106085989A, CN201610416008, CN201610416008.5
【发明人】闫巧娟, 江正强, 张彬, 刘瑜, 杨红叶
【申请人】中国农业大学