一种酯酶WDEst9及其编码基因和应用
【专利摘要】本发明公开了一种酯酶WDEst9及其编码基因和应用。本发明从囊孢菌NRRL18085中克隆到了一个酯酶基因WDEst9，全长为936bp，其编码的酯酶WDEst9共包含311个氨基酸。酯酶WDEst9可用于拆分手性2?氯丙酸甲酯、2?氯丙酸乙酯和乳酸甲酯，利用酯酶WDEst9作为催化剂，分别制备得到了光学纯度大于99％的(S)?2?氯丙酸甲酯(转化率82.56％)、(S)?2?氯丙酸乙酯(转化率87.48％)和(L)?乳酸甲酯(转化率86.75％)。
【专利说明】
一种酯酶WDEst9及其编码基因和应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种酯酶WDEst9及其编码基因和 应用。
【背景技术】
[0002] 当今世界上所使用的原料药接近一半都是合成药，而其中有四成是外消旋体。在 外消旋体中，不同对映体往往会表现出截然不同的生理活性和毒性。误用这些药会导致严 重的后果，如R型的"反应停"是孕妇用镇痛药和止痛药，而S型的"反应停"对胎儿则有致畸 作用；巴比妥酸盐S-(_)异构体具有抑制神经活动的作用，而R_( + )异构体却具有兴奋作用。 为了减少有毒副作用的对映体，并降低其生物活性，光学纯手性药物的合成研究一直是制 药研究领域的焦点。但是由于技术和成本等方面的原因，国内还有很多药物仍使用他们的 外消旋体。所以研究和开发具有我国自主产权的酯酶/脂肪酶具有十分重要的意义。
[0003] 光学纯的2-氯丙酸及其酯是合成一些旋光性农药的重要原料，它可以替代一些农 药中间体，如2-对甲基苯磺酰丙酸酯、2-甲磺酰丙酸酯等。同时，它还可以用于合成医药中 间体2-氯丙酸、消炎止痛药布洛芬等。其中，（S)-2_氯丙酸及其酯通常具有较高的生理活性 或药理作用，而(R)-2_氯丙酸及其酯衍生的产物生理活性低或者无活性。因此对2-氯丙酸 及其酯光学异构体的拆分分离研究具有重要的应用价值。
[0004] 乳酸酯，特别是乳酸甲酯，是重要的香料及工业溶剂，在食品、医药、农业、精细化 工等领域都得到广泛的应用。（L)-乳酸甲酯是合成一种重要的非留体镇痛药布洛芬的药物 中间体，并且由（L)-乳酸甲酯合成的（S)-布洛芬的疗效要比（D)-布洛芬高28倍。但由于生 产技术和生产成本方面的原因，目前我国市售的布洛芬大多数是外消旋体。随着人们对手 性药物不同对映体的生理和药理性差异的了解，以及认识到合成和使用单一对映体药物的 重要性，由光学纯乳酸甲酯直接合成相应光学纯药物的研究将会受到越来越多的重视。
[0005] 当今国内外对于乳酸甲酯和2-氯丙酸及其酯光学异构体的分离常用的方法主要 有:化学法、色谱法和酶法等。其中，化学拆分法拆分需要昂贵的手性试剂，且多数情况下较 难得到满意的收率;色谱法拆分需要CSP、添加剂CMP或用手性试剂衍生化;而生物酶法拆分 具有立体选择性强，反应条件温和，成本低等优点，更重要的是属于绿色化学范畴而备受青 睐。可以预见，生物酶拆分将是手性药物发展的一个朝阳方向，因此开发具有光学选择性的 生物酶对于手性化合物的拆分具有非常大的推动作用。
【发明内容】
[0006] 本发明针对现有技术中酯酶价格昂贵、生产技术受到制约的不足，提供一种新的 酯酶WDEst9及其编码基因和应用。
[0007] 本发明从一株囊抱菌（Dactylosporangium aurantiacum subsp.Hamdenensis) NRRL18085基因组中开发了一种新的酯酶WDEst9及其编码基因 WDEst9,构建了含有WDEst9 的重组表达载体和基因工程菌，培养基因工程菌后获得酯酶WDEst9,其可应用于拆分（±)_ 2-氯丙酸甲酯、（±)-2_氯丙酸乙酯、（±)_乳酸甲酯。
[0008] 本发明的第一个目的是提供一种酯酶WDEst9,其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种编码所述的酯酶WDEst9的酯酶基因 WDEst9。
[0010] 优选，所述的酯酶基因 WDEst9的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 本发明还提供一种含有所述的酯酶基因 WDEst9的重组表达载体。所述的表达载 体，优选pET28a( + )载体。
[0012]本发明还提供一种含有所述的酯酶基因 TOEst9的基因工程菌。所述的基因工程 菌，优选大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0013]本发明的第三个目的是提供酯酶WDEst9在拆分（± )-2-氯丙酸甲酯制备得到（S)-2_氯丙酸甲酯中的应用。
[0014] 进一步优选，其步骤为:取酯酶WDEst9于pH为6.0-10.0的缓冲液中，再加入（±)_ 2_氯丙酸甲酯，进行反应，得到(S) -2-氯丙酸甲酯。
[0015]进一步优选，所述的缓冲液为柠檬酸-梓檬酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris/HCl 缓冲液和甘氨酸-NaOH缓冲液中的一种。
[0016] 本发明的第四个目的是提供酯酶WDEst9在拆分（± )-2-氯丙酸乙酯制备得到（S)-2-氯丙酸乙酯中的应用。
[0017] 进一步优选，其步骤为:取酯酶WDEst9于pH为6.0-10.0的缓冲液中，再加入（± )-2-氯丙酸乙酯，进行反应，得到(S)-2-氯丙酸乙酯。
[0018] 本发明的第五个目的是提供酯酶WDEst9在拆分（±)_乳酸甲酯制备得到(L)-乳酸 甲酯中的应用。
[0019] 进一步优选，其步骤为:取酯酶WDEst9于pH为6.0-10.0的缓冲液中，再加入（±)_ 乳酸甲酯，进行反应，得到(L)-乳酸甲酯。
[0020] 本发明还提供酯酶WDEst9在耐受他+、1(+、1^2+、环己烷、正辛烷、正癸烷、二甲基亚 砜或三聚磷酸钠环境下进行催化的应用。
[0021 ]本发明的酯酶基因 w D E s t 9来自深海样品中筛选得到的一株囊孢菌 (Dactylosporangium aurantiacum subsp.Hamdenensis)NRRL18085，保存在中国科学院南 海海洋研究所实验室。本发明用生物信息学分析的方法，从基因组测序的囊孢菌 (Dactylosporangium aurantiacum subsp·Hamdenensis)NRRL18085中筛选得到酯酶基因 WDEst9,全长为936bp(从起始密码子到终止密码子），编码311个氨基酸。通过克隆编码酯酶 WDEst9的酯酶基因 WDEst9并将其连接表达载体pET-28a( + )后转化大肠杆菌BL21(DE3)，培 养并诱导表达后，得到了重组表达的酯酶WDEst9。酯酶WDEst9作为催化剂拆分（±)-2_氯丙 酸甲酯，可制备得到99%光学纯度的（S)-2-氯丙酸甲酯;酯酶WDEst9作为催化剂拆分（±)_ 2-氯丙酸乙酯，可得到99%光学纯度的（S)-2-氯丙酸乙酯。酯酶WDEst9作为催化剂拆分 (±)_乳酸甲酯，可得到99%光学纯度的（L)-乳酸甲酯。酯酶WDEst9具有稳定性高、催化效 率高的优点，在生物化工和生物医药等领域具有非常大的应用价值。
【附图说明】
[0022]图1是酯酶WDEst9对不同侧链长度的对硝基苯酚酯酶活。
[0023]图2是酯酶WDEst9的最适pH及pH稳定性，A为最适反应pH曲线图，B为pH稳定性曲线 图。
[0024] 图3是酯酶WDEst9的最适反应温度和温度稳定性，A为最适反应温度曲线图，B为温 度稳定性曲线图。
[0025] 图4是不同浓度NaCl(KCl)对酯酶WDEst9酶活性影响。
[0026]图5是酯酶WDEst9拆分（± )-2-氯丙酸甲酯反应GC图，A为样品（± )-2-氯丙酸甲酯 气相图，B为酯酶WDESt9拆分（±)-2-氯丙酸甲酯反应2.0h后的气相图，其中S代表(S)-2-氯 丙酸甲酯，R代表(R)-2_氯丙酸甲酯。
[0027]图6是酯酶WDEst9拆分（± )-2-氯丙酸乙酯反应GC图，A为样品（± )-2-氯丙酸乙酯 气相图，B为酯酶WDESt9拆分（±)-2-氯丙酸乙酯反应2.0h后的气相图，其中S代表(S)-2-氯 丙酸乙酯，R代表(R)-2-氯丙酸乙酯。
[0028]图7是酯酶WDEst9拆分（± )_乳酸甲酯反应GC图，A为样品（± )_乳酸甲酯气相图，B 为酯酶WDEst9拆分（±)_乳酸甲酯反应l.Oh后的气相图，其中L代表(L)-乳酸甲酯，D代表 (D)-乳酸甲酯。
[0029] 图8是酯酶WDEst9的蛋白表达纯化情况，其中，Μ为蛋白Marker，1为未经IPTG诱导 的含有pET-28a( + )-WDEst9的大肠杆菌BL21(DE3)，2为经IPTG诱导的含有pET-28a( + )_ WDEst9的大肠杆菌BL21(DE3)，3为镍柱穿透液，4为Ni柱纯化后得到的酯酶WDEst9,5为经过 脱盐柱后的酯酶WDEst9。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0031] 下列实例中未具体注明的实验方法，均可按照常规方法进行，或按照所用产品生 产厂商的使用说明。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径 得到。
[0032 ]本发明的酯酶基因 w D E s t 9来自深海样品中筛选得到的一株囊孢菌 (Dactylosporangium aurantiacum subsp .Hamdenensis)NRRL18085，该菌保存在中国科学 院南海海洋研究所实验室。
[0033] 实施例1:酯酶基因 WDEst9引物设计及开放阅读框边界确定
[0034] 提取囊抱菌（Dactylosporangium aurantiacum subsp.Hamdenensis)NRRLl8〇85 的基因组DNA，经测序验证无误后，利用生物信息学手段对基因组进行注释，分析其中的酯 酶基因，确定了其中酯酶基因 WDEst9的开放阅读框，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，全 长为936bp(从起始密码子到终止密码子），其编码的酯酶WDEst9的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，共311个氨基酸，该基因是一个全新的酯酶基因。根据分析得到的酯酶基因 WDEst9序列，设计引物如下:正向引物W -CATGAATTCATGCCACTCGACCCGCAG-37，下划线部分 为EcoR頂每切位点；反向引物:5 7 -CACAAGCTTTTAGGATCCGAACCACGC-37，下划线部分为Hind m酶切位点。
[0035] 实施例2:酯酶基因 WDEst9的克隆及载体构建
[0036] 2.1PCR 扩增
[0037] 将实施例1设计的引物(正向引物W -CATGAATTCATGCCACTCGACCCGCAG-37，反向引 物:5^ -CACAAGCTTTTAGGATCCGAACCACGC-37 )送至上海生物工程有限公司合成引物，合成的 引物使用TE稀释到ΙΟμΜ，提取囊抱菌（Dactylosporangium auran tiacum subsp.Hamdenensis)NRRL18085的总DNA作为DNA模板，建立如表1所示反应体系：
[0038] 表1 PCR反应体系
[0039]
[0040] 使用以下PCR扩增程序扩增酯酶基因 WDEst9:a.94°C变性3min;b.94°C变性30s，55 ~65°C退火0.5-lmin，72°C延伸lmin，进行20个循环;c.72°C延伸lOmin，冷却到10°C。
[00411将PCR产物在1 %琼脂糖凝胶中，120V电压下电泳20min，置于凝胶成像系统中观 察。回收936bp左右的条带。PCR产物按照胶回收试剂盒的方法进行回收，使用20yL无菌水洗 脱，得到纯化回收的PCR产物。
[0042] 2.2酶切
[0043]将纯化回收的PCR产物使用以下体系进行双酶切，酶切时间lh。酶切体系为:EcoRI 241^，!1;[11(11112以]^，0财〈0.3以8，灭菌的双蒸水加至3(^匕酶切后纯化回收得到经过双酶切的 PCR产物。
[0044]质粒pET_28a( + )的双酶切:挑取含有质粒pET_28a( + )的大肠杆菌DH5a单菌落，过 夜培养。使用质粒提取试剂盒提取质粒，用EcoRI和Hindm按以下体系双酶切，酶切时间1-2h。酶切体系为:EcoRI 2yL，HindIII2yL，质粒DNA〈lyg，灭菌的双蒸水加至20yL。酶切后纯化 回收得到经过双酶切的pET-28a (+)载体。
[0045] 上述双酶切使用的限制性内切酶为Thermo公司生产的快速内切酶，酶切后的纯化 回收使用核酸纯化回收试剂盒(Magen，Hipure Gel Pure DNA Micro Kit)，质粒提取试剂 盒为上海捷瑞生物工程有限公司的质粒小量制备试剂盒，操作方法按其使用说明书。
[0046] 2.3连接
[0047]将经过双酶切的PCR产物和pET_28a( + )载体按照3:1的摩尔比例进行连接。连接使 用的T4连接酶购自北京全式金生物技术有限公司，连接使用的酶量为5U/5yL连接体系，连 接温度为22°C，连接时间30min。
[0048] 2.4转化及筛选
[0049] 取5yL连接产物于50yL大肠杆菌DH5a感受态细胞中，冰浴30min，后于42°C水浴锅 热激90s，冰浴2min后加入500yL LB液体培养基，37°C200rpm转速下，孵育培养lh。取一定量 的菌液涂布于含100yL/mL卡那霉素的LB平板，培养20h后挑选单菌落。单菌落于5mL LB培养 基中过夜培养后提取质粒，进行双酶切验证，酶切片段与基因大小相同的即为阳性克隆。
[0050] 2.5基因核苷酸序列测定
[0051] 将筛选的正确阳性克隆送至上海美吉生物医药有限公司进行测序，测序结果与酯 酶基因 WDEst9核苷酸序列进行比对，确认是将酯酶基因 WDEst9(其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示）插入到pET-28a( + )质粒中，结果完全正确后确认得到带有酯酶基因 WDEst9的 pET-28a( + )质粒(命名为pET-28a( + )-WDEst9)，可用于进行下一步试验。
[0052] 实施例3:酯酶基因 WDEst9在大肠杆菌BL21 (DE3)中的高效表达 [0053] 3.1大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞制备
[0054] 1、将少量大肠杆菌BL21(DE3)菌种接入5mL LB试管液中，37°C过夜摇培，250rpm;
[0055] 2、按1 %体积比的接种量将过夜摇培后的大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种到300ml LB摇瓶中，37°C摇培3-4h(彡300rpm)，得到原培养物；
[0056] 3、将培养好的摇瓶在冰水中迅速冷却至0°C，将原培养物分装至冰预冷的离心管 (50mL)，冰置数分钟；
[0057] 4、4°C，4000rpm离心10min回收细胞，去上清；
[0058] 5、用冰预冷的10mL 0.1M的CaCl2重悬细胞，4°C、4000rpm离心10min回收细胞；
[0059] 6、重复5,用10mL 0.1M的CaCl2重悬细胞，冰浴lh以上；
[0060] 7、4°C，4000rpm 离心 lOmin回收细胞；
[0061 ] 8、每50mL原培养物得到的细胞用2mL含体积分数15%DMS0的0.1M CaCl2来重悬， 分装于1.5mL离心管，1 OOyL每管，-80 °C保藏。由此得到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞。
[0062] 3.2转化
[0063] 取实施例2中得到的pET-28a( + )-WDEst9质粒0.5~lyL与50yL大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞混合，冰浴30min，于42°C水浴锅热激45s，冰浴2min后加入500yL LB液体培养 基，37°C200rpm培养lh。培养物离心后涂布50yL/mL的卡那霉素 LB平板，培养过15h后挑选单 菌。由此得到含有pET-28a(+) -WDEst9的大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0064] 实施例4:酯酶WDEst9的表达和纯化
[0065] 4.1蛋白诱导
[0066] 含有pET-28a( + )-WDEst9的大肠杆菌BL21(DE3)在LB培养基中37°C培养至OD6〇〇为 0.5左右，加 IPTG至终浓度0.2mM，20 °C培养20个小时。300mL菌液4000rpm，4°C离心10min，收 集菌体，用PBS缓冲液洗涤菌体2次，4000rpm，lOmin收集菌体。用30mL(50mM，pH 7.5)PBS缓 冲液重悬菌体，超声400w，超4s，停6s，破碎10min，4°C、10000rmp离心20min，收集上清。
[0067] 4·2酯酶WDEst9的纯化
[0068] 用镍离子亲和层析柱对步骤4.1中收集的上清进行纯化得纯化的酯酶WDEst9(图 8 )，纯化的蛋白大小约33kD，符合理论预期。具体实施方案如下:使用1 OmM的咪唑洗脱5个柱 体积，30mM咪唑洗脱30个柱体积，最后使用100~lOOOmM咪唑洗脱5个柱体积，收集中间 3.5mL。用脱盐柱S印hadexG25进行脱盐，具体操作方法参照GE公司的操作手册进行。
[0069] 4·3酯酶WDEst9酶活测定
[0070]酯酶WDEst9活力测定采用对硝基苯酚酯，具体方法如下：①配制10mM的对硝基苯 酚酯；②在lmL反应体系中加入940yL Tris-HCl buffer(50mM，pH 8.0)，40yL乙醇，10yL浓 度为0.40~0.86mg/mL酯酶WDEst9纯酶液;③于35°C下，3~5min后，410nm测定吸光度。
[0071 ]酶活单位定义：lmin内水解对硝基苯酸酯，释放Ιμπιο?对硝基苯酸所需的酶量定义 为一个酶活单位。
[0072] 实施例5:酯酶WDEst9的酶学性质
[0073] 5.1水解不同长度的对硝基苯酚酯
[0074] 按照4.3的测定条件，比较酯酶WDEst9作用不同长度的对硝基苯酚酯，结果如图1， 说明酯酶WDEst9对长链对硝基苯酚酯基本上没有水解活性，而对于短链对硝基苯酚酯的作 用效果较好，最佳的底物是C4，即对硝基苯酚丁酸酯。
[0075] 5.2最适pH和pH稳定性
[0076]配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表2所示，其浓度均为50mM: [0077]表2不同缓冲体系的pH
[0078]
[0079]
[0080] 将4.3中测定条件所述的缓冲液(Tris-HCl buffer)按照表2中的缓冲溶液分别进 行替换，底物为对硝基苯酚丁酸酯，测定不同pH的缓冲溶液对酯酶WDEst9的酶活力的影响， 结果说明酯酶WDEst9酶活在Tris/HCl缓冲溶液pH为8.0时活性最高（图2A)，PH高于8.0、小 于8.0活性都会急剧下降。
[0081 ] 酯酶WDEst9在不同pH的缓冲液中4 °C处理12h，然后按4.3中测定条件（以对硝基苯 酚丁酸酯作为底物)测定酯酶酶活，从图中可以看出，酯酶WDEst9在4°C处理12h后，其酶活 性基本没变，说明酯酶WDEst9可以长时间在不同的pH条件下保持较高酶活，其对pH的耐受 性较强（图2B)。
[0082] 5.3最适温度和温度稳定性
[0083]用pH 8.0、50mM Tris/HCl作为缓冲溶液，按4.3中的反应混合液（以对硝基苯酚丁 酸酯作为底物)置于不同的温度(20~50°C)下处理lh后，加入等量的酯酶WDEst9,在各自的 温度下反应1~5min，405nm测定酶活。结果说明，酯酶WDEst9最适反应温度在30°C(图3A)。
[0084] 将酯酶WDEst9在20~50°C经不同时间预处理，于30°C，pH 8.0、50mM Tris/HCl的 缓冲溶液中，按4.3测定方法（以对硝基苯酚丁酸酯作为底物)测定酯酶WDEst9酶活。结果说 明，酯酶WDEst9在20°C_30°C的稳定性最好，随着温度升高，稳定性逐渐降低，50°C处理 60min后酶活残余约20% (图3B)。
[0085] 5 · 4NaCl (KC1)浓度对WDEst9酶活性的影响
[0086] 将酯酶WDEst9分别加入到含有不同浓度NaCl和KCl，pH8.0、50mM Tris/HCl的缓冲 溶液中，按4.3测定方法（以对硝基苯酚丁酸酯作为底物）在各自的温度下反应1~5min， 405nm测定酶活。结果说明，0-1.5M的NaCl和0-2M的KC1都会促进酯酶WDEst9的酶活，当NaCl 和KC1浓度为1M时，酯酶WDEst9酶活力残余最高，分别为159.91 ±2.15 %和156.23 土 3.45%。当NaCl和KCl浓度升到4M时，酯酶WDESt9酶活力残余仍大于30%(图4)。说明酯酶 WDEst9是耐钠盐和钾盐的酯酶。
[0087] 5.5金属离子抑制
[0088]以50mM、pH8.0的Tris/HCl为溶剂配制不同金属离子溶液，每种金属离子浓度均为 ImM，将酯酶WDEst9酶液在各种金属离子溶液中4°C下处理12h;以不加金属离子的50mM、 pH8.0的Tris/HCl溶液为对照(Control)。再按照4.3中的测定方法（以对硝基苯酸丁酸酯作 为底物)测定酶活，结果见表3,大部分已测得金属离子都能不同程度的促进酯酶WDEst9的 水解活性，尤其是 Na+、K+和 Mg2+，酶活分别为 159.91±2.15%、156.23±3.45%和121.44± 6.23%〇
[0089] 表3金属离子对酯酶WDEst9酶活力的影响
[0090]
[0091]
[0092] 5.6有机溶剂、变性剂和抑制剂对酯酶WDEst9酶活性的影响
[0093] 将酯酶WDEst9加入到表4中的有机溶剂、变性剂和抑制剂中处理12h(对照为蒸馏 水，其他处理溶液的浓度为体积分数5%或质量分数0.1%)，然后按照4.3的测定方法（以对 硝基苯酚丁酸酯作为底物)测定酶活。结果表明有机溶剂环己烷、正辛烷、正癸烷和DMS0(二 甲基亚砜)能促进酯酶WDEst9酶活，最高达到145.27±8.8(%);表面活性剂三聚磷酸钠对 酯酶WDEst9的酶活具有促进作用。
[0094] 表4有机溶剂、变性剂和抑制剂对酯酶WDEst9酶活性的影响
[0095]
[0096]实施例6:酯酶WDEst9在拆分（± )-2-氯丙酸甲酯、（± )-2-氯丙酸乙酯和（± )-乳 酸甲酯中的应用
[0097]本法在水相中拆分（± )-2_氯丙酸甲酯、（± )-2_氯丙酸乙酯和（± )_乳酸甲酯。 [0098] 1)在优化的条件下，即在0.5ml 50mM、pH7.5的PBS缓冲溶液中，加入5mg的酯酶 WDEst9粗酶粉，于30 °C，200rpm条件下，拆分30mM的（± )-2-氯丙酸甲酯，在2h内可得到99 % 光学纯度的（S)-2-氯丙酸甲酯，产物产率为82.56% (图5)。
[0099] 2)在优化的条件下，即在0.5ml 50mM、pH8.0的Tris/HCl缓冲溶液中，加入5mg的酯 酶WDEst9粗酶粉，于30°C，200rpm条件下，拆分20mM的（± )-2-氯丙酸乙酯，在2h内可得到 99%光学纯度的（S)-2-氯丙酸乙酯，产物产率为87.65% (图6)。
[0100] 3)在优化的条件下，即在0.5mL 50mM、pH8.5的Tris/HCl缓冲溶液中，加入5mg的酯 酶WDEst9粗酶粉，于30°C，200rpm条件下，拆分15mM的（± )-乳酸甲酯，在1. Oh内可得到大于 99 %光学纯度的(L)-乳酸甲酯，产物产率为86.75 % (图7)。
[0101]具体分析条件为：采用福立气相色谱仪，配有手性柱（30mX0.25mm Cyclosil B chir 1 column)和氢离子火焰检测器。仪器分析条件设置为:注射器温度220°C，检测器温度 250°C，载气为N2，流速1.2mL/min，采用梯度升温进行分析:80°C保持lmin，15°C/min，120°C 保持lmin，10°C/min到220°C，保持lmin。
【主权项】
1. 一种酯酶WDEst9，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。2. -种编码权利要求1所述的酯酶WDEst9的酯酶基因 WDEst9。3. 根据权利要求2所述的酯酶基因 WDEst9,其特征在于，所述的酯酶基因 WDEst9的核苷 酸序列如SEQ ID N0.1所示。4. 权利要求1所述的酯酶WDEst9在拆分（±)-2_氯丙酸甲酯制备得到（S)-2-氯丙酸甲 酯中的应用。5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，取酯酶WDEst9于pH为6.0-10.0的缓冲液 中，再加入（±)-2_氯丙酸甲酯，进行反应，得到(S)-2-氯丙酸甲酯。6. 权利要求1所述的酯酶WDEst9在拆分（±)-2_氯丙酸乙酯制备得到（S)-2-氯丙酸乙 酯中的应用。7. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，取酯酶WDEst9于pH为6.0-10.0的缓冲液 中，再加入（±)-2_氯丙酸乙酯，进行反应，得到(S)-2-氯丙酸乙酯。8. 权利要求1所述的酯酶WDEst9在拆分（±)_乳酸甲酯制备得到（L)-乳酸甲酯中的应 用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，取酯酶WDEst9于pH为6.0-10.0的缓冲液 中，再加入（± )-乳酸甲酯，进行反应，得到(L)-乳酸甲酯。10. 权利要求1所述的酯酶WDEst9在耐受似+、1(+、1%2+、环己烷、正辛烷、正癸烷、二甲基亚 砜或三聚磷酸钠环境下进行催化的应用。
【文档编号】C12N15/70GK106085985SQ201610604881
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月27日 公开号201610604881.7, CN 106085985 A, CN 106085985A, CN 201610604881, CN-A-106085985, CN106085985 A, CN106085985A, CN201610604881, CN201610604881.7
【发明人】胡云峰, 王依龙, 徐珊, 李任强, 张云, 孙爱君
【申请人】中国科学院南海海洋研究所