多肽，分离的其多核苷酸，以及包含多肽的添加剂、其用途及方法

多肽，分离的其多核苷酸，以及包含多肽的添加剂、其用途及方法
【专利摘要】以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其是具有选自SEQ ID No.1?15的氨基酸序列或其功能性变体的水解酶，其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少40％；以及包含所述多肽的添加剂；以及编码所述多肽的分离的多核苷酸；以及用于用所述多肽来以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的方法。
【专利说明】多肽，分离的其多核苷酸，以及包含多肽的添加剂、其用途及 方法
[00011 本申请是申请日为2014年8月27日、申请号为201480055221.7、发明名称为"用于 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，分离的其多核苷酸，以及 包含多肽的添加剂、其用途及方法"的发明专利申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生 物的多肽，编码此类多肽的分离的多核苷酸，以及包含此类多肽的添加剂，还涉及此类多肽 的用途，以及涉及用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物 的方法。
[0003] 真菌毒素是丝状真菌产生的次生代谢物。其一个重要的代表是世界范围传播的玉 米赤霉烯酮(ZEN)(以前称为F-2毒素），其由许多镰孢菌真菌产生。这些真菌尤其侵染栽培 植物，例如各种各样的谷类，其中真菌侵染通常出现在收获之前，其中真菌生长或真菌毒素 产生可以在收获之前发生，或者在不适当的贮藏的情况下也可以在收获之后发生。FA0估 计，在世界范围内25%的农产品被真菌毒素污染，这导致巨大的经济损失。在一项最近在世 界范围内进行的研究中，从2009年1月至2011年12月分析了总共23，781个样品，其中81 %经 测试为对于至少一种真菌毒素来说阳性和45%对于ZEN来说阳性。可以在世界的所有地区 中，同样地在所有经测试的谷物类别和饲料类别，例如玉米、大豆粉、小麦、麦麸、DDGS(干酒 糟）中，以及在预制饲料混合物中，以直至100%的频率发现ZEN。
[0004] ZEN是一种非甾类的、雌激素的、大环的、通过聚酮化合物物质代谢途径合成的内 酯，其具有下述结构式：
[0005]
[0006] 和IUPAC命名名称"(2E，llS)-15，17-二羟基-ll-甲基-12-氧杂双环[12·4·0]十八 碳-1(18)，2,14,16-四烯-7,13-二酮"。
[0007] 然而，在自然界中还存在有许多ZEN衍生物，其通过ZEN的酶促或化学修饰而形成。 关于此的例子为糖苷式的或含硫酸酯的ZEN缀合物，其由真菌、植物或哺乳动物代谢来形 成；以及ZEN代谢物，其尤其在人或动物机体中形成。在下文中，ZEN衍生物是指在自然界中 存在的或者通过化学或生物化学合成而制备的ZEN缀合物或ZEN代谢物，但特别地是指α-玉 米赤霉烯醇(α-ZEL ;(2E，7R，llS)-7，15，17-三羟基-ll-甲基-12-氧杂双环[12·4·0]十八 碳-l(18)，2，14，16-四烯-13-酮）、β-玉米赤霉烯醇(β-ZEL ;(2E，7S，llS)-7，15，17-三羟基-ll-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-l(18)，2，14，16-四烯-13-酮）、a-玉米赤霉醇( a-2八1^(71?，113)-7，15，17-三羟基-11-甲基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18)，14，16-三 烯-13-酮）、β-玉米赤霉醇（0-241^(73，113)-7，15，17-三羟基-11-甲基-12-氧杂双环 [12.4.0]十八碳-l(14)，15，17-三烯-13-酮）、玉米赤霉烯酮-14-硫酸酯(Z14S;[(2E，llS)- 15-羟基-11-甲基-7,13-二氧代-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18),2,14,16-四烯-17-基]硫酸氢酯）、玉米赤霉烯酮-14-糖苷(Z14G;(2E，11S)-15-羟基-11-甲基-17-[(3R，4S， 53,610-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基）四氢吡喃-2-基]氧基-12-氧杂双环[12.4.0]十八碳-1 (18)，2，14，16-四烯-7，13-二酮）以及玉米赤霉酮(2厶1(113)-15，17-二羟基-11-甲基-12_ 氧杂双环[12.4.0]十八碳-1(18)，14,16-三烯-7,13-二酮）。
[0008] ZEN，同样地还有ZEN衍生物，尤其是α-ZEL、β-ZEL、Z14S、α-ZAL、β-ZAL、Z14G和ZAN， 由于其高的化学和物理稳定性而还可以在经加工的食品或饲料例如面包或啤酒中检测到。
[0009] ZEN与雌激素受体结合并且可以引起激素紊乱，其中它在经口摄取后立即被吸收， 并且被哺乳动物转变为两个立体异构的代谢物，分别为a-ZEL和β-ZEL。在此，例如a-ZEL，还 有a-ZAL或ZAN具有比ZEN强得多的动情效应。经缀合的ZEN衍生物有时具有比ZEN低的雌激 素活性，然而如果情况可能，ZEN可以从这些ZEN衍生物中重新被释放到消化道中。
[0010]虽然ZEN具有相对低的急性毒性并且具有直至20，000mg/kg体重的口服LD50值，但 是在较长期摄入的情况下在动物或人中出现亚急性和/或亚慢性的毒性效应，例如致畸形 的、致癌的、动情的和免疫抑制的效应。被ZEN污染的饲料导致哺乳动物中的发育障碍，其中 猪，特别是幼猪对于ZEN是极其敏感的。超过0.5ppm的在饲料中的ZEN浓度导致发育障碍，其 中例如超过1.5ppm的浓度可以导致猪中的超雌激素活性，和12ppm ZEN的浓度被认为对牛 中的流产负责。由于玉米赤霉烯酮通过粘膜，特别是通过胃粘膜，但也通过口腔粘膜被迅速 吸收，因此立即的和尤其是定量的钝化是必要的。在ZEN的口服给药后30分钟已经可以在血 液中检测到它们。在这种情况下，使用经分离的针对微生物的酶具有优点，例如更高的比活 性或更快的作用。由于ZEN的有害效应，因而在欧盟存在有在食品中的强制性的ZEN上限以 及对于在饲料中的ZEN上限的推荐(EC N0:1881/2006)。
[0011] 为了减少食品或饲料的ZEN污染的最初策略是限制真菌生长，例如通过遵循"良好 的农业实践经验"。这尤其包括，种子没有害虫和真菌侵染，或者及时从田地中移除农业废 料。此外，还可以通过使用杀真菌剂来减少田地上的真菌生长。在收获之后，应当将收获物 储藏在低于15%的残留水分含量和低的温度下，以阻止真菌生长。同样地，应当在再加工之 前去除由于真菌侵染而被污染的物料。尽管有着这一系列措施，但I .Rodriges和K.Naehrer (2012)仍然报道了，即使在具有最高农业标准的地区，例如USA和中欧，在2009年至2011年 中，分别有29 %和39 %的经测试的玉米样品被ZEN污染。
[0012] 用于从饲料或食品中去除ZEN的其他可能性为真菌毒素的吸附或转化。为此所必 需的是，真菌毒素与吸附剂的结合在宽的pH范围内是强的且特异的，并且在胃肠区域内的 整个消化过程中保持稳定。虽然对于黄曲霉毒素可以有效地使用几种非生物吸附剂，例如 活性炭、硅酸盐或合成的聚合物，例如消胆胺，但是它们用于其他真菌毒素则受到限制。吸 附剂的主要缺点是其他有时候对于营养供给来说必需的分子的非特异性结合。在文献中 同样也描述了生物吸附剂，例如酵母或酵母提取物，然而生物吸附剂像非生物吸附剂一样 也具有类似的限制。
[0013] 通过物理和化学处理来对ZEN进行解毒也受到限制。通过热处理，不能有效地使 ZEN钝化，但是可以通过挤出和用氧化剂进行处理，例如在80 °C下用10 %的过氧化氢溶液处 理16小时，来使ZEN含量降低83.9%。在饲料和食品的制备中挤出方法和氧化剂例如臭氧或 过氧化氢的使用，由于高的成本、品质损失、有时候低的效率和低的特异性而受限。
[0014] 借助于微生物例如·真菌毒素丝抱酵母(Trichosporon mycotoxinivorans)、粉 红粘帚霉(Gliocladium roseum)或枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)菌株或者从其中分 离出的酶例如水解酶或过氧化物酶来进行ZEN的生物转化也例如在E.Vekiru等人， Appl.and Environ.Microb.，2010,76,7,2353-2359中进行了描述。
[0015] 从EP 0 938 575 B1中知晓了红球菌属（Rhodococcus)和诺卡氏菌属(Nocardia) 的细菌，特别是球状红球菌(R. globerulus)、红串红球菌(R. erythropolis)和球形诺卡氏 菌(N · g 1 ob eru 1 a)的ZEN降解特性。
[0016] 从W0 02/076205中可获知从粉红粘帚霉中分离出的酶的ZEN降解作用，所述酶尤 其为α/β_水解酶、玉米赤霉烯酮水解酶1(ZHD1)，其借助于催化三元体来催化ZEN的降解。 [0017] 从W0 2012/113827中获知重组Zonase，即ZEN降解酶，其在胃肠道中保持稳定，特 别地在其中描述了微生物例如褐色双歧嗜热菌（Thermobifidia fusca)、脱叶链霉菌 (Streptomyces exfoliatus)、德氏食酸菌（Acidovorans delaf ieldii)和链霉菌属物种 (Streptomyces sp.)〇
[0018] 能够水解ZEN和/或至少一种ZEN衍生物的多肽或酶也可以称为Zonase。
[0019] 下面所使用的术语取自专业用语并且总是以传统的意义进行使用，除非另外指 出。因此，术语"多核苷酸"涉及具有所有长度和序列的每一种类型的遗传物质，例如单链 和双链DNA和RNA分子，包括调控元件、结构元件、基因群、质粒、全基因组及其片段。名称"多 肽"包括蛋白质，例如酶、抗体，以及具有直至500个氨基酸的多肽，例如肽抑制剂，蛋白质的 结构域，还有具有小的序列长度例如少于10个氨基酸的短多肽，例如受体、配体、肽激素、标 签等。名称"在多核苷酸或多肽中的'位置'"涉及在所述多核苷酸或多肽的序列中单个特定 的碱基或氨基酸。
[0020] 现在，本发明旨在提供这样的多肽以供使用，用所述多肽可成功实现将ZEN和/或 至少一种ZEN衍生物快速地且可靠地转化为经水解的ZEN和/或经水解的ZEN衍生物。为了解 决该任务，本发明的特征主要在于，所述多肽是具有选自SEQ ID No.1-15的氨基酸序列或 其功能性变体的水解酶，其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同 一 1性为至少40%。
[0021] 根据本发明，名称"序列同一性"涉及序列同一性百分比。对于氨基酸序列和核苷 酸序列，序列同一性可以目视测定，但是优选地用计算机程序来计算出来。还在序列区段内 进行序列比较，其中参考序列的连续序列被理解为区段，并且优选地包含该序列的保守区 域。
[0022] 在当前的情况下，序列同一性借助于程序NCBI BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)来进行测定，特别地对于多肽，用BLASTP，和对于多核苷酸，用BLASTN，其提供 在 "National Center for Biotechnology Information" 的主页（NCBI ; http :// www·ncbi ·nlm.nih.gov/)上以供使用。因此，可能的是，根据Altschul等人，1997(Nucleic Acids Res. ,25:3389-3402)的算法，将两个或更多个序列互相进行比较。为了本发明的目 的，使用2013年5月15日的那个版本的程序。作为程序设置，考虑基本设置，但是特别地，对 于氨基酸序列比较："最大革G序列（max target sequence)" = 100 ; "期望阈值（expected threshold)" = 10; "字长(word size)" = 3; "矩阵（matrix)" = BL0S0M62; "缺口成本（gap costs)" = "存在（Existence) :11;延伸（Extention):l" ； "计算调整（computational adjustment)" = "条件式组成得分矩阵调整（Conditional compositional score matrix adjustment)" ；以及对于核苷酸序列比较:字长：11;期望值(Expect value): 10;缺口成本： 存在=5,延伸=2;过滤器(Filter)=低复杂度激活的（low complexity activated);匹 配/错配得分(Match/Mismatch Scores) :2，_3;过滤器字符串（Filter String) :L;m。
[0023]术语"功能性多肽变体"或"功能性变体" 一方面涉及多肽的"等位基因变体"和多 肽的"功能性片段"，另一方面涉及多肽的"修饰"，其中酶促功能基本上未改变。名称"等位 基因变体"涉及这样的多肽，所述多肽通过在自然界中随机发生的核苷酸序列突变而产生 并且引起氨基酸序列的改变，其中其酶促功能未受影响。"修饰"可以例如是与多肽的C-末 端或N-末端融合物或者经突变的多肽，其中突变可以通过至少一个氨基酸的置换、插入或 缺失来获得，这特别地通过位点特异性诱变或随机诱变、重组和/或任何其他蛋白质工程方 法来进行。术语"置换"、"插入"和"缺失"以在基因技术中通常的和专业人员熟悉的含义来 进行使用。术语"功能性片段"涉及多肽的部分或部分序列或者其功能性变体的部分或部分 序列，其中酶促功能基本上得到保留。当酶促反应机制保持不变，即在相同的位置处水解该 真菌毒素，并且"功能性变体"相对于原始多肽而言的比残余活性为至少5%，优选地至少 10%，特别地至少50%时，那么基本上保留了酶促功能。具有有着SEQ ID No. 1-15的氨基酸 序列的多肽是另一个或者同一个酶的功能性等位基因变体，其中所述序列各自来源于不同 的微生物。这从下列中可清楚地看出来:借助于序列同一性百分比而测量出的接近的相互 亲缘关系，以及这样的事实，即所有多肽通过相同的降解机制作用于ZEN和ZEN衍生物。 [0024]由于具有SEQ ID No.1-15的多肽的氨基酸序列相互间的相似性，因而可能的是， 这些多肽之一的功能性变体与多于一个所要求保护的具有SEQ ID No. 1-15的多肽具有至 少40 %的序列同一性。
[0025]通过选择此类氨基酸序列或其功能性变体，查明了令人惊讶地快速且完全的ZEN 和/或至少一种ZEN衍生物的水解。
[0026]如相应于本发明的一个优选的进一步发展方案那样，所述多肽具有这样的氨基酸 序列，其包含至少一个保守氨基酸序列区段或其功能性变体，其中所述氨基酸序列区段的 功能性变体具有至少70%，优选地至少84%，更优选地至少92%，和最优选地至少98%的序 列同一性，并且所述至少一个保守氨基酸序列区段选自具有SEQ ID No. 1的序列的氨基酸 序列+24 至+50、+52至+77、+79至+87、+89至+145、+ 150至+171、+ 177至+193、+223至+228、+ 230 至+237、+239 至+247、+249 至+255、+257 至+261、+263至+270、+272至+279、+297至+301、+ 303至+313、+24至328、+1至+328。通过至少一个此类保守氨基酸序列区段的存在，可成功提 供这样的多肽以供使用，所述多肽除了 ZEN和/或至少一种ZEN衍生物的快速且完全的水解 外，还具有相比于迄今已知的ZEN降解多肽而言特别高的活性值。
[0027]当如相应于本发明的一个进一步改造方案那样，所述功能性变体具有至少一个选 自一个或多个氨基酸的置换、缺失和插入的氨基酸修饰时，依然可以取得良好的结果。 [0028] 通过如此地进一步改造本发明，即使得所述多肽具有至少0.01U/mg，优选地至少 0.1U/mg，特别地至少lU/mg的比活性，和/或具有最高50μΜ，优选地最高3.5μΜ，特别地最 高0.5μΜ的以水解方式裂解ΖΕΝ的Km值，和/或具有至少0.058+ 1，优选地至少0.，特别地 至少的以水解方式裂解ZEN的1^*值，和/或具有至少Ο.ΟΟΟΟΙμΜ^ΕΓ 1，优选地至少 0.0001μΜ-1，特别地至少〇. 〇〇1μΜ-1的以水解方式裂解ΖΕΝ的vmax值，ΖΕΝ和/或ΖΕΝ衍生 物可以被特别快速且完全地水解，特别是解毒。
[0029] 如相应于本发明的一个优选的进一步发展方案那样，所述多肽包含选自SEQ ID No. 2、5-7、9、11、12和15的氨基酸序列或其功能性变体，其中所述功能性变体与至少一个所 述氨基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在pH 5.0下的pH稳定性为至少 15%，优选地50%，和特别优选地至少90%。通过这样的进一步发展方案可以确保，所述多 肽在酸性介质中，因此例如在哺乳动物的胃中的情况下，也将玉米赤霉烯酮和/或至少一种 玉米赤霉烯酮衍生物裂解或解毒。在此，将多肽的pH稳定性定义为所述多肽在pH 5.0下的 残余活性百分比，相对于在各自最佳pH下的活性而言。
[0030] 如相应于本发明的一个优选的进一步发展方案那样，所述多肽包含选自SEQ ID No.l、2、5-7、9、ll和15的氨基酸序列或其功能性变体，其中所述功能性变体与至少一个所 述氨基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在30 °C和75°C之间，优选地38°C 和55°C之间，特别优选地38°C和52 °C之间的温度范围内具有最高的酶促活性。通过这样的 本发明的进一步发展方案确保了，玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物在中 温温度下，特别是在人和有用动物的体温下，也被所述多肽水解或解毒。将所述多肽具有最 高酶促活性时所处的温度定义为所述多肽的最佳温度。
[0031 ]如相应于本发明的一个优选的进一步发展方案那样，所述多肽包含选自SEQ ID No. 1、5、6、9、11、12和15的氨基酸序列或其功能性变体，其中所述功能性变体与至少一个所 述氨基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽是温度稳定的，直至90°C，优选地 75°C，和特别优选地60°C的温度。由此确保了，所述多肽和其酶促功能即使在提高的温度负 荷下(例如这可以是在容器中进行运输期间或在饲料粒化期间的情况)也基本上保持完整。 多肽的温度稳定性被定义为这样的温度，在该温度下所述多肽在15分钟的预温育后具有 50 %的残余活性，相比于在各自最佳温度下的活性而言。
[0032]因此，所述多肽可以如此地来进行选择，从而它是对于不依赖于氧和无辅因子地 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或ZEN衍生物的酯基团来说合适的α/β-水解酶，其具有催 化所述水解式裂解的氨基酸三元体，该三元体由丝氨酸，一种选自谷氨酸和天冬氨酸的酸 性氨基酸，特别是天冬氨酸，以及组氨酸组成，并且该催化三元体为例如S128、D264和Η303， 其中描述了相对于SEQ ID No. 1的定位。
[0033]用SEQ ID No. 1-15的多肽中的每一个可成功按照下述反应机制在玉米赤霉稀酮 或其衍生物的酯基团处实现ZEN和ZEN衍生物的水解：
[0034]
[0035] ZEN至无毒的经水解的玉米赤霉烯酮(HZEN)或经水解的ZEN衍生物的水解通过根 据本发明的多肽，特别是所述α/β_水解酶来进行。HZEN至经脱羧的经水解的ZEN (DHZEN)或 经脱羧的经水解的ΖΕΝ衍生物的进一步的脱羧通常自发地进行。
[0036]特别地，借助于上面提及的催化三元体，可成功实现完全水解ΖΕΝ和ΖΕΝ衍生物，其 中该降解反应具有良好的pH稳定性，特别是在酸性范围内的pH值下。
[0037] 令人惊讶地已证实，用在由上面提及的催化三元体的丝氨酸之前的3个氨基酸和 之后的3个氨基酸组成的序列区段中包含至少一个选自Y、Q、N、T、K、R、E、D的极性氨基酸和 至少一个选自？、1丄、1、￥^、6、？的非极性氨基酸的多肽，可成功取得依然良好的结果并且 此外还改善至少一个酶动力学参数。
[0038] 在本发明的一个优选的进一步改造方案中，所述多肽在至少一个下列位置处具有 关于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一个突变：22、23、25、26、27、29、31、32、35、37、42、 43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、132、141、 146、148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、196、197、 198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、229、231、 233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、277、280、 281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、319、321、 323、325和326。这些位置得自具有SEQ ID No.l的多肽和与该序列具有高的同一性程度和 特别地有活性的具有SEQ ID No.2-6的多肽之间的序列差异。通过在这些位置中的至少一 个处如此地改变具有SEQ ID No.l的多肽，即在该位置处采用SEQ ID No.2-6的氨基酸变 体，可成功显示，这些位置对于所述多肽的酶动力学参数具有显著的影响，并且此外，SEQ ID No.l与具有高的序列同一性程度的SEQ ID No.2-6的组合导致更高的活性。
[0039]根据本发明的一个进一步改造方案，所述多肽在关于SEQ ID No.l的氨基酸序列 中具有至少一个选自下列的突变:D22A、S23Q、S23L、N25D、I26V、F27Y、F27H、S29P、R31A、 F32Y、R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、S69G、 P72E、V73A、A78S、N80H、F84Y、I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、L132V、 A141S、I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、L170R、 A172G、A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、V197C、 V197R、E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、Q209R、 L210A、L210S、AP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、K222Q、 G229A、A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、S248T、 S248N、S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、E269H、 E269N、L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、I285L、 I286M、R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、D309A、 A311P、A314V、L317F、S319Q、S319P、S319R、S321A、S321T、T323A、P325A、A326P。用这样的多 肽，可成功实现在短的时间内完全水解ZEN，特别是使其解毒，其中所述多肽的比活性为至 少6.00U/mg，优选地至少7.00U/mg，特别地至少8.00U/mg。单位"U"或者"Uni t"是绝对催化 活性的量度，并且通过在32°C下在50mMTris-HCl缓冲液(pH8.2)中水解lμMOlZEN/分钟 来定义，其中"催化活性"是指在确定的反应条件下底物的酶促转化，和"比活性"是指催化 活性与多肽质量浓度(质量/体积单位)之比。
[0040] 通过如此地产生所述多肽，即包含至少一个具有SEQ ID No. 32-50的下列氨基酸 基序，可成功提供这样的多肽以供使用，该多肽具有至少7.00U/mg，优选地至少8.00U/mg的 比活性。令人惊讶地已显示，当包含至少一个具有有着SEQ ID No.51-58的序列的下列氨基 酸基序时，所述多肽的酶促活性更进一步增加，例如相对于包含7个氨基酸的基序而言。当 包含至少一个具有有着SEQ ID No.59-69的序列的下列氨基酸基序时，达到更加高的比活 性。
[0041] 根据本发明的一个进一步改造方案，所述多肽在至少一个位置处包含至少一个保 守氨基酸置换，其中所述保守氨基酸置换选自：G至A;或A至G、S;或V至1、1^^、1\3 ;或1至￥、 L、M;或L至I、M、V;或 Μ至L、I、V;或P至A、S、N;或F至Y、W、H;或Y至F、W、H;或W至Y、F、H;或R 至K、 E、D;或K至R、E、D;或H至Q、N、S;或D或N、E、K、R、Q ;或E至Q、D、K、R、N;或S至T、A;或T至S、V、A; 或C至S、T、A;或N至D、Q、H、S;或Q至E、N、H、K、R的置换。其中名称"保守氨基酸置换"涉及氨基 酸由被专业人员视为保守的（即具有类似的特殊特性的)其他氨基酸来进行的置换。此类特 殊特性为例如氨基酸的大小、极性、疏水性、电荷或PK值。保守突变是指例如将一个酸性氨 基酸置换成另一个酸性氨基酸，将一个碱性氨基酸置换成另一个碱性氨基酸，或者将一个 极性氨基酸置换成另一个极性氨基酸。
[0042] 用这样的保守氨基酸置换，可成功制备出功能性多肽变体，其比活性相比于亲本 多肽而言大约一样强，然而优选地增加了至少0.1U/mg。
[0043] 此外，本发明还旨在，提供分离的多核苷酸以供使用，用所述多核苷酸可成功制备 出用于快速且可靠地以水解方式裂解ZEN和/或至少一种ZEN-衍生物的多肽。
[0044] 为了解决该任务，本发明的特征在于，所述分离的多核苷酸具有编码多肽的核苷 酸序列，其中所述多肽具有水解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的特性； 并且所述核苷酸序列编码至少一种根据权利要求1至11之一的多肽;和/或所述核苷酸序列 与至少一种选自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列具有序列同一性程度，其中所选择的核苷 酸序列为至少40%;和/或所述核苷酸序列在中等严紧条件下与至少一种选自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列杂交，和/或与具有至少200个核苷酸，特别是至少100个核苷酸的其 部分序列杂交，和/或与上述核苷酸序列或其部分序列的互补链杂交。
[0045] 待表达的核苷酸序列，特别是其三联体(密码子），通常随着宿主细胞而变化，从而 密码子偏倚性随着宿主细胞而优化。这导致，具有远低于80 %，还有低于70%或低于60 %的 序列同一性程度的多核苷酸也可以编码同一种多肽。用于确定序列同一性程度的序列比较 还必须在序列区段内进行，其中区段是指参考序列的连续序列。对于核苷酸序列，序列区段 的长度通常为15至600。
[0046] 借助于现有的分离的核苷酸序列或序列区段，可成功产生具有通常至少15、30或 40个核苷酸的长度的核酸探针。借助于此类探针(其通常另外还例如用咕、 3￥、358、生物素或 抗生物素蛋白进行标记)可以通过使用标准方法来鉴定编码具有降解ZEN和/或ZEN衍生物 的作用的多肽的核苷酸序列。作为用于鉴定此类序列的起始材料，可以考虑例如单个微生 物的DNA、RNA或cDNA，基因组DNA文库，或者cDNA文库。
[0047] 对于具有至少100个核苷酸的长度的核苷酸序列或核苷酸探针，中等严紧条件被 定义为在42°C下在包含0.3 %十二烷基硫酸钠（SDS)、200μg/ml经剪切和变性的鲑精DNA和 35% 甲酰胺的配备有5XNaCl的Na-EDTA缓冲液（SSPE，0.9M NaCl，60mM NaH2P〇4,6mM EDTA) 中的预杂交和杂交，随后为标准Southern印迹条件，其中最后将载体材料用2 X的氯化钠-柠檬酸盐缓冲液(SSC，300mM NaCl和30mM柠檬酸三钠，0.2%SDS)在55°C下洗涤15分钟，进 行二次。
[0048] 对于具有15个核苷酸至100个核苷酸的长度的核苷酸序列或核苷酸探针，中等严 紧条件被定义为在由0.9M NaCl、0.09M Tris-HCl pH = 7.6、6mM EDTA、0.5%NP-40、1X Denhardt溶液、ImM焦磷酸钠、ImM磷酸二氢钠、Ο. ImM ATP和0.2mg/ml酵母RNA组成的缓冲液 中的预杂交和杂交，其中在比计算出的解链温度(Tm)低5°C至10°C的温度下进行预杂交和 杂交，其中Tm通过按照Bolton和McCarthy(1962,Proceedings of the National Academy of Sciences USA,48:1390)进行的计算来确定。随后，该试验在标准Southern印迹条件下 继续进行（J · Sambrook，E.F.Fritsch 和 T. Man iati s ,1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor,New York)。最后，将载体材料用包含 0.1 % SDS的6 X SCC缓冲液洗涤15分钟，进行一次;和在各自处于比计算出的Tm低5°C至10°C 的温度下用6 X SSC缓冲液洗涤15分钟，进行两次。
[0049] 此外，本发明还旨在，提供添加剂以供使用，用所述添加剂可成功实现在确定的或 复杂的基质中，例如在饲料或食品中，快速且可靠地以水解方式裂解ZEN和/或至少一种ZEN 衍生物。
[0050] 为了解决该任务，提供了以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉 烯酮衍生物的添加剂以供使用，其中所述添加剂包含至少一种具有选自SEQ ID No. 1-15的 氨基酸序列或其功能性变体的多肽，其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之 间的序列同一性为至少40% ;并且任选地包含助剂。
[00511用这样的添加剂，可成功实现ZEN和/或至少一种ZEN衍生物向经水解的ZEN和/或 经水解的ZEN衍生物的生物化学转化。例如对于在工业过程中ZEN和/或ZEN衍生物的立体选 择性水解，也可以考虑该添加剂。
[0052]在本发明的一个优选的进一步改造方案中，如此地产生所述添加剂，即所述助剂 选自至少一种惰性载体，以及任选地，其他成分，例如维生素和/或矿物质和/或酶和/或其 他用于使真菌毒素解毒的组分。通过使用这样的添加剂，可以例如在饲料或食品中确保，所 任选地包含的ZEN和/或ZEN衍生物的量安全可靠地被水解特别是解毒至如此程度，从而对 于摄取这些饲料或食品的受试者的机体没有有害效应。
[0053] 在这种情况下，根据本发明的多肽也可以存在于酶制剂中，所述酶制剂除了包含 至少一种根据本发明的多肽外，还包含至少一种酶，所述酶例如参与蛋白质的降解，例如蛋 白酶，或者所述酶参与淀粉或纤维或脂肪或糖原的代谢，例如淀粉酶、纤维素酶或葡聚糖 酶，以及例如水解酶、脂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、植酸酶、木聚糖酶和/或其 组合。
[0054] 本发明的其他使用范围为酶制剂，其除了包含至少一种根据本发明的多肽外，还 包含至少一种用于使真菌毒素解毒的组分，例如真菌毒素降解酶，例如黄曲霉毒素氧化酶、 麦角胺水解酶、麦角胺酰胺酶、玉米赤霉烯酮酯酶、玉米赤霉烯酮内酯酶、赭曲毒素酰胺酶、 串珠镰孢菌素羧酸酯酶、串珠镰孢菌素氨基转移酶、氨基多元醇氨基氧化酶、脱氧瓜萎镰菌 醇环氧化物水解酶;和/或至少一种降解真菌毒素的微生物，例如枯草芽孢杆菌;和/或至少 一种结合真菌毒素的组分，例如微生物细胞壁或无机材料例如膨润土。
[0055] 根据本发明的一个特别优选的进一步改造方案，在所述添加剂中，所述多肽以最 高10，000U/g，优选地最高1，000U/g，更优选地最高100U/g，和最优选地最高10U/g的浓度包 含在其中，由此可成功实现将ZEN和/或ZEN衍生物快速地，和特别地在其由消耗了被污染的 饲料或食品的受试者(特别是哺乳动物）的身体吸收之前，已经转变为无毒或低毒的代谢 物，特别是HZEN和DHZEN。
[0056]根据本发明的一个进一步改造方案，所述多肽以经包囊或经包衣的形式存在，其 中对于所述包囊或包衣过程，可以考虑标准方法，例如在W0 92/12645中所描述的那些。通 过所述包囊或包衣过程，可成功实现将所述多肽运输至其使用位点，而没有改变，特别是没 有降解或损害，从而在保护壳溶解(例如在动物的消化道中）之后，所述多肽才开始起作用， 由此在酸性的、富含蛋白酶的和缺氧的介质中也可以达到ZEN和/或ZEN衍生物的更加有针 对性的、快速的和完全的降解。此外，通过所述包囊或包衣过程，还可成功提高在所述添加 剂中所述多肽的温度稳定性。
[0057]此外，本发明还旨在，所述添加剂用于以水解方式裂解在饲料（其特别地用于猪、 家禽和水产养殖）中、在食物中或在干酒糟中的玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮 衍生物的用途。通过根据本发明来使用所述添加剂，可成功实现将在食物或饲料中或者在 干酒糟中所包含的ZEN和/或ZEN衍生物水解或解毒，其中在大约lU/g被污染的饲料或食物 的多肽浓度的情况下已经成功实现了这样的解毒。
[0058]此外，本发明还旨在，提供这样的方法以供使用，用所述方法使得ZEN和/或至少一 种ZEN衍生物的快速且可靠的水解式裂解成为可能。
[0059] 为了解决该任务，如此地来施行所述方法，从而玉米赤霉稀酮和/或至少一种玉米 赤霉烯酮衍生物被具有选自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性变体的多肽水解，其 中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少40%。
[0060] 根据本发明的一个进一步改造方案，如此地来施行所述方法，从而其中在相应于 本发明的添加剂中使用所述多肽。
[0061] 根据一个优选的进一步发展方案，如此地来施行所述方法，从而其中将所述多肽 或添加剂与被玉米赤霉烯酮和/或被至少一种玉米赤霉烯酮衍生物污染的饲料或食物相掺 混，使所述被污染的饲料或食物与湿气相接触，并且所述多肽或添加剂水解在所述被污染 的饲料或食物中所包含的玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物。在湿润的饲 料或食物例如麦芽浆或糊浆的情况下，玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物 的水解在经口摄取之前在该湿润的饲料或食物中发生。通过该方法可以确保，最大程度地 消除玉米赤霉烯酮和玉米赤霉烯酮衍生物对于人和动物的有害效应。在此，湿气是指水或 含水液体的存在，其中例如唾液或其他在消化道中存在的液体也属于该范畴。消化道被定 义为口腔、咽（咽喉）、食管和胃肠道或者其等价物，其中在动物中可以存在不同的名称或者 个别成分可以不存在于动物的消化道中。
[0062] 本发明的方法还可以如此地来施行，从而将所述饲料或食物在经口摄取之前进行 粒化。
[0063]根据本发明的一个进一步改造方案，如此地来施行所述方法，从而至少70%，优选 地至少80 %，特别优选地至少90 %的所述玉米赤霉稀酮和/或至少一种玉米赤霉稀酮衍生 物被水解。由此可以预防在动物或人中的亚急性和/或亚慢性的毒性效应，例如致畸形的、 致癌的、动情的和免疫抑制的效应。
[0064]下面将依据实施例以及附图更详细地阐明本发明。其中：
[0065]图1显示了通过具有SEQ ID No.1的多肽来进行的ZEN的随时间的降解以及代谢物 HZEN和DHZEN的增加，其中在图1A中，所述多肽未加标签，在图1B中，所述多肽具有C-末端6 XHis标签，和在图1C中，所述多肽具有N-末端6XHis标签。
[0066] 图2显示了具有SEQ ID No. 1的多肽的米-曼(Michaelis-Menten)动力学。
[0067] 图3显示了通过经纯化的具有SEQ ID No.l(图3A)、SEQ ID No.2(图3B)、SEQ ID Νο·5(图3C)、SEQ ID Νο·6(图3D)、SEQ ID Νο·7(图3E)、SEQ ID Νο·9(图3F)、SEQ ID No.ll (图3G)、SEQ ID No.12(图3H)和SEQ ID No.15(图31)的多肽来进行的ZEN的随时间的降解 以及代谢物HZEN和DHZEN的增加，其中所有序列均具有C-末端6 X Hi s标签。
[0068]实施例1:编码能够以水解方式裂解ZEN和/或至少一种ZEN衍生物的多肽的多核苷 酸的修饰、克隆和表达
[0069] 按照说明书，使用"Quick-change Site-directed Mutagenesis Kits" (Stratagene)，借助于PCR，通过核苷酸序列的突变来进行氨基酸置换、插入或缺失。备选 地，为此还购进了完整的核苷酸序列(GeneArt)。借助于PCR诱变而产生的或从GeneArt购进 的核苷酸序列在氨基酸水平上可选地另外还包含C-末端或N-末端6 X His标签，并且借助 于标准方法将其整合到用于在大肠杆菌(E. col i)或巴斯德毕赤酵母(P. pastor is)中进行 表达的表达载体之中，转化到大肠杆菌或巴斯德毕赤酵母中，以及在大肠杆菌或巴斯德毕 赤酵母中进行表达（J.M.Cregg，Pichia Protocols,第二版，ISBN-10:1588294293、2007; J · Sambrook等人，2012，Molecular Cloning, A Laboratory Manual，第4版，Cold Spring Harbor)，其中也可以为该任务考虑任何其他合适的宿主细胞。
[0070] 名称"表达载体"涉及能够在体内或在体外表达基因的DNA构建体。特别地，该名称 涵盖这样的DNA构建体，其适合于将编码所述多肽的核苷酸序列转移到宿主细胞中，以便在 那里整合到基因组中或者游离地存在于染色体外空间中，并且在细胞内表达编码所述多肽 的核苷酸序列和任选地从细胞中提取出所述多肽。
[0071] 名称"宿主细胞"涉及所有这样的细胞，其要么包含待表达的核苷酸序列，要么包 含表达载体，并且能够制备根据本发明的多肽。特别地，该名称涵盖原核细胞和/或真核细 胞，优选地巴斯德毕赤酵母，大肠杆菌，枯草芽孢杆菌，链霉菌属(Streptomyces)，汉逊酵母 属（Hansenula)，木霉属（Trichoderma)，乳杆菌属（Lactobacillus)，曲霉属 (Aspergillus)，植物细胞，和/或芽孢杆菌属(Bacillus)、木霉属或曲霉属的孢子。
[0072] 为了测定多肽的催化特性，在大肠杆菌的情况下考虑可溶的细胞裂解物，或者在 巴斯德毕赤酵母的情况下考虑培养物上清液。为了测定Km值、v max UP比活性，借助于标 准方法以色谱法方式通过镍-Sepharose柱选择性地富集所述多肽。蛋白质浓度的测定借助 于标准方法来进行，要么采用BCA方法(Pierce BCA Protein Assay KitProd#23225)，然而 优选地采用用关于各自蛋白质的比消光系数来实施的光度法，所述比消光系数用在 http: //web · expasy · org/protparam上在线可用的程序 "ProtParam" 来计算（Gasteiger E · 等人，Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server,John M. Walker(编辑）：The Proteomics Protocols Handbook,Humana Press,2005,第571-607 页)。
[0073] 实施例2:序列同一性以及保守氨基酸序列区段的确定
[0074]在具有有着SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列的多肽的总多肽长度上的相互之间的 序列同一性百分比（表1)的确定可以借助于程序BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)，特别是用可以在"国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)" 的主页(NCBI;http: //www.ncbi .nlm.nih. gov/)上使用的BLASTP来进行。因 此，可能的是，根据Altschul等人，1997(Nucleic Acids Res. (1997)25:3389-3402)的算 法，将两个或更多个序列互相进行比较。作为程序设置，考虑基本设置，但是特别地："最大 靶序列" =100; "期望阈值" =10; "字长" =3; "矩阵" =BLOSOM62; "缺□成本"="存在：11; 延伸：Γ ; "计算调整"="条件式组成得分矩阵调整"。
[0075] 为了确定保守氨基酸序列区段，借助于软件⑶BALT(J. S.Papadopoulos和 R.Agarwala,2007,COBALT:constraint-based alignment tool for multiple protein sequences ,Bioinformatics23:1073-79)来调节对准相互之间具有至少70%的序列同一性 的具有SEQ ID No. 1 -6的多肽，其中考虑标准参数，特别是下列参数（"缺口罚分" ：-11，-1; "末端缺口罚分"：-5，-l;"使用RPSBLAST(UseRPSBLAST)" ：on;"BlastE-值"：0·003;"发 现保守列和重新计算（Find Conserved columns and Recompute)" ：on; "使用查询聚族 (use query clusters)''：on; "字长"：4;"可能聚族距离''（may cluster distance) :0·8; "字母表"：常规；"同源性保守设置(Homology conversation setting) :3bits)。该分析的 结果描绘出了保守氨基酸。保守氨基酸序列区段被定义为具有至少5个连续的保守氨基酸 的下列区域：即关于具有SEQ ID No. 1的序列，位置+24至位置+50的区段A、位置+52至位置 +77的区段B、位置+79至位置+87的区段C、位置+89至位置+145的区段D、位置+150至位置+ 171的区段E、位置+177至位置+193的区段F、位置+223至位置+228的区段G、位置+230至位置 +237的区段H、位置+239至位置+247的区段I、位置+249至位置+255的区段J、位置+257至位 置+261的区段K、位置+263至位置+270的区段L、位置+272至位置+279的区段M、位置+297至 位置+301的区段N和位置+303至位置+313的区段0。
[0076]如上面所描述的那样，进行多肽相互之间的以及独个多肽的保守氨基酸序列区段 相对于具有SEQ ID No. 1的序列的保守氨基酸序列区段而言的序列同一性百分比的测定。 结果呈现在表1和2中。
[0077]表1:多肽相互之间的序列同一性百分比。
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
[0082]表2:保守氨基酸序列区段A至0的序列同一性百分比。
[0083]
[0084]
[0085]
[0086]
[0087] 实施例3:通过在细胞裂解物中的多肽来水解ZEN
[0088] 为了测定其将ZEN降解为非毒性或低毒性的代谢物HZEN和DHZEN的能力，如在实 施例1中所描述的那样，在大肠杆菌中制备由具有SEQ ID No. 17的核苷酸序列所编码的具 有SEQ ID No.l的多肽，所述多肽就这样地和以具有C-末端或N-末端6XHis标签的方式来 进行制备。将有着由具有SEQ ID No. 18-31的核苷酸序列所编码的具有SEQ ID No.2-15的 氨基酸序列的多肽仅在C-末端标记上6 X His。各将100ml的具有2.0-2.5的光密度 (0D600nm)的大肠杆菌培养物通过在4°C下离心来进行收获，并且重悬浮在20ml Brunner矿 质培养基(DSMZ微生物培养基编号462,2012)中。通过用弗氏压碎器在20,000psi下处理3次 来将细胞悬浮液裂解。将如此获得的细胞裂解物以1: 1〇、1:100或1:1，〇〇〇的稀释物进行使 用，所述稀释物在包含〇. lmg/ml BSA(牛血清白蛋白）的Brunner矿质培养基中制备。对于 ZEN降解试验，使用9.9ml的包含0. lmg/ml BSA的Brunner矿质培养基、0. lml的经稀释的细 胞裂解物和31μ1的ZEN底物储液。总之，因此将细胞裂解物以1:1，000、1:10,000或1:100， 〇〇〇进行了稀释。2.08mM ΖΕΝ溶液(40体积％的ACN+60体积％的出0)用作ΖΕΝ底物储液。为了 制备该溶液，相应地称量以晶体形式的ZEN(Romer Labs的生物纯标准品，商品编号001109， 纯度为至少98%)并装瓶，并且将其溶解。每个降解批次在25ml玻璃小瓶中进行，并且在25 °C下在以lOOrprn进行摇动的情况下温育总共120小时。在时间点0、0.5、1、2、5、24、47、72和 120小时，各取lml的样品，将多肽在99°C下加热失活10分钟并贮存于-20°C。在样品解冻后， 通过离心分离开不溶性成分。借助于LC/MS/MS来分析ZEN、HZEN和DHZEN。为此，借助于尺寸 为250mmX 3mm和颗粒大小为5μηι的Phenomenex Luna C18(2)柱通过色谱法来将代谢物分 开。具有lml/Ι的甲酸浓度的乙腈-水混合物用作流动相。在270nm下记录UV-信号。电喷雾离 子化(ESI)用作离子化源。借助于QTrap/LC/MS/MS(三重四极，Applied Biosystems)以"增 强模式"来对ZEN、HZEN和DHZEN进行定量。在最迟24小时后，在批料中不再检测到重大量的 ZEN。大部分(超过80 % )的ZEN被转变成HZEN或DHZEN。
[0089] 在图1中看到，示例性地关于经1:10,000稀释的细胞裂解物溶液，对于未加标签的 (图1A)以及对于加有C-末端6 X His标签的（图1B)和加有N-末端6 X His标签的（图1C)具有 SEQ ID No. 1的多肽，ZEN的随时间的降解和HZEN及DHZEN的随时间的增加。从中清楚地显而 易见的是：1.ZEN的转化立即且完全地进行，这是因为在于试验开始后立即抽取的第一个样 品（0小时）中，就已经几乎不再能够检测到ZEN;和2.通过附加 C-末端或N-末端的标签，未出 现值得注意的活性损失。
[0090] 实施例4:通过在细胞裂解物中的多肽来水解ZEN衍生物
[0091]为了测定多肽将除了 ZEN外还有ZEN衍生物转化为非毒性或低毒性的代谢物的能 力，如在实施例3中所描述的那样，以具有C-末端His标签的方式制备具有SEQ ID No. 1-15 的多肽，并且作为在"降解15"中的细胞裂解物，考虑各自的具有有着SEQ ID No. 17-31的序 列的合成核苷酸序列。
[0092]降解试验如在实施例3中所描述的那样来进行，其中每种多肽用选自α-ZEL、β-ZEL、a-ZAL、0-ZAL、Z14G、Z14S和ZAN的每种ZEN衍生物来进行测试。以1:10，000的总稀释度 来使用细胞裂解物。作为底物储液，使用等摩尔的（即2.08mM的）ZEN衍生物溶液，以代替 2 · 08mM ZEN溶液（40体积 ％ 的ACN+60体积 ％ 的出0)。a-ZEL、β-ZEL、a-ZAL、β-ZAL和ZAN从 Sigma购进并且作为关于该分析的标准品来进行使用。按照诸如在P.Krenn等人，2007 (Mykotoxin Research，23，4，180-184)和Μ· Sulyok等人，2007(Anal · Bioanal · Chem. 289， 1505-1523)中所描述的方法，以至少90%的纯度来制备Z14G和Z14S，并且将其作为关于该 分析的标准品来进行使用。与实施例3的另一个差别是，仅取一个样品，即在24小时后。在降 解试验期间ZEN衍生物浓度的降低借助于LC/MS/MS来进行定量。a-ZEL、f3-ZEL、Z14G和Z14S 按照Μ·Sulyok等人（2010,Food Chemistry，119,408-416)的方法来进行测量;a-ZAL、P_ZAL 和ZAN按照P.Songsermaskul等人（2011，J.of Animal Physiol .and Animal Nutr. ,97， 155-161)的方法来进行测量。令人惊讶地表明，在所有降解试验中，在24小时的温育后，仅 仅存在ZEN衍生物的起始量的0%至最大13%。
[0093]实施例5:多肽以及其变体的比活性以及酶动力学参数
[0094]多肽以及其变体的比活性的测定通过光度法来进行，其中所有所使用的多肽具有 C-末端6 XHis标签。多肽或其变体的制备、富集和纯化如在实施例1中所描述的那样来进 行。ZEN至HZEN的降解通过在315nm的波长下吸光度的下降来测量。ZEN和HZEN的摩尔消光系 数[ε ]通过实验来测定，并且为0.00788951^111014011-1和0.0 OSOSSTLymorVm-1。消光系数是 强烈地pH依赖性的，并因此必须总是在精确相同的pH值下，优选地甚至在相同的基质中进 行活性测量。在32°C下，在UV-VIS光度计(Hitachi U-2001)中，在200至2500nm的波长范围 内，在石英比色皿中，在50mM Tris-HCl(pH=8.2)缓冲溶液中进行测量。
[0095] 2.08mM ZEN溶液(40体积％的厶0糾60体积％的出0)用作ZEN底物储液。为了制备该 溶液，相应地称量以晶体形式的ZEN(Romer Labs的生物纯标准品，商品编号001109，纯度为 至少98%)并装瓶，并且将其溶解。用50mM Tris-HCl(pH=8.2)来制备ZEN底物稀释物(0.79 μΜ、1·57μΜ、2·36μΜ、3·14μΜ、4·71μΜ、6·28μΜ、7·85μΜ、9·42μΜ、10·99μΜ、12·56μ 厘、14.134厘、15.714厘、17.284厘、18.85以厘）。将多肽溶液用5〇111]\11^8-!1(：1缓冲液(口!1 = 8.2)稀释至大约70ng/ml的终浓度。将ZEN底物稀释物在水浴中预热至32 °C。
[0096]给100μΙ的各个ZEN底物稀释物掺入0.2μ1的多肽溶液，并且测量吸光度5分钟，其 中测量每个"多肽溶液-ΖΕΝ底物稀释物"组合至少两次。
[0097]通过考虑ΖΕΝ和ΗΖΕΝ的消光系数，经由随时间进程的吸光度的斜率，计算出关于每 个底物浓度的反应速率。
[0098]名称"Km值"或"米-曼常数"涉及用于描述酶亲和力的参数，其具有单位[μΜ]或 [mM]，并且按照H.Bisswang(2002,Enzyme Kinetics, ISBN 3-527-30343-Χ,第 19页）借助于 线性Hane s标绘图来计算，其中为此优选地使用程序S i gmaP 1 〇 t 12.0的函数"酶动力学，单 一底物"。名称"酶反应的催化常数"或"krat值"涉及用于描述多肽或酶的转化速度的参数， 其以[sr 1给出，并且优选地借助于程序SigmaPlot 12.0的函数"酶动力学，单一底物"来计 算。"最大酶速率"或"vmax值"以单位[μΜ/s]或[mM/s]给出，并且类似于Km值，借助于线性 Hanes标绘图来测算，其中为此优选地使用程序SigmaPlotl 2.0的函数"酶动力学，单一底 物"。
[0099] 借助于Vmax和所使用的酶浓度，根据下述公式来计算比活性，
[0100]
[0101] 其中一个单位被定义为在32°C下在50mM Tris-HCl缓冲溶液(pH=8.2)中每分钟 水解 1μπι〇1 ZEN。
[0102] 下面，示例性地对于具有SEQ ID Ν0:1的多肽，列举出关于酶参数KM、vmax、kcat以及 比活性的测定的原始数据。表3显示了在各个ZEN底物浓度下的反应速率，图2显示了各自所 属的米-曼图，和在表4中给出了相应的酶动力学参数。所使用的酶溶液具有68ng/l的浓度。
[0103] 表3:在不同的ZEN浓度下，具有SEQ ID NO: 1的多肽的反应速率。
[0104]
[0105] 表4:具有SEQ ID No. 1的多肽的酶动力学参数。
[0106]
[0107] 所研究的多肽的比活性为：8·25U/mg，对于SEQIDNo·l;10·56U/mg，对于SEQID No.2;8.36U/mg，对于SEQ ID No.3;8.33U/mg，对于SEQ ID No.4;8.56U/mg，对于SEQ ID No.5;9.95U/mg，对于SEQ ID No.6;3.83U/mg，对于SEQ ID No.7;2.57U/mg，对于SEQ ID No.8;4.87U/mg，对于SEQ ID No.9;5.12U/mg，对于SEQ ID No.lO;3.88U/mg，对于SEQ ID No·ll;2·78U/mg，对于SEQIDNo·12;6·43U/mg，对于SEQIDNo·13 ;3·33U/mg，对于SEQID No·14;和7·76U/mg，对于SEQIDNo·15。
[0108]所研究的多肽变体的比活性在表5和表6中列出。
[0109]表5:具有SEQ ID No. 1的多肽的功能性变体的比活性；突变所位于的保守氨基酸 序列区段;和功能性变体相对于具有SEQ ID No.1的亲本序列而言的序列同一性。相对于具 有SEQ ID No. 1的氨基酸序列而言给出了突变的位置。如在实施例2中所描述的那样，借助 于BLAST来测算序列同一性。
[0110]
[0116]
[0117]表6:具有SEQ ID No.2的多肽的功能性变体的比活性。突变的位置是相对于具有 SEQ ID No.2的氨基酸序列而言的。如在实施例2中所描述的那样，借助于BLAST来测算序列 同一性。
[0118]
[0119]实施例6:在被污染的玉米中的ZEN和ZEN衍生物的降解
[0120]为了测定多肽在复杂基质中和在低pH值下降解天然存在的ZEN和ZEN衍生物的能 力，每次给被污染的玉米掺入不同浓度的具有SEQ ID No. 1-6的多肽中的一种，并且追踪 ZEN和ZEN衍生物的降解。
[0121]碾磨被污染的玉米并且将其在降解试验中使用，其中批料由lg经碾磨的被污染的 玉米、8.9ml 100mM乙酸盐缓冲液(pH = 4.0)和0.1ml多肽溶液组成。如在实施例5中所描述 的那样，制备经富集和经纯化的多肽溶液，其中将其稀释至10mU/ml、100mU/ml或l，000mU/ ml的浓度。因此，在批料中以绝对方式使用lmU( = lmU/克玉米）、10mU( = 10mU/克玉米)或 100mU( = 100mU/克玉米）。每个降解批料以25ml来实施制备，并且在37°C下在以lOOrpm进行 摇动的情况下进行温育。在酶添加之前和在1小时的温育后，分别取出lml的样品，将多肽 在99°C下加热失活10分钟，并且将样品贮存于-20°C。在样品解冻后，通过离心分离开不溶 性成分。如在M. Sulyok等人(2007，Anal .Bioanal · Chem.，289，1505-1523)中所描述的那样， 借助于LC/MS/MS来测量ZEN以及ZEN衍生物的浓度。在该玉米中ZEN和ZEN衍生物的含量为： 238ppb，对于ZEN; 15ppb，对于α-ZEL; 23ppb，对于β-ZEL; 32ppb，对于Z14G;和8lppb，对于 Z14S。在表7中呈现了在所述降解试验中ZEN和ZEN衍生物含量下降的百分比。
[0122]表7:不同多肽和多肽量的降解试验的相对于起始含量而言的以百分比表示的ZEN 和ZEN衍生物的减少。
[0123]
[0124] 实施例7:用于以水解方式裂解ZEN和/或ZEN衍生物的包含多肽的添加剂
[0125] 为了制备用于以水解方式裂解ZEN的添加剂，借助于微量过滤和超滤(排阻极限： 10kDa)在标准条件下纯化经由巴斯德毕赤酵母表达的具有SEQ ID No. 1、2、6和13的多肽的 发酵上清液，并且将其浓缩至大约9重量％的干物质浓度。随后，用喷雾干燥器（Bilchi的 Mini B290)同样在标准条件下将该含多肽的溶液进一步加工成干粉末。将这四种粉末相继 地命名为Z1、Z2、Z6和Z13。此外，将Z1、Z2、Z6或Z13与平均粒度为大约Ιμπι的膨润土，以1重 量％的添加剂21、22、26或213和99重量％的膨润土的比例，在向上式摇动器中进行混合。将 如此获得的添加剂命名为添加剂21上、22.8、26上和213.8。此外，将21、22、26和213与膨润 土和维生素-微量元素浓缩物，以0.1重量％的21、Ζ2、Ζ6或Ζ13，0.9重量％的维生素-微量元 素浓缩物，和99重量％的膨润土的比例，在向上式摇动器中进行混合。将如此获得的添加剂 命名为添加剂 21.8￥5、22.8￥5、26上￥5和213.8￥5。10(^的添加剂21.8￥5、22.8￥5、26.8￥5和 Ζ13 · BVS包含200mg硫酸铁、50mg硫酸铜、130mg氧化锌、130mg氧化猛、2 · 55mg碳酸|丐、160mg 维生素 E、6 · 5mg维生素 K3、6 · 5mg维生素 Bl、14mg维生素 B2、15mg维生素 B6、0 · 15mg维生素 B12、150mg烟酸、30mg泛酸和5 · 3mg叶酸。
[0126] 将所述添加剂在50mM Tris-HCl缓冲液(pH=8.2)中抽提30分钟，并且在同一缓冲 液中如此地进一步稀释，从而使得多肽的终浓度位于大约70ng/ml。
[0127] 随后，如在实施例5中所描述的那样，测定这些溶液的降解玉米赤霉烯酮的效应。 相应的活性为:8 · 230U/g，对于Z1; 9 · 310U/g，对于Z2; 9 · 214U/g，对于Z6; 83U/g，对于Z1 · B; 92U/g，对于Z2 · B; 90U/g，对于Z2 · C; 57U/g，对于Z13 · B; 8U/g，对于Z1 · BVS; 9U/g，对于 Z2 · BVS; 9U/g，对于Z6 · BVS;和6U/g，对于Z13 · BVS。
[0128] 如在实施例4中所描述的那样来施行添加剂Z1、Z2、Z6、Z13、Z1.B、Z2.B、Z6.B、 Z13 · B、Z1 · BVS、Z2 · BVS、Z6 · BVS和Z13 · BVS 降解 ZEN 衍生物α-ZEL、β-ZEL、α-ZAL、β-ZAL、Z14G、 Z14S和ZAN的能力，但是使用100μΙ的具有大约70ng/ml的多肽浓度的多肽溶液来代替100μΙ 的细胞裂解物。在6小时的温育后，起始量的仅仅最大15 %作为未水解的ZEN衍生物存在。
[0129] 实施例8:最佳温度
[0130] 为了测定具有SEQ ID N〇.l、2、5、6、7、9、ll、12和15的多肽的最佳温度，如在实施 例1中所描述的那样，将它们以具有c-末端6 XHis标签的方式进行克隆，在大肠杆菌中表 达，并纯化。在初步试验中，对于每种多肽，测算出那个浓度，在所述浓度下在试验条件 (Teorell Stenhagen 缓冲液（Teorell 和 Stenhagen，Ein Universal puffer fiir den pH-Bereich 2.0bis 12.0.Biochem Ztschrft, 1938,299:第416-419页），pH 7.5,具有O.lmg/ ml BSA，在30°C下）下在3小时的试验持续时间后可以确保ZEN的完全转化。以所测算出的浓 度在用于测定最佳温度的降解批料中使用所述制备物。该试验在PCR循环仪(Eppendorf) 中，通过使用温度梯度函数，在20°C+/-10°C下，在40°C+/-10°C下，和如果需要，在60°C+/_ 10°C下(在各自范围内10个温度;预先确定的PCR循环仪的温度)来进行。对于批料，在各自 最佳pH下给Teorell-Stenhagen缓冲液掺入相应的酶浓度以及0. lmg/ml BSA和5ppm ZEN。 具有0. lmg/ml BSA和5ppm ZEN而没有酶添加的批料用作阴性对照。在0小时、0.5小时、1小 时、2小时和3小时的温育时间后，对于每个温育温度各自抽取一个样品，在99°C下加热失活 10分钟，并且贮存于_20°C。在解冻后，将样品转移到HPLC小瓶中。借助于HPLC-DAD来分析 ZEN、HZEN和DHZEN。为此，借助于尺寸为4.6mmX150mm和颗粒大小为5μm的ZorbaxSB-Aq C18柱通过色谱法来将代谢物分开。具有5mM乙酸铵的甲醇-水混合物用作流动相。在274nm 下记录UV-信号。代谢物的定量通过包括所携带的标准品系列来进行。最佳温度的测算通过 测算出的降解曲线的斜率来进行，其中将斜率为最大时所处的温度定义为最佳温度。最佳 温度显示在表8中。
[0131] 表8:多肽的最佳温度。
[0132]
[0133] 实施例9:温度稳定性
[0134] 为了测定具有SEQ ID No.l、2、5、6、7、9、ll、12和15的多肽的温度稳定性，如在实 施例1中所描述的那样，将它们以具有c-末端6XHis标签的方式进行克隆，在大肠杆菌中表 达，并纯化。将它们在具有梯度函数的PCR循环仪中在各自的最佳温度+/-HTC下进行温育。 在0分钟、15分钟、30分钟和60分钟后，对于每个批料和每个温度抽取一个样品。随后，在降 解试验中，在具有〇· lmg/ml BSA和5ppm ZEN的处于各自最佳pH下的Teorell-Stenhagen缓 冲液中，在批料中使用这些经预温育的样品。在初步试验中，对于每种多肽，测算出那个浓 度，在所述浓度下在试验条件(Teorell Stenhagen缓冲液，pH 7.5,具有O.lmg/ml BSA，在 30°C下）下在3小时的试验持续时间后可以确保ZEN的完全转化。在批料中使用各自所测算 出的酶浓度。在30 °C下温育所述降解批料。在0小时、0.5小时、1小时、2小时和3小时的温育 时间后进行取样。随后，将多肽在99 °C下加热失活10分钟，并且将样品贮存于_20°C。在解冻 后，将样品转移到HPLC小瓶中，并且如在实施例8中所描述的那样借助于HPLC-DAD来进行分 析。
[0135] 将温度稳定性定义为这样的温度，在所述温度下多肽在15分钟的预温育后具有 50%的残余活性，相比于最佳温度而言。作为对于活性的量度，考虑降解曲线的斜率。温度 稳定性显不在表9中。
[0136] 表9:多肽的温度稳定性(在15分钟的预温育后50%的残余活性）。
[0137]
[0138] 实施例10:最佳pH
[0139] 为了测定具有SEQ ID如.1、2、5、6、7、9、11、12和15的多肽的最佳?!1，如在实施例1 中所描述的那样，将它们以具有C-末端6XHis标签的方式进行克隆，在大肠杆菌中表达，并 纯化。在初步试验中，对于每种多肽，测算出那个浓度，在所述浓度下在试验条件(Teorel 1 Stenhagen缓冲液，pH 7.5，具有0. lmg/ml BSA，在30°C下）下在3小时的试验持续时间后可 以确保ZEN的完全转化。在批料中使用各自的酶浓度。所述降解批料在处于3.0、4.0、5.0、 5·5、6·0、6·5、7·0、7·5、8·0、8·5、9·0、9·5、10·0、11·0和12.0 的pH 值下的Stenhagen 缓冲液 中实施制备。为了进行降解，将具有〇. lmg/ml BSA和5ppm ZEN的降解批料在30°C下进行温 育。在具有O.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的处于pH 3·0、ρΗ 7.0和pH 12.0下的Teorell-Stenhagen缓冲液中的批料用作阴性对照。在0小时、0.5小时、1小时、2小时和3小时的温育 时间后进行取样。随后，将多肽在99 °C下加热失活10分钟，并且将样品贮存于_20°C。在解冻 后，将样品转移到HPLC小瓶中，并且如在实施例8中所描述的那样借助于HPLC-DAD来进行分 析。最佳pH的测算通过测算出的降解曲线的斜率来进行，其中将在斜率为最大时所处的pH 值定义为最佳pH。最佳pH显示在表10中。
[0140] 表10:多肽的最佳pH。
[0141]
[0142] 实施例11:在pH 5.0下的pH稳定性
[0143]为了测定pH稳定性，将来自实施例10的多肽在处于pH 5.0和各自最佳pH下的 Teroell-Stenhagen缓冲液中在25°C下温育1小时。在降解试验中，以与对于测定最佳pH所 使用的浓度相同的各自多肽的浓度，在具有〇.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的处于各自最佳pH下 的lOOmM Tris-HCl缓冲液中，在批料中使用这些经预温育的样品。在0小时、0.5小时、1小 时、2小时和3小时的温育时间后进行取样。随后，将多肽在99°C下加热失活10分钟，并且将 样品贮存于-20°C。在解冻后，将样品转移到HPLC小瓶中，并且如在实施例8中所描述的那样 借助于HPLC-DAD来进行分析。将pH稳定性定义为在pH 5.0下多肽的残余活性百分比，相对 于在各自最佳pH下的活性而言。对于pH 5.0的pH稳定性显示在表11中。
[0144] 表11:在pH 5.0下多肽的pH稳定性。
[0145]
[0146] 实施例12: ZEN降解试验
[0147] 示例性地对于具有SEQ ID No·l、2、5、6、7、9、ll、12和15的多肽，进行ZEN至HZEN和 DHZEN的降解。所述降解批料在具有O.lmg/ml BSA和5ppm ZEN的Teorell Stenhagen缓冲液 (pH 7.5)中实施制备。在30°C下温育所述降解批料。在0小时、0.5小时、1小时、2小时和3小 时的温育时间后进行取样。随后，将多肽在99°C下加热失活10分钟，并且将样品贮存于-20 °C。在解冻后，将样品转移到HPLC小瓶中，并且如在实施例8中所描述的那样借助于HPLC-DAD来进行分析。如此地来选择多肽浓度，从而在大约3小时后达到完全的降解。降解动力学 描绘在图3中，其中y轴显示了以微摩尔/升(μπιο 1 /1)表示的ZEN、HZEN和DHZEN的浓度，和X轴 显示了以小时(h)表示的温育时间。
[0148] *μ Μ表示微体积摩尔浓度，并且相应于单位μπι。1/1。
[0149] 本发明的一些实施方案如下：
[0150] 1.以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其 特征在于，所述多肽是具有选自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性变体的水解酶， 其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少40%。
[0151] 2.根据实施方案1的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一个保守氨基酸序列区 段或其功能性变体，其中所述氨基酸序列区段的功能性变体具有至少70%，优选地至少 84%，更优选地至少92%，和最优选地至少98%的序列同一性，并且所述至少一个保守氨基 酸序列区段选自具有SEQ ID No.l的序列的氨基酸序列+24至+50、+52至+77、+79至+87、+89 至+145、+150 至+171、+177至+193、+223至+228、+230至+237、+239至+247、+249至+255、+257 至+261、+263至+270、+272至+279、+297至+301、+303至+313、+24至328、+1至+328。
[0152] 3.根据实施方案1或2的多肽，其特征在于，所述功能性变体具有选自下列的氨基 酸修饰:各自一个或多个氨基酸的置换、缺失和插入。
[0153] 4.根据实施方案1、2或3之一的多肽，其特征在于，所述多肽具有至少0.01U/mg，优 选地至少0.1U/mg，特别地至少lU/mg的比活性，和/或具有最高50μΜ，优选地最高3.5μΜ， 特别地最高〇. 5μΜ的以水解方式裂解玉米赤霉烯酮的ΚΜ值，和/或具有至少0. Οδ?Γ1，优选地 至少Ο.θ?Γ1，特别地至少5(1的以水解方式裂解玉米赤霉烯酮的1^值，和/或具有至少 Ο.ΟΟΟΟΙμΜ^ΕΓ1，优选地至少〇.〇〇〇1μΜ?，特别地至少Ο.ΟΟΙμΜ^ΕΓ1的以水解方式裂解 玉米赤霉稀酮的v max值。
[0154] 5.根据实施方案1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含选自SEQ ID No. 2、 5、6、7、9、11和15的氨基酸序列或其功能性变体，其中所述功能性变体与至少一个所述氨基 酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在pH 5.0下的pH稳定性为至少15%，优 选地50 %，和特别优选地至少90 %。
[0155] 6.根据实施方案1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含选自SEQ ID No. 1、 2、5、6、7、9、11、15的氨基酸序列或其功能性变体，其中所述功能性变体与至少一个所述氨 基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽在30°C和75°C之间，优选地38°C和55 °C之间，特别优选地38°C和52°C之间的温度范围内具有最高的酶促活性。
[0156] 7.根据实施方案1至4之一的多肽，其特征在于，所述多肽包含选自SEQ ID No. 1、 5、6、9、11、12和15的氨基酸序列或其功能性变体，其中所述功能性变体与至少一个所述氨 基酸序列具有至少40%的序列同一性，并且所述多肽是温度稳定的，直至90°C，优选地75 °C，和特别优选地60 °C的温度。
[0157] 8.根据实施方案1至7之一的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一个选自下列的 位置处具有关于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一个突变:22、23、25、26、27、29、31、32、 35、37、42、43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、 132、141、146、148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、 196、197、198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、 229、231、233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、 277、280、281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、 319、321、323、325和326。
[0158] 9.根据实施方案8的多肽，其特征在于，所述多肽具有选自下列的关于SEQ ID 吣.1的氨基酸序列的至少一个突变:〇22厶、5230、5231^、呢^)、126￥、？27￥小27!1、529?、1?31八、 F32Y、R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、S69G、 P72E、V73A、A78S、N80H、F84Y、 I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、L132V、 A141S、I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、L170R、 A172G、A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、V197C、 V197R、E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、Q209R、 L210A、L210S、AP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、K222Q、 G229A、A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、S248T、 S248N、S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、E269H、 E269N、L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、I285L、 I286M、R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、D309A、 A311P、A314V、L317F、S319Q、S319P、S319R、S321A、S321T、T323A、P325A、A326P。
[0159] 10.根据实施方案1至8之一的多肽，其特征在于，包含至少一个选自SEQ ID No. 32-69的下列氨基酸基序。
[0160] 11.根据实施方案9的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一个位置处包含至少一 个保守氨基酸置换，并且所述保守氨基酸置换选自：G至A;或A至G、S;或V至I、L、A、T、S;Sl 至V、L、M;或L至I、M、V;或Μ至L、I、V;或P至A、S、N;或 F至Y、W、H;或Y 至 F、W、H;或W至Y、F、H;或R 至K、E、D;或K至R、E、D;或Η至Q、N、S;或D或N、E、K、R、Q;或E至Q、D、K、R、N;或 S至T、A;或T至S、 V、A;或C至S、T、A;或 N 至D、Q、H、S;或Q至E、N、H、K、R的置换。
[0161] 12.分离的多核苷酸，其具有编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽具有水解玉米 赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的特性，其特征在于，所述核苷酸序列编码至 少一种根据实施方案1至11之一的多肽；和/或所述核苷酸序列与至少一种选自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列具有序列同一性程度，其中所选择的核苷酸序列为至少40%;和/ 或所述核苷酸序列在中等严紧条件下与至少一种选自SEQ ID No. 16-31的核苷酸序列杂 交，和/或与具有至少200个核苷酸，特别是至少100个核苷酸的其部分序列杂交，和/或与上 述核苷酸序列或其部分序列的互补链杂交。
[0162] 13.以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的添加剂， 其特征在于，所述添加剂包含至少一种具有选自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性 变体的多肽，其中在所述功能性变体与至少一个所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少 40% ;并且任选地包含助剂。
[0163] 14.根据实施方案13的添加剂，其特征在于，包含至少一种根据实施方案1至11之 一的多肽。
[0164] 15.根据实施方案13或14之一的添加剂，其特征在于，所述助剂选自：至少一种惰 性载体，以及任选地，其他成分，例如维生素和/或矿物质和/或酶和/或其他用于使真菌毒 素解毒的组分。
[0165] 16.根据实施方案13、14或15之一的添加剂，其特征在于，在所述添加剂中，以最高 10，000U/g，优选地最高1，000U/g，更优选地最高100U/g，和最优选地最高10U/g的浓度包含 至少一种根据实施方案1至11之一的多肽。
[0166] 17.根据实施方案13至16之一的添加剂，其特征在于，所述添加剂以经包囊或经包 衣的形式存在。
[0167] 18.根据实施方案13至17之一的添加剂用于以水解方式裂解在饲料中、在食物中 或在中的玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的用途，所述饲料特别地为用 于猪、家禽和水产养殖的饲料。
[0168] 19.用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的方 法，其特征在于，所述玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物被具有选自SEQ ID No. 1-15的氨基酸序列或其功能性变体的多肽水解，其中在所述功能性变体与至少一个所 述氨基酸序列之间的序列同一性为至少40%。
[0169] 20.根据实施方案19的方法，其特征在于，在根据实施方案14至17之一的添加剂中 使用所述多肽。
[0170] 21.根据实施方案20的方法，其特征在于，将所述多肽或添加剂与被玉米赤霉烯酮 和/或被至少一种玉米赤霉烯酮衍生物污染的饲料或食物相掺混，使所述被污染的饲料或 食物与湿气相接触，并且所述多肽或添加剂水解在所述被污染的饲料或食物中所包含的玉 米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物。
[0171] 22.根据实施方案19至21之一的方法，其特征在于，至少70 %，优选地至少80%，特 别优选地至少90%的所述玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物被水解。
【主权项】
1. 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的多肽，其特征 在于，所述多肽是具有SEQ ID No. 1的氨基酸序列或其功能性变体的水解酶，其中在所述功 能性变体与所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少70%。2. 根据权利要求1的多肽，其特征在于，所述多肽包含至少一个保守氨基酸序列区段或 其功能性变体，其中所述氨基酸序列区段的功能性变体具有至少70%，优选地至少84%，更 优选地至少92%，和最优选地至少98%的序列同一性，并且所述至少一个保守氨基酸序列 区段选自具有SEQ ID No.l的序列的氨基酸序列+24至+50、+52至+77、+79至+87、+89至+ 145、 +150 至+171、+177至+193、+223至+228、+230至+237、+239至+247、+249至+255、+257至+ 261、+263 至+270、+272 至+279、+297 至+301、+303 至+313、+24 至 328、+1 至+328。3. 根据权利要求1或2的多肽，其特征在于，所述多肽在至少一个选自下列的位置处具 有关于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一个突变:22、23、25、26、27、29、31、32、35、37、42、 43、46、51、53、54、57、60、69、72、73、78、80、84、88、95、97、99、114、118、119、123、132、141、 146、 148、149、154、163、164、165、169、170、172、176、180、182、183、190、191、194、196、197、 198、201、204、205、206、207、208、209、210、212、213、214、216、217、220、221、222、229、231、 233、238、240、244、245、246、248、249、251、254、256、260、262、263、266、269、271、277、280、 281、282、283、284、285、286、287、292、296、298、302、307、308、309、311、314、317、319、321、 323、325和326。4. 根据权利要求1、2或3之一的多肽，其特征在于，所述多肽具有选自下列的关于SEQ ID No.l的氨基酸序列的至少一个突变：D22A、S23Q、S23L、N25D、I26V、F27Y、F27H、S29P、 R31A、F32Y、R35K、R35Q、V37A、V42I、V43T、F46Y、S51E、S51D、D53G、N54M、N54R、L57V、L60I、 S69G、P72E、V73A、A78S、N80H、F84Y、I88L、T95S、T97A、R99K、I114M、I118V、K119R、V123I、 L132V、A141S、I146V、I146L、A148G、A149V、A154P、P163T、A164T、Y165C、Y165H、V169I、 L170R、A172G、A176M、A176V、Y180F、D182T、F183Y、I190V、G191S、K194T、K194E、F196Y、 V197C、V197R、E198R、E198S、K201D、K201G、P204S、P204A、A205S、K206P、A207M、M208A、 Q209R、L210A、L210S、AP212、T213V、P214A、E216T、E216G、A217I、N220H、L221M、K222R、 K222Q、G229A、A231V、F233W、F233Y、F233H、A238G、H240N、H240S、D244E、R245Q、M246L、 S248T、S248N、S248G、Q249R、K251N、I254V、I256L、A260M、T262D、T262G、I263T、E266D、 E269H、E269N、L271V、L277E、E280A、E280L、H281R、H281Q、A282V、Q283R、D284L、D284R、 I285L、I286M、R287E、R287D、R292K、R292T、Q296A、Q296E、H298V、L302S、L307Q、F308S、 D309A、A311P、A314V、L317F、S319Q、S319P、S319R、S321A、S321T、T323A、P325A、A326P。5. 根据权利要求1至4之一的多肽，其特征在于，包含至少一个选自SEQ ID No.32-69的 下列氨基酸基序。6. 以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物从而产生用于 猪、家禽或水产养殖的饲料的添加剂，所述添加剂用于添加至食品或干酒糟，其特征在于， 所述添加剂包含至少一种具有SEQ ID No.l的氨基酸序列或其功能性变体的多肽，其中在 所述功能性变体与所述氨基酸序列之间的序列同一性为至少70% ;并且任选地包含助剂。7. 根据权利要求6的添加剂，其特征在于，包含至少一种根据权利要求1至5之一的多 肽。8. 根据权利要求6或7之一的添加剂，其特征在于，所述助剂选自：至少一种惰性载体， 以及任选地，其他成分，例如维生素和/或矿物质和/或酶和/或其他用于使真菌毒素解毒的 组分。9. 根据权利要求6、7或8之一的添加剂，其特征在于，在所述添加剂中，以最高10，000U/ g，优选地最高1，〇〇〇U/g，更优选地最高100U/g，和最优选地最高10U/g的浓度包含至少一种 根据权利要求1至5之一的多肽。10. 根据权利要求6至9之一的添加剂，其特征在于，所述添加剂以经包囊或经包衣的形 式存在。11. 至少一种具有SEQ ID No. 1的氨基酸序列或其功能性变体的多肽用于以水解方式 裂解在饲料中、在食物中或在干酒糟中的玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生 物的用途，所述饲料特别地为用于猪、家禽和水产养殖的饲料，其中所述功能性变体与所述 氨基酸序列之间的序列同一性为至少70%。12. 用于以水解方式裂解玉米赤霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物的方法，其 特征在于，所述玉米赤霉稀酮和/或至少一种玉米赤霉稀酮衍生物被具有SEQ ID No. 1的氨 基酸序列或其功能性变体的多肽水解，其中在所述功能性变体与所述氨基酸序列之间的序 列同一性为至少70 %。13. 根据权利要求12的方法，其特征在于，在根据权利要求6至10之一的添加剂中使用 所述多肽。14. 根据权利要求13的方法，其特征在于，将所述多肽或添加剂与被玉米赤霉烯酮和/ 或被至少一种玉米赤霉烯酮衍生物污染的饲料或食物相掺混，使所述被污染的饲料或食物 与湿气相接触，并且所述多肽或添加剂水解在所述被污染的饲料或食物中所包含的玉米赤 霉烯酮和/或至少一种玉米赤霉烯酮衍生物。15. 根据权利要求12至14之一的方法，其特征在于，至少70%，优选地至少80%，特别优 选地至少90 %的所述玉米赤霉稀酮和/或至少一种玉米赤霉稀酮衍生物被水解。
【文档编号】C12N15/55GK106085983SQ201610373145
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2014年8月27日
【发明人】S·弗鲁豪夫, M·萨姆海塞尔, M·费菲尔, D·摩尔, G·沙特兹迈尔, E·M·宾德
【申请人】爱尔伯股份公司