博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的甲基转移酶基因及其应用
【专利摘要】本发明公开了博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的甲基转移酶基因及其应用。首次在博落回基因组中发现6个参与血根碱与白屈菜红碱合成的甲基转移酶基因，包括Mc2833、Mc769、Mc8567、Mc833、Mc830、Mc9487基因。利用酿酒酵母体系验证通过上游前体饲喂分别验证了这几步反应，可实现血根碱与白屈菜红碱中间体的合成。本发明进一步揭示了血根碱在博落回中合成的分子机制，为高血根碱与白屈菜红碱含量博落回育种提供了理论依据和分子辅助育种目标；同时为血根碱与白屈菜红碱的体外人工合成提供了宝贵经验。
【专利说明】
博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的甲基转移酶基因及 其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程及分子生物学领域，具体地说，涉及博落回中参与血根碱与 白屈菜红碱合成的甲基转移酶基因及其应用。
【背景技术】
[0002] 血根碱和白屈菜红碱主要分布在血根(Sanguinaria canadensis L.)、鸦片罂粟 (Papaver somnif erum L ·)、花菱草（Eschscho lz ia californica Cham·)、白屈菜 (Chelidonium majus)、紫堇（Corydalis edulis Maxim)和博落回（Macleaya cordata (Willd.)R.Br.)当中。最近二十年以来，血根碱已经在欧洲作为替代抗生素的添加剂来促 进动物生长。目前博落回是全世界最主要的血根碱的来源植物，并且被欧洲食品安全局列 为动物饲用添加剂。血根碱和白屈菜红碱的合成路径在前期研究中已经得到阐明。相关合 成基因已经从鸦片罂粟（Papaver somniferum L·)、花菱草（Eschscholzia californica Cham.)、等植物中克隆，但是尚未有任何基因从博落回中克隆。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供参与博落回血根碱和白屈菜红碱合成的甲基转移酶基因及 其应用。
[0004] 为了实现本发明目的，本发明提供博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的甲基 转移酶基因，包括基因12833、]^769、]^8567、]\^833、]\^830、]\^9487，它们的基因序列分别 如SEQ ID No .1-6所示。
[0005] 所述的博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的甲基转移酶基因编码的蛋白，它 们的氨基酸序列分别如SEQ IDNo.7-12所示。
[0006] 本发明还提供含有上述基因的载体，含有上述基因的工程菌。
[0007] 还有上述基因在血根碱与白屈菜红碱合成中的应用，以及上述基因在血根碱与白 屈菜红碱体外合成中的应用。具体应用如下：
[0008] 基因 MC2833编码博落回中催化去甲乌药碱生成乌药碱的6-0-甲基转移酶，以及博 落回中催化羟基-N-甲基乌药碱生成网状番荔枝碱的4-0-甲基转移酶；
[0009] 基因 Mc833和Mc830编码博落回中催化刺罂粟碱生成Cis-N-甲基刺罂粟碱以及催 化四氢小檗碱生成cis-N-甲基四氢小檗碱的四氢化小檗碱cis-N-甲基转移酶；
[0010]基因 Mc9487编码博落回中催化金黄紫堇碱生成四氢非洲防己碱的金黄紫堇碱-9-〇-甲基转移酶；
[0011] 基因 Mc8567和Mc769编码博落回中催化乌药碱生成N-甲基乌药碱的乌药碱-N-甲 基转移酶。
[0012] 在之前的研究中，血根碱与白屈菜红碱的合成途径在罂粟等其它物种中已经清 晰，血根碱与白屈菜红碱从去甲乌药碱开始均经过12步反应合成(包括1步不需要酶参与的 自发反应）。其中第1步到第5步反应2者的合成酶相同以及第8到第12步反应2者的合成酶相 同。为了找到博落回中合成血根碱与白屈菜红碱甲基转移酶合成基因，我们对博落回植株 进行De Novo全基因组测序分析，同时对博落回根茎叶花果实进行了转录组测序。首先以其 他物种（罂粟，花菱草）中合成血根碱和白屈菜红碱的通路中甲基转移酶为参照基因，在博 落回基因组中进行BLAST同源比对，找到了 11个合成血根碱与白屈菜红碱的候选基因。由于 博落回中的血根碱和白屈菜红碱具有组织特异性，2种生物碱均在果荚中含量最高，而两种 生物碱的重要前体化合物原阿片碱和别隐品碱在根部中含量最高，而在茎部组织中生物碱 含量极低。因此我们推测参与合成血根碱与白屈菜红碱的功能基因在博落回中的表达规律 也叶应该是根和果荚中高表达，茎中不表达或者表达量极低。根据这种组织表达特异性，我 们从11个候选基因中共筛选出6个符合这种表达规律的基因。然后，我们利用酵母表达体 系，在酵母中表达这些候选基因，通过分别饲喂每步的上游化合物，再用UPLC-Q-T0F仪来检 测酵母提取物。
[0013] 首先，我们先对血根碱与白屈菜红碱通路中的甲基转移酶候选基因进行验证，在 通路中共有6步反应属于甲基转移酶参与的步骤，筛选出的6个甲基转移酶基因，分别是 Mc8567、Mc833、Mc830、Mc769、Mc2833、Mc9487。我们分别构建好表达这6个基因的酵母后分 别前体饲喂这6步反应的前体化合物去甲乌药碱、乌药碱、羟基-N-甲基乌药碱、刺罂粟碱、 金黄紫堇碱、四氢小檗碱。之后我们通过UPLC-Q-T0F检测酵母提取物发现在饲喂去甲乌药 碱的表达Mc2833的酵母提取物中检测到了下游产物乌药碱，而在空白对照酵母组中没有检 测到下游产物。因此我们认为Mc2833为博落回中催化去甲乌药碱生成乌药碱的6-0-甲基转 移酶(Mc60MT)。而Mc2833不但能催化去甲乌药碱还能催化羟基-N-甲基乌药碱生成网状番 荔枝碱，因此我们认为Mc2833同时也是博落回中催化羟基-N-甲基乌药碱生成网状番荔枝 碱的4-0-甲基转移酶(Mc40MT)。证明该基因是一个多功能甲基转移酶，具有催化血根碱合 成途径中两个底物并生成不同产物的功能。通过此方法，我们还证明了 Mc833和Mc830都是 博落回中催化刺罂粟碱生成cis-N-甲基刺罂粟碱以及催化四氢小檗碱生成cis-N-甲基四 氢小檗碱的四氢化小檗碱ci s-N-甲基转移酶(TOMT)。除此以外，还证实Mc9487是博落回中 催化金黄紫堇碱生成四氢非洲防己碱的金黄紫堇碱-9-0-甲基转移酶（SMT)，Mc8567和 Mc769是博落回中催化乌药碱生成N-甲基乌药碱的乌药碱-N-甲基转移酶(CNMT)。
[0014] 本发明首次在博落回基因组中发现参与血根碱与白屈菜红碱合成的6个甲基转移 酶基因，包括Mc2833、Mc769、Mc8567、Mc833、Mc830、Mc9487。利用酵母体系验证了血根碱和 白屈菜红碱合成中甲基转移酶参与的6步反应，可实现血根碱和白屈菜红碱的合成。本发明 进一步揭示了博落回中血根碱合成的分子机制，为高含量血根碱和白屈菜红碱博落回育种 提供了理论依据和分子辅助育种目标，可用于大规模筛选育种材料；同时还为血根碱和白 屈菜红碱的体外人工合成提供了宝贵经验，本发明可替代传统的从植物材料中提取血根碱 的方法，实现体外合成血根碱。
【附图说明】
[0015] 图1为血根碱与白屈菜红碱合成通路图，两个化合物有部分合成通路相同，而本发 明研究是从中间产物乌药碱开始研究，箭头上分别标出甲基转移酶参与的步骤共6步反应；
[0016] 图2为本发明通过分析博落回甲基转移酶候选基因的RNA-Seq数据的表达规律，筛 选博落回中血根碱与白屈菜红碱甲基转移酶候选基因；
[0017] 图3为本发明利用UPLC-Q-T0F检测表达MC2833酵母与空白酵母提取物中参与血根 碱与白屈菜红碱合成第1步反应，即去甲乌药碱至乌药碱的结果；
[0018] 图4为本发明利用UPLC-Q-T0F检测表达Mc769和MC8567酵母与空白酵母提取物中 参与血根碱与白屈菜红碱合成第2步反应，即乌药碱至N-甲基乌药碱的结果；
[0019] 图5为本发明利用UPLC-Q-T0F检测表达MC2833酵母与空白酵母提取物中参与血根 碱与白屈菜红碱合成第4步反应，即3-羟基-N-甲基乌药碱至网状番荔枝碱的结果；
[0020] 图6为本发明利用UPLC-Q-T0F检测表达Mc833、Mc830酵母与空白酵母提取物中参 与血根碱合成第8步反应即刺罂粟碱至N-甲基刺罂粟碱的结果，以及白屈菜红碱合成第15 步反应即四氢小檗碱至cis-N-甲基四氢小檗碱的结果。
[0021] 图7为本发明利用UPLC-Q-T0F检测表达MC9487酵母与空白酵母提取物中参与白屈 菜红碱合成第6步反应即金黄紫堇碱至四氢非洲防己碱的结果。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0023] 实施例1参与血根碱与白屈菜红碱合成基因的挖掘与获得
[0024] 1基因的挖掘
[0025] 由于血根碱与白屈菜红碱在罂粟和花菱草等植物中的合成路径已知（图1 )，相关 的功能基因也已经得到克隆。我们以其他物种（罂粟、花菱草）已公开在NCBI的血根碱与白 屈菜红碱的甲基转移酶基因序列为参照基因，在博落回DeNovo全基因组序列中进行BLAST 比对，共得到候选基因11条。又由于血根碱与白屈菜红碱在果荚中含量极高，茎中含量极 低。前体化合物原阿片碱与别隐品碱在根部含量极高，茎中含量极低。以此为线索，分析博 落回根茎叶花果转录组数据(RNA-Seq)从11条候选基因中筛选符合根部和果荚高表达，茎 部不表达这一表达模式的基因，共得到6条（图2)。分别是Mc8567、Mc833、Mc830、Mc769、 Mc2833、Mc9487。
[0026] 2 博落回 Mc8567、Mc833、Mc830、Mc769、Mc2833、Mc9487基因的获得。
[0027] 首先制备博落回根部和果荚cDNA文库，然后利用正向引物和反向引物进行PCR扩 增（引物序列见表1)。
[0028] 表1引物序列（5:30
[0029]
[0031] PCR反应体系以20μ1计为：10-20ngAU模板ΙμL，lOpmol/μΙ正向、反向引物各ΙμL， 10mmol/L dNTP mix 0·4μ1，0·5υ/μL高保真Taq DNA聚合酶lyl，10XPCR反应缓冲液2μ1，余 量为水。
[0032] PCR 反应条件为：94 °C 5 分钟；94 °C 20 秒，55 °C 20 秒，72 °C 2 分 30 秒，35 个循环；72 °C 10 分钟。
[0033]将扩增得到的片段与pYES2载体(Invitrogen)连接，测序确认没有突变。
[0034]实施例2利用酵母表达系统验证血根碱与白屈菜红碱合成候选基因的功能
[0035] 将 Mc8567、Mc833、Mc830、Mc769、Mc2833、Mc9487基因分别构建到表达载体pYES2 (Invitrogen)上，并转化酵母菌。诱导酵母表达蛋白，然后进行前体饲喂收集酵母。裂解后 用甲醇抽提化合物。样品制备好后用UPLC-Q-T0F进行检测。结果分别如图3-图7所示。
[0036] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0037] 序列说明：
[0038] SEQ ID 吣.1-6分别为12833、]\^769、]\^8567、]\^833、]\^830、]\^9487、基因序列。
[0039] SEQ ID 如.7-12分别为基因齔2833、]\^769、]\^8567、]\^833、]\^830、]\^9487编码的 氨基酸序列。
【主权项】
1. 博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的甲基转移酶基因，包括基因MC2833、 Mc769、Mc8567、Mc833、Mc830、Mc9487，它们的氨基酸基因序列分别如SEQ ID No. 1-6所示。2. 权利要求1所述的博落回中参与血根碱与白屈菜红碱合成的甲基转移酶基因编码的 蛋白，它们的氨基酸序列分别如SEQ ID No.7-12所示。3. 含有权利要求12所述基因的载体。4. 含有权利要求12所述基因的工程菌。5. 权利要求12所述基因在血根碱与白屈菜红碱合成中的应用。6. 权利要求12所述基因在血根碱与白屈菜红碱体外合成中的应用。7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于， 基因Mc2833编码博落回中催化去甲乌药碱生成乌药碱的6-0-甲基转移酶，以及博落回 中催化羟基-N-甲基乌药碱生成网状番荔枝碱的4-0-甲基转移酶； 基因Mc833和Mc830编码博落回中催化刺罂粟碱生成cis-N-甲基刺罂粟碱以及催化四 氢小檗碱生成cis-N-甲基四氢小檗碱的四氢化小檗碱cis-N-甲基转移酶； 基因Mc9487编码博落回中催化金黄紫堇碱生成四氢非洲防己碱的金黄紫堇碱-9-0-甲 基转移酶； 基因Mc8567和Mc769编码博落回中催化乌药碱生成N-甲基乌药碱的乌药碱-N-甲基转 移酶。
【文档编号】C12N1/19GK106085981SQ201610507690
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月30日
【发明人】曾建国, 黄鹏, 卿志星
【申请人】湖南美可达生物资源有限公司