乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法
【专利摘要】本发明公开了一种乳酸脱氢酶同工酶分离方法。针对现有技术以巴比妥作为电泳缓冲液的分离方法存在的缺陷，本发明提供了一种以TBE缓冲液为电泳缓冲液的乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法，TBE缓冲液是Tris 10.8g、Na2EDTA·2H2O 0.744g、硼酸5.5g，加蒸馏水溶解，定容至1000ml制得。该方法可以从控制电泳温度和/或控制电泳缓冲液pH两方面加以优化。本发明还提供利用上述乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法实现的人类肿瘤细胞乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法，以及一种TBE缓冲液在乳酸脱氢酶同工酶电泳分离中的应用方法。本发明方法有效避免了现有技术中由于巴比妥缓冲液使用而产生的技术缺陷，扩展了乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法在科学研究、临床检测、实验教学中的应用价值。
【专利说明】
乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种酶电泳分离方法，特别是涉及一种乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方 法。属于组织和细胞活性酶电泳检测领域
【背景技术】
[0002] 乳酸脱氢酶同工酶（lactate dehydrogenase，LDH)是能可逆催化乳酸脱氢生成丙 酮酸的酶，与糖的代谢及供能有重要关系。
[0003] 乳酸脱氢酶广泛存在于身体各组织细胞的胞浆中，以心、骨骼肌和肾脏最丰富，其 次为肝、脾、胰腺、脑和肺等。它包含分别由A亚基(骨骼肌型）和B亚基(心肌型）构成的5类同 工酶，SPLDH1 (B4)、LDH2(B3A)、LDH3(B2A2)、LDH4(BA3)、LDH5(A4) IDH同工酶在不同组织中 分布不同，存在明显的组织特异性。心、肾、红细胞中以LDH1、LDH2为主，肝、骨骼肌中以 LDH4、LDH5为主，肺、脾、胰、甲状腺、肾上腺和淋巴结等组织中以LDH3最多。由于LDH显著的 组织特异性，因此LDH同工酶相关实验成为医学专业理论课与实验课重点学习内容。
[0004] 正常情况下LDH同工酶相当稳定的存在于各种细胞中，但当不同组织破坏受损时， 不同的同工酶释放入血，如急性心肌梗塞发作后，早期血清中LDH1和LDH2活性均升高，但 LDH1增高更早，更明显，导致LDH1/LDH2的比值升高;肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤时 LDH5都会升高；患活动性风湿性心脏病、急性病毒性心肌炎、溶血性贫血、肾坏死等病LDH1 也可升高等等。因此可以根据各种同工酶活力的变化作出诊断。故此，乳酸脱氢酶同工酶的 定量检测在临床检验方面也具有重要意义。
[0005] 在基础研究方面，现有研究结果已证实LDH同工酶谱确与肿瘤演进相关，如在乳腺 癌细胞中抑制LDHB则出现促肿瘤效应，而抑制LDHA则出现明显的抗肿瘤效应。与此同时，体 内实验显示，LDHA抑制剂在抗肿瘤的同时几乎没有细胞毒性，而在临床研究方面，一些流行 病学的调查也发现，缺乏LDHA的人种并不会出现明显疾病，仅仅在剧烈无氧运动后产生肌 红蛋白尿。因此，LDH及其同工酶有望成为副作用小的特异性抗肿瘤分子靶点。
[0006] 综上，乳酸脱氢酶同工酶的定量检测在实验教学、临床检验、科研研究方面都具有 相当的应用价值与广阔的应用前景。
[0007] 现有技术通常采用电泳分离技术(醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳)测量与分 离5种LDH同工酶，并以巴比妥作为电泳缓冲液。该方法至少存在四方面的不足:一、近年来 巴比妥和巴比妥钠逐渐成为国家管制药品，购买越来越困难，价格较昂贵；二、巴比妥缓冲 液无论在常温还是低温均不易保存;三、采用巴比妥缓冲液进行电泳分离时发热严重，易导 致实验结果带性不太佳；四、现有技术在分离和检测乳酸脱氢酶同工酶方面应用范围极小： 一方面由于不同物种等电点的特殊性，现有技术中可定量分析的琼脂糖凝胶法仅适用于小 鼠这类等电点在较窄且适中的物种，不适于人类肿瘤细胞这类等电点范围较宽的物种。另 一方面醋酸纤维薄膜法虽不受等电点限制，但灵敏度低，不可定量，仅适用于普通实验教 学。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种新的乳酸脱氢酶同工酶电泳分 离方法，该方法采用新的电泳缓冲液，能够适用于琼脂糖凝胶电泳分离方法与醋酸纤维薄 膜电泳分离方法，且能用于包括人类肿瘤细胞乳酸脱氢酶同工酶在内的各物种乳酸脱氢酶 同工酶的电泳分离与定量分析。
[0009] 为实现上述目的，本发明首先提供一种乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法，其技术 方案如下：
[0010] -种乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法，其特征在于：电泳缓冲液是TBE缓冲液，所 述??Ε缓冲液是Tris 10.8g、Na2EDTA· 2H20 0.744g、硼酸5.5g，加蒸馏水溶解，定容至 1000ml 制得。
[0011]经不同物种组织细胞材料的试验验证，TBE缓冲液可以作为电泳缓冲液用于多种 动物、人体组织细胞中的乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离，对LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5分 离效果好。
[0012] 上述方法既可用于琼脂糖凝胶电泳分离方法，也可用于醋酸纤维薄膜电泳分离方 法。
[0013] 上述方法应用于琼脂糖凝胶电泳分离方法时，进一步可以采用两方面条件控制加 以优化:一是控制电泳温度在恒温10°c~12°C;二是根据所检测物种乳酸脱氢酶同工酶的 等电点，控制电泳缓冲液pH在适宜范围。两种优化条件控制均有独立的效果。
[0014] 基于上述乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法，本发明同时提供一种人类肿瘤细胞乳 酸脱氢酶同工酶电泳分离方法，可以实现对人类肿瘤细胞中乳酸脱氢酶同工酶的有效分离 测量，其技术方案如下：
[0015] -种利用上述乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法实现的人类肿瘤细胞乳酸脱氢酶 同工酶电泳分离方法。
[0016] 本发明还提供一种TBE缓冲液在乳酸脱氢酶同工酶电泳分离中的应用方法，其技 术方案如下：
[0017] TBE缓冲液在乳酸脱氢酶同工酶电泳分离中的应用，所述TBE缓冲液是Tr i s 10.8g、Na2EDTA· 2H20 0.744g、硼酸5.5g，加蒸馏水溶解，定容至1000ml制得。
[0018]与现有技术相比，本发明的有益效果是：（1)本发明提供了一种以TBE缓冲液作为 电泳缓冲液分离乳酸脱氢酶同工酶的电泳方法，是一种全新的分离检测乳酸脱氢酶同工酶 的电泳方法；（2)在以TBE缓冲液作为电泳缓冲液的琼脂糖凝胶电泳分离方法中，本发明通 过控制电泳温度或控制电泳缓冲液pH值等手段对基本技术方案进行了优化，提高了分离效 果；（3)本发明方法能够应用于人类肿瘤细胞乳酸脱氢酶同工酶的电泳分离方法，扩展了乳 酸脱氢酶同工酶电泳分离方法在科学研究和临床检测中的应用价值；（4)本发明提供了一 种人类肿瘤细胞乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法，能够得到稳定而良好的实验结果，并且 可进行定量分析，克服了现有电泳方法在分离人类肿瘤细胞乳酸脱氢酶同工酶时实验结果 不稳定、实验结果较差、难以进行数据分析的缺陷；（5)本发明提供了TBE缓冲液在乳酸脱氢 酶同工酶电泳分离中的应用方法；（6)本发明采用的TBE缓冲液试剂常规、易得，配制同体积 缓冲液成本仅为同体积巴比妥缓冲液1/10,同时配置后常温保存时不易变质、可反复多次 回收使用，电泳操作中缓冲液发热稍轻微，且整套电泳操作步骤简单、条件易控、结果稳定， 能够解决巴比妥缓冲液电泳中出现的发热高、效果不稳定、常温或低温保存均易变质等缺 陷。
【附图说明】
[0019]图1.1是琼脂糖凝胶电泳法分离不同人类肿瘤细胞LDH同工酶电泳图谱（1上1'-549，2·ZR-75-30，3·A375，4·MDA-MB-231)。
[0020]图1.2是琼脂糖凝胶电泳法分离不同人类肿瘤细胞LDH同工酶的数据分析图 (1·BT-549，2·ZR-75-30，3·A375，4·MDA-MB-231)。
[0021 ]图2.1是琼脂糖凝胶电泳法分离大鼠不同组织LDH同工酶电泳图谱（1.心、2.肝、3. 肾、4.肺、5.肠、6.骨骼肌）。
[0022] 图2.2是琼脂糖凝胶电泳法分离大鼠不同组织LDH同工酶的数据分析图（1.心、2. 肝、3.肾、4.肺、5.肠、6.骨骼肌）。
[0023] 图3.1是琼脂糖凝胶电泳法分离豚鼠不同组织LDH同工酶电泳图谱（1.心、2.肝、3. 肾、4.肺、5.肠、6.骨骼肌）。
[0024] 图3.2是琼脂糖凝胶电泳法分离豚鼠不同组织LDH同工酶的数据分析图（1.心、2. 肝、3.肾、4.肺、5.肠、6.骨骼肌）。
[0025]图4.1是以TBE缓冲液行醋酸纤维薄膜电泳分离不同组织或细胞LDH同工酶电泳图 谱(1.人类乳腺癌细胞MDA-MB-231、2.大鼠心、3.豚鼠肺）。
[0026]图5.1是琼脂糖凝胶电泳分离MDA-MB-231细胞LDH同工酶时温控与非温控对比结 果（1.温控、2.无温控）。
[0027]图6.1是琼脂糖凝胶电泳分离MDA-MB-231细胞LDH同工酶时不同pΗ的对比结果 (1·ρΗ8·3、2·ρΗ8·0)
【具体实施方式】
[0028] 下面结合附图，对本发明的优选实施例作进一步的描述。
[0029] 实施例一
[0030] 不同人类肿瘤细胞中乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳分离。
[0031] 1、材料
[0032] 1.1设备
[0033]离心机、恒温细胞培养箱、倒置显微镜、超净工作台，细胞培养瓶、细胞刷、移液管、 琼脂糖凝胶水平电泳槽、电泳仪、制胶模具、恒温水浴箱、烤箱、电子天平、搅拌器、微波炉、 凝胶成像系统、ΕΡ管、移液枪、pH计 [0034] 1.2试剂配制
[0035] 磷酸盐缓冲液(？83):他2即〇4.7出0 22.558、他!12?〇4 2.168，加蒸馏水溶解，定容至 1000ml,pH 7.4；
[0036] 胰蛋白酶消化液：0.5g Trypsin、0.04g Na2EDTA · 2H20,溶解于PBS，加 PBS定容至 200ml，pH 7.2;
[0037] 10倍浓缩TBE(Tris-Boric acid-EDTA)缓冲液：Tris 108g、Na2EDTA · 2H20 7.44g、 硼酸55g，加蒸馏水溶解，定容至1000ml;使用时稀释为1倍浓缩(如:配制1000ml 1倍TBE缓 冲液，即取l〇〇ml 10倍TBE缓冲液加蒸馏水定容至1000ml )，调节pH至8.3;以下简称TBE缓冲 液；
[0038] lmol/L乳酸钠:60%乳酸钠溶液9.25ml，加蒸馏水定容至50ml，4°C保存；
[0039] 生理盐水:NaCl 0.584g，加蒸馏水溶解，定容至100ml;
[0040] lmg/ml吩嗪甲氧硫酸酯(PMS) :PMS 100mg，加蒸馏水溶解，定容至100ml，棕色瓶4 °C保存；
[0041 ] lmg/ml氯化硝基四氮唑兰(NBT):NBT 100mg，加蒸馏水溶解，定容至100ml，棕色瓶 4°C保存；
[0042] NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）：分析纯
[0043] l%〇Triton X-100: Triton X-100 1ml，加蒸馈水，定容至 1000ml;
[0044] 10倍浓缩上样缓冲液:溴酚蓝0.04g、1倍TBE缓冲液5ml、蔗糖10g，加热、溶解，冷却 至室温后加1倍TBE缓冲液定容至10ml。
[0045] DMEM培养基:DMEM粉末一袋(购买自gibco by life technologies)，加入超纯水 700ml (15~30°C)，搅拌溶解，加入3.7gNaHC03，搅拌溶解，调节pH至7.2，加入超纯水定容至 900ml，过滤、分装至250ml试剂瓶，培养板点孔放入孵箱，检验是否污染，使用时加入10%胎 牛血清(如配制1 OOmlDMEM培养基即90mlDMEM溶液加入10ml胎牛血清）
[0046] 1640培养基:改良型RPMI-1640培养基(购买于赛默飞世尔生物化学制品（北京)有 限公司）加入10%胎牛血清（如配制100mll640培养基即90ml改良型RPMI-1640培养基加入 10ml胎牛血清）
[0047] 胎牛血清:购买于赛默飞世尔生物化学制品（北京)有限公司
[0048] 染色液:包括低浓度快速染色液、低浓度经济染色液，使用时任选其一。配方如下：
[0049] 表1.1低浓度快速染色液配方
[0050]
[0051]
[0052] 表1.2低浓度经济染色液配方
[0053]
[0054] 1.3样品及制备
[0055] 1.3.1细胞材料
[0056] 不同人类肿瘤细胞:BT-549、ZR-75-30、A375、MDA-MB-231
[0057] 1.3.2细胞培养(参见参考文件1)
[0058]将适量细胞材料盛置于50毫升规格培养瓶，37 °C、5 %⑶2、饱和湿度环境下培养， 2d~3d后换液，放入同样环境下继续培养;待细胞长至约占瓶底约80%时传代培养。传代操 作具体步骤为:吸去原培养液，用TOS洗涤1次，用lml移液管吸取1管胰蛋白酶消化液消化细 胞;于显微镜下观察，当细胞开始明显收缩时，弃去胰酶，再用移液管吸取2管培养基(ZR- 75-30、A375、MDA-MB-231细胞系使用DMEM培养基，BT-549使用1640培养基），吹打成单细胞 悬液，分装至两支50ml规格培养瓶，分别补充2移液管相应的DMEM或1640培养基，置于上述 37°C、5%⑶2、饱和湿度环境下培养。一般传代培养至第3代可以使用于制备细胞样品。 1.3.3细胞样品制备
[0059]待细胞长至培养瓶瓶底的90 %~95 %时取四种细胞各一瓶(50ml规格），分别进行 如下操作：弃去培养上清，PBS洗涤3次；加入0.5ml l%〇Triton X-100，刮取细胞悬液至EP 管，37°C恒温孵箱孵育30min; 8°C、16000r/min离心30min，取上清，加入10倍浓缩上样缓冲 液(如：取上清180μ1则加入10倍浓缩上样液20μ1，总共200μ1，即以上清将10倍浓缩上样液 稀释为1倍），以枪头轻柔吹打混匀，室温保存待用。
[0060] 2、琼脂糖凝胶电泳分离操作 [00611 2.1琼脂糖凝胶(5g/L)制备
[0062] 本实验模具为1 · 5mm厚的6cmX 12cm，6孔梳，凝胶浓度为0· 5%。
[0063] 清洗制胶模具及梳齿，晾干后摆放于平衡台上，并将梳齿插于模具上，梳齿距模具 短边约2.5cm。称取0.15g琼脂糖凝胶颗粒，倒入锥形瓶中，另量取TBE缓冲液30ml加入，于微 波炉内中火加热煮胶lmin，取出，顺时针轻柔摇匀，观察有无未溶解颗粒，若有，则重复煮胶 一次。待凝胶完全溶解后加入TBE缓冲液，定容至30ml。将30ml凝胶溶液缓慢倒入制胶磨具 中，凝胶60min。
[0064] 2.2电泳
[0065]清洗电泳槽，倒入pH 8.3的TBE缓冲液，轻柔缓慢、平行拔去梳齿，取出凝胶板，放 入电泳槽，缓慢补加电泳液至浸没凝胶上表面。分别取步骤1.3.3中制备好的四种细胞样品 于台式离心机点离，上样适量(依常规操作方法确定上样量，本实施例中上样5μ1~30μ1)， 保持电泳液温度恒定在10°c~12°C，恒压100V，至溴酚蓝指示带到达胶尾部(共约180min)。
[0066] 2.3染色及成像
[0067]电泳完成后取出凝胶于37°C恒温水浴箱中染色5min~lOmin(低浓度快速配方）， 或40min~60min(低浓度经济配方）（具体染色时间以各带显色清楚，背景清晰为宜）并成 像、分析。
[0068] 3、分离结果
[0069] 图1.1是琼脂糖凝胶电泳法分离不同人类肿瘤细胞LDH同工酶电泳图谱（1. BT-549、2. ZR-75-30、3. A375、4. MDA-MB-231)，图1.2是琼脂糖凝胶电泳法分离不同人类肿瘤细 胞LDH同工酶的数据分析图（1 · BT-549、2 · ZR-75-30、3 · A375、4 ·MDA-MB-231)。数据分析过程 以ImageJ进行灰度分析，以CAD软件进行图标绘制并根据图形面积换算显示各种LDH同工酶 含量。图1.1显示使用优化的琼脂糖凝胶电泳法分离不同人类肿瘤细胞LDH同工酶均分离效 果良好，带性佳，图1.2显示采用本技术方案所得的琼脂糖同工酶谱图，可进行精确的定量 分析。不同人类肿瘤细胞中各乳酸脱氢酶同工酶的分布不同。
[0070] 参考文件1:司徒镇强，吴军正.细胞培养.世界图书出版西安公司.2007.01 [0071]实施例二
[0072] 大鼠不同组织中乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳分离。
[0073] 其与实施例一相同之处不重复，其不同之处在于：
[0074] 1、材料
[0075] 1.1设备
[0076] 另需匀浆器；不需恒温细胞培养箱、倒置显微镜、超净工作台，细胞培养瓶、细胞 刷、移液管、恒温水浴箱、烤箱
[0077] 1.2试剂配制
[0078] 10倍浓缩TBE(Tris_Boric acid-EDTA)缓冲液：配制操作同实施例一，调节pH至 8.0；
[0079] 不需胰蛋白酶消化液、1 %〇Triton X-100、DMEM培养基、1640培养基（余同实施例 一）。
[0080] 1.3样品及制备
[0081 ] 1.3.1实验动物
[0082] 大鼠
[0083] 1 · 3 · 2组织获取(不需要细胞培养）
[0084] 用生理盐水和异戊巴比妥配制3%麻醉药（如：10ml生理盐水中加入异戊巴比妥 0.3g)，按lml/kg注射于实验动物腹腔内，待动物麻醉后，以颈动脉放干全身血液，再选择性 获取组织(如：心、肝、肾、肺、小肠、骨骼肌等)浸没于生理盐水中备用。
[0085] 1.3.3组织样品制备(不需要细胞样品制备）
[0086] 取1.5ml EP管一个，用移液枪加入0.5ml生理盐水，加入黄豆大小单一组织块，用 小号组织剪剪碎，再用匀浆器使之彻底研磨;8°C、16000r/min离心30min，取上清，加入10 X 浓缩上样缓冲液，以枪头轻柔吹打混匀，常温保存待用。
[0087] 2、琼脂糖凝胶电泳分离操作
[0088] 2.1琼脂糖凝胶(5g/L)制备
[0089] 本实验模具为1.5mm厚的12 X 12cm，13孔梳，凝胶浓度为0.5%。
[0090] 余同实施例一。
[0091] 2.2电泳
[0092]清洗电泳槽，倒入pH8.0的TBE缓冲液，轻柔缓慢、平行拔去梳齿，取出凝胶板，放入 电泳槽，缓慢补加电泳液至浸没凝胶上表面。取制备好的大鼠组织样品（即1.3.3中制备好 的大鼠组织样品）于台式离心机点离，上样适量(同实施例一），保持电泳液温度恒定在l〇°C ~12°C，恒压100V，至溴酚蓝指示带到达胶尾部(共约180min)。
[0093] 3、分离结果
[0094] 图2.1是琼脂糖凝胶电泳法分离大鼠不同组织LDH同工酶电泳图谱（1.心、2.肝、3. 肾、4.肺、5.肠、6.骨骼肌），图2.2是琼脂糖凝胶电泳法分离大鼠不同组织LDH同工酶的数据 分析图（1.心、2.肝、3.肾、4.肺、5.肠、6.骨骼肌）。数据分析过程以ImageJ进行灰度分析，以 CAD软件进行图标绘制。图2.1显示使用优化的琼脂糖凝胶电泳法分离大鼠不同组织LDH同 工酶均分离效果良好，带性佳，图2.2显示采用本技术方案所得的琼脂糖同工酶谱图，可进 行精确的定量分析。大鼠不同组织中各乳酸脱氢酶同工酶的分布不同。
[0095] 实施例三
[0096] 豚鼠不同组织中乳酸脱氢酶同工酶琼脂糖凝胶电泳分离。
[0097] 其与实施例二相同之处不重复，其不同之处在于：
[0098] 1、材料
[0099] 1.1设备（同实施例二）
[0100] 1.2试剂配制
[0101] 10倍浓缩TBE(Tris-Boric acid-EDTA)缓冲液:配制操作同实施例一，调节pH至 9 · 2 〇
[0102] 1.3样品及制备
[0103] 1.3.1实验动物
[0104]豚鼠1.3.2组织获取（同实施例二，不需要细胞培养）
[0105] 1.3.3组织样品制备（同实施例二，不需要细胞样品制备）
[0106] 2、琼脂糖凝胶电泳分离操作
[0107] 2.1琼脂糖凝胶(5g/L)制备（同实施例二）
[0108] 2.2电泳
[0109]清洗电泳槽，倒入pH9.2的TBE缓冲液，轻柔缓慢、平行拔去梳齿，取出凝胶板，放入 电泳槽，缓慢补加电泳液至浸没凝胶上表面。取制备好的豚鼠组织样品于台式离心机点离， 上样适量（同实施例一），保持电泳液温度恒定在10°c~12°C，恒压100V，至溴酚蓝指示带到 达胶尾部(共约210min)。
[0110] 3、分离结果
[0111] 图3.1是琼脂糖凝胶电泳法分离豚鼠不同组织LDH同工酶电泳图谱（1.心、2.肝、3. 肾、4.肺、5.肠、6.骨骼肌），图3.2是琼脂糖凝胶电泳法分离豚鼠不同组织LDH同工酶的数据 分析图（1.心、2.肝、3.肾、4.肺、5.肠、6.骨骼肌）。数据分析过程以ImageJ进行灰度分析，以 CAD软件进行图标绘制。图3.1显示使用优化的琼脂糖凝胶电泳法分离豚鼠不同组织LDH同 工酶均分离效果良好，带性佳，图3.2显示采用本技术方案所得的琼脂糖同工酶谱图，可进 行精确的定量分析。豚鼠不同组织中各乳酸脱氢酶同工酶的分布不同。
[0112] 实施例四
[0113] 不同组织或细胞中乳酸脱氢酶同工酶以TBE电泳液进行醋酸纤维薄膜电泳分离。
[0114] 其与实施例一、二相同之处不重复，其不同之处在于：
[0115] 1、材料
[0116] 1.1设备
[0117]另需匀浆器、细胞刷、保鲜膜、醋纤膜、滤纸；
[0118] 余同实施例一。
[0119] 1.2试剂配制
[0120] 10倍浓缩TBE(Tris-Boric acid-EDTA)缓冲液:配制操作同实施例一，无需调节 pH〇
[0121] 余同实施例一。
[0122] 1.3样品及制备
[0123] 1.3.1细胞材料及实验动物
[0124] 人类乳腺癌细胞MDA-MB-231，大鼠，豚鼠
[0125] 1.3.2组织获取（同实施例二）
[0126] 1.3.3组织样品制备（同实施例二）
[0127] 2、醋酸纤维薄膜电泳分离操作
[0128] 2.1电泳醋酸纤维薄膜制备
[0129]准备6cm X 3cm醋酸纤维薄膜条或6cm X 8cm的醋酸纤维薄膜全膜，在1倍TBE缓冲液 中（无需调节pH)侵泡过夜。
[0130] 2.2 电泳
[0131]清洗电泳槽，倒入1倍TBE缓冲液(无需调节pH)，以四层滤纸搭盐桥。取浸泡的醋酸 纤维薄膜一张，以滤纸吸取薄膜表面多余水分，静止于滤纸上备用。用移液枪吸取20μ1样 品，在保鲜膜上均匀平铺，再用细胞刷蘸取样品，点于醋纤膜无光泽面、距膜前边缘1.5cm 处，待样品全部渗入膜内，移去细胞刷。将已点样的薄膜至于滤纸桥上，点样面向下，点样端 至于阴极。恒压150V，电泳30min，无需控制温度，室温放置电泳即可。
[0132] 2.3染色及成像
[0133] 电泳完成后取出醋酸纤维薄膜，点样面向上，于37°C恒温水浴箱中染色5min~ lOmin(低浓度快速配方），或40min~60min(低浓度经济配方）（试剂染色时间以各带显色清 楚，背景清晰为宜)并成像、分析。
[0134] 3、分离结果
[0135] 图4.1是以TBE缓冲液行醋酸纤维薄膜电泳分离不同组织或细胞LDH同工酶电泳图 谱（1.人类乳腺癌细胞MDA-MB-231、2.大鼠心、3.豚鼠肺）。图4.1显示MDA-MB-231、大鼠心、 豚鼠肺均分离效果良好，带性佳，由此说明以TBE缓冲液进行醋酸纤维薄膜电泳分离不同种 属样品的LDH同工酶仍可达到良好效果。
[0136] 实施例五
[0137] 电泳温度控制对照试验。其与实施例一相同之处不重复，其不同之处在于：
[0138] 1、材料
[0139] 1.1设备（同实施例一）
[0140] 1.2试剂配制（同实施例一）
[0141] 1.3样品及制备（同实施例一）
[0142] 1.3.1细胞材料（同实施例一）
[0143] 1.3.2细胞培养(同实施例一）
[0144] 1.3.3细胞样品制备（同实施例一）
[0145] 2.1琼脂糖凝胶(5g/L)制备
[0146] 本实验模具为1.5mm厚的6cmX 12cm，6孔梳，凝胶浓度为0.5%。
[0147] 清洗两套制胶模具及6cmX 12cm梳齿，晾干后摆放于平衡台上，并将梳齿插于模具 上，梳齿距模具短边约2.5cm。称取0.3g琼脂糖凝胶颗粒，倒入锥形瓶中，另量取TBE缓冲液 60ml加入，于微波炉内中火加热煮胶lmin，取出，顺时针轻柔摇匀，观察有无未溶解颗粒，若 有，则重复煮胶一次。待凝胶完全溶解后加入TBE缓冲液，定容至60ml。用量筒量取30ml凝胶 溶液缓慢倒入其中一套制胶模具中，将锥形瓶中剩余的30ml凝胶溶液缓慢倒入另一套制胶 模具中，凝胶60min。
[0148] 2.2 电泳
[0149] 清洗两套电泳槽，标号"温控组"、"非温控组"，分别倒入相同pH8.3的TBE缓冲液。 轻柔缓慢、平行拔去两套制胶模具的梳齿，取出凝胶板，任意各自放入其中一个电泳槽，缓 慢补加电泳液至浸没凝胶上表面。分别取制备好的四种细胞样品（即1.3.3中制备好的细胞 样品）于台式离心机点离，上样适量（同实施例一）。"温控组"保持电泳液恒温10°c~12°C， "非温控组"不予温度干涉，静止于室内，两组均恒压100V，至溴酚蓝指示带到达胶尾部(共 约12 0~18 Om i η，"温控组"约需18Om i η，"非温控组"约需12 Om i η，具体时间以溴酸蓝指示带 到达胶尾部为准）。
[0150] 3、分离结果
[0151] 图5.1是琼脂糖凝胶电泳分离MDA-MB-231细胞LDH同工酶时温控与非温控对比结 果（1.温控、2.无温控）。由图5.1可见温控组LDH2~LDH5 (MDA-MB-231细胞LDH1表达极微量， 通常检测不到)均分离效果佳，带性良好;非温控组LDH5已失活，仅能检测到LDH2~LDH4。
[0152] 实施例六
[0153] TBE(Tris-Boric acid-EDTA)缓冲液pH值控制对照试验。其与实施例一相同之处 不重复，其不同之处在于：
[0154] 1、材料
[0155] 1.1设备（同实施例一）
[0156] 1.2试剂配制
[0157] 10倍浓缩TBE(Tris_Boric acid-EDTA)缓冲液:配制操作同实施例一，调节pH至 8.3;另配制相同的1倍TBE缓冲液，调节pH至8.0。
[0158] 余同实施例一。
[0159] 2.1琼脂糖凝胶(5g/L)制备
[0160] 本实验模具为1.5mm厚的6cmX 12cm，6孔梳，凝胶浓度为0.5%。
[0161] 清洗两套制胶模具及6cmX 12cm梳齿，晾干后摆放于平衡台上，并将梳齿插于模具 上，梳齿距模具短边约2.5cm。分别称取两份0.15g琼脂糖凝胶颗粒，倒入两个锥形瓶中，标 号"pH8.0组"、"pH8.3组"。量取pH8.0的TBE缓冲液30ml加入"pH8.0组"，再量取pH8.3的TBE 缓冲液30ml加入"pH8.3组"。两组分别于微波炉内中火加热煮胶lmin，取出，顺时针轻柔摇 匀，观察有无未溶解颗粒，若有，则重复煮胶一次。待凝胶完全溶解后加入对应TBE缓冲液， 定容至30ml。凝胶60min。
[0162] 2.2 电泳
[0163] 清洗两套电泳槽，标号"pH8.0组"、"pH8.3组"，分别倒入对应TBE缓冲液。轻柔缓 慢、平行拔去两套制胶模具的梳齿，取出凝胶板，放入对应组的电泳槽中，缓慢补加对应TBE 缓冲液至浸没凝胶上表面。分别取制备好的四种细胞样品（即1.3.3中制备好的细胞样品） 于台式离心机点离，上样适量（同实施例一），保持电泳液温度恒定在l〇°C~12°C，恒压 100V，至溴酸蓝指示带到达胶尾部(共约150~180min，"pH8.0组"约需150min，"pH8.3组"约 需180min，具体时间以溴酚蓝指示带到达胶尾部为准）。
[0164] 3、分离结果
[0165] 图6.1是琼脂糖凝胶电泳分离MDA-MB-231细胞LDH同工酶时不同pH的对比结果 (1. pH8.3、2. pH8.0)。由图6.1可见两组均分离效果佳，带性良好，pH8.3组LDH4完全电泳出 点样孔，便于定量分析，PH8.0组LDH4部分滞留与点样孔，不利于定量分析。
【主权项】
1. 乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法，其特征在于：电泳缓冲液是TBE缓冲液，所述TBE缓 冲液是Tris 10.8g、Na2EDTA· 2H20 0.744g、硼酸5.5g，加蒸馏水溶解，定容至1000ml制得。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述电泳分离方法包括琼脂糖凝胶电泳分 离方法和/或醋酸纤维薄膜电泳分离方法。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述电泳分离方法是琼脂糖凝胶电泳分离 方法，电泳温度10 °C~12 °C。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述电泳分离方法是琼脂糖凝胶电泳分离 方法，所述乳酸脱氢酶同工酶是人类肿瘤细胞乳酸脱氢酶同工酶时，电泳缓冲液pH=8.3; 所述乳酸脱氢酶同工酶是豚鼠组织细胞乳酸脱氢酶同工酶时，电泳缓冲液pH=9.2;所述乳 酸脱氢酶同工酶是大鼠组织细胞乳酸脱氢酶同工酶时，电泳缓冲液pH=8.0。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述人类肿瘤细胞是BT-549和/或ZR-75-30和/或A375和/或MDA-MB-231，所述大鼠组织是大鼠心和/或肝和/或肾和/或肺和/或小肠 和/或骨骼肌，所述豚鼠组织是豚鼠心和/或肝和/或肾和/或肺和/或肠和/或骨骼肌。6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述电泳分离方法是琼脂糖凝胶电泳分离 方法，10倍上样缓冲液是:溴酚蓝0.04g、1倍TBE缓冲液5ml、蔗糖10g，加热、溶解，冷却至室 温后加1倍TBE缓冲液定容至10ml。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述电泳分离方法是琼脂糖凝胶电泳分离 方法，电泳恒压100V;或者，所述电泳分离方法是醋酸纤维薄膜电泳分离方法，电泳恒压 150V〇8. 利用权利要求1所述的乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法实现的人类肿瘤细胞乳酸脱 氢酶同工酶电泳分离方法。9. 根据权利要求8所述的人类肿瘤细胞乳酸脱氢酶同工酶电泳分离方法，其特征在于： 所述人类肿瘤细胞是BT-549和/或ZR-75-30和/或A375和/或MDA-MB-231。 10 .TBE缓冲液在乳酸脱氢酶同工酶电泳分离中的应用，所述TBE缓冲液是Tris 10.8g、 Na2EDTA· 2H20 0.744g、硼酸5.5g，加蒸馏水溶解，定容至1000ml制得。
【文档编号】C12N9/04GK106085980SQ201610414248
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月13日 公开号201610414248.1, CN 106085980 A, CN 106085980A, CN 201610414248, CN-A-106085980, CN106085980 A, CN106085980A, CN201610414248, CN201610414248.1
【发明人】曾凡才, 李培娟, 张黎
【申请人】西南医科大学