谷氨酸脱氢酶的重组基因及其获取方法与应用
【专利摘要】本发明涉及谷氨酸脱氢酶的重组基因及其获取方法与应用。目前食品中高级醇降解的专一性较差，且限制了酸性条件高级醇的降解，菌体中酶产量低、耗时长、成本高，不能满足工业化生产。本发明将能够在酸性条件下高效降解高级醇的白地霉T3d329TF（Galactomyces geotrichum）菌株中的谷氨酸脱氢酶基因的保守区及全长序列进行克隆、表达和重组酶活性验证。本发明利用能够在酸性条件下降解正己醇和异戊醇的重组酶为催化剂定向降低食品中，尤其是酸性食品中的高级醇含量，安全环保，可控性强，生产成本低，适合大规模工业生产。CCTCC NO：M 20816720081021
【专利说明】
谷氨酸脱氢酶的重组基因及其获取方法与应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种酶的重组基因，具体涉及一种谷氨酸脱氢酶的重组基因及其获取 方法与应用。
【背景技术】
[0002] 高级醇也叫杂醇油，过量的高级醇会对人产生一定的毒害作用，从而损伤人的周 围神经系统、中枢神经系统、消化系统和生殖系统，对妊娠期的母体和胎儿也有伤害，和乳 房癌也有关系。高级醇对人体神经系统的麻醉作用是乙醇十几倍，它在体内的氧化速度比 乙醇慢，停留的时间也较长，因此有害健康。国家标准中严格限制了白酒中杂醇油的含量。 目前，正己醇已被列为能对人体产生危害的物质(HSDB，Hazardous Substances Data Bank )。定向降低高级醇含量对提高酒精饮料的安全性有重要意义。
[0003] 正己醇和异戊醇也是引起大豆豆腥味的最主要成份。豆腥味在豆浆、豆粉、豆腐及 其再制品中普遍存在。由于我国有几千年食用大豆的习惯，对豆腥味尚能勉强接受。日本、 欧美、及其南半球诸国的人们，对豆腥味甚为反感。大豆和豆制品是人类重要的蛋白质营养 源，但豆腥问题将制约豆制品生产的发展和我国豆制品在世界各国的推广。高级醇的种类、 浓度与葡萄酒、啤酒等的类型、口感和品质有很大的关系，如含量过高会给葡萄酒带来苦、 涩味;β-苯乙醇含量过高也会给葡萄酒带来不愉快的口感。高级醇含量超过l〇〇mg/L会使啤 酒口味和受欢迎程度明显降低。因此，定向降低高级醇含量对提高食品风味及接受度有很 大的影响。
[0004] 目前，能够催化高级醇转化的方法多为化学转化，但化学转化途径因太过粗放，没 有特定的专一性，化学污染较严重，高级醇转化为相应的酯和醛等的分子催化剂难以获得， 且催化效率有待提高，潜在的不安全因素等缺点不被食品行业所接受。还通过选育酵母或 控制形成相关的因素及膜过滤控制高级醇含量，但乙醇及其他香气成分含量也同时降低。 菌体中的酶产量较低、耗时长、成本高，不适合工业化生产。
[0005] 酶法降解食品中高级醇含量，可以避免有毒有害物质的残留问题，反应速度快，生 产过程可控制性强，专一性强，具有很好的应用前景。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种谷氨酸脱氢酶的重组基因及其获取方法与应用，能够在 酸性条件下定向降解食品中的高级醇。
[0007] 本发明所采用的技术方案是： 谷氨酸脱氢酶重组基因的获取方法，其特征在于： 由以下步骤实现： 步骤一：提取白地霉geoiricAt//?) T3d329TF菌株的总RNA，并合成 cDNA； 步骤二:对谷氨酸脱氢酶基因的保守区及全长序列进行克隆： 步骤三:对谷氨酸脱氢酶基因的保守区和全长序列进行表达，包括重组表达载体的构 建和酶基因在大肠杆菌中的诱导表达。
[0008] 步骤一中，白地霉geoi_ricAt/?)T3d329TF菌株的培养方法由以下 步骤实现： (1) 将白地霉（geoi_ricAt/?)T3d329TF菌株接种于液体培养基中，在28 °C、160rpm的条件下培养18h后，按2.0%的接种量转入液体培养基中，在28 °C、160rpm的条件 下扩大培养38h; 所述液体培养基为土豆汁葡萄糖液体培养基，配方为:20%的马铃薯浸汁1000mL，葡萄 糖20g，pH自然； (2) 所得培养物在5000rpm、4°C下离心10min，收集菌体，并用无菌水重新悬浮和离心， 重复5次，最后在8000rpm、4°C下离心10min，收集湿菌体，用MSM培养基28°C、160rpm下诱导 处理6h后，在5000rpm、4°C下离心10min，收集菌体，无菌水清洗5次，最后在8 000 r/m、4 °C 下离心10 min，收集菌体； 所述MSM培养基为无机盐培养基，配方为:MgS04.7H20 0.5g，KH2P〇4 1.0g，NH4N03 1.0 g，6.67g/L CaCl2溶液3mL，17 g/L的FeCl3溶液3mL，FeS〇4.7H20 0.05g，NaN03 l.Og，蒸馏水 1 000mL〇
[0009] 步骤二中： 保守区扩增引物为： ⑶H-F1 5'-GGATCCACGCCGCTCAAGGTC-3' BamHI； ⑶H-R1 5 '-AAGCTTTACCAAGAAATCACCGTGGTC-3 ' Hindm； 全长序列扩增引物为： ⑶H-F2 5'-CGGGATCCATCAAAATGGTCCAGCCTTCC-3' BamHI； ⑶H-R2 5'-CCCAAGCTTTTACCAGAAATCACCGTGGTCG-3' Hindm； PCR扩增体系为
PCR反应条件为： 保守区的反应条件:预变性95°C，5 min;变性温度94°C，30s;退火温度55.6°C和58.0 °(：，3〇8;延伸温度72°(：，1:3〇1^11;35个循环后，72°(：延伸1〇1^11 ; 全长序列的反应条件:预变性95°C，3 min;变性温度94 °C，30 s;退火温度58.0°C，30 s;延伸温度72°C，1 min;33个循环后，72°C修复延伸7 min。
[0010] 步骤三中： 重组表达载体的构建包括以下步骤： PCR扩增产物回收后与pMD19-T连接(pMD19-T-658-GDH(保守区）和pMD19-T-1359-⑶Η (全长序列））并转化i cWi DH5a感受态细胞，挑取阳性菌落，提质粒PCR检测后，阳性克隆 已测序;然后对重组T载体(pMD19-T-658-GDH(保守区）和pMD19-T-1359-GDH(全长序列））和 表达载体(pET-28as)进行了 BamHI和Hindm双酶切； 酶切反应体系为：
之后，置于37 °C反应过夜，进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带，用Omega凝胶 回收试剂盒纯化;然后连接表达载体，将酶切后的目的片段和表达载体进行连接； 连接反应体系为：
16°C连接过夜，将构建好的重组表达载体分别命名为pET-28as-658-GDH(保守区）和 pET-28as_1359⑶Η(全长序列）。重组表达载体转化[co2iDH5a感受态细胞，提质粒PCR和双 酶切检测后，阳性克隆测序验证； 谷氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的诱导表达： 将重组表达载体转化ico2iBL21(DE3)感受态细胞，从转化平板上分别挑取含有重组 表达载体pET-28as-658-GDH(保守区）、pET-28as-1359-GDH(全长序列）的重组菌和含空载 体的对照菌，接种于含有50yg/mL Kan的表达培养基中，37°C，180r/min培养过夜。然后以 10%的接种量转接到装有30mL表达培养基(2 XYT)的lOOmL三角瓶中，37°C，180 r/m培养至 0D600为0.6-1.0，补加24yg/mL Kan，并加入IPTG至终浓度0. lmmol/L，180r/m，低温25 °C诱 导7h ; 4 °C，12000 X g离心5min，收集菌体；用PBS悬浮细胞，冰水浴中超声波破碎5min (200W，工作3s，歇58，120次），12000\8离心1511^11，收集上清液测定谷氨酸脱氢酶对正己醇 的活性，并进行SDS-PAGE检测；以转化空质粒pET-28as的重组菌BL21(DE3)/pET28as作为对 照。
[0011] 所述的获取方法获得的谷氨酸脱氢酶重组基因。
[0012] 所述的谷氨酸脱氢酶重组基因定义的谷氨酸脱氢重组酶。
[0013] 所述的谷氨酸脱氢重组酶在定向降低食品中高级醇含量方面的应用。
[0014] 本发明具有以下优点： 本发明操作简单、转化速率快、生产时间短、产量高、安全环保、生产成本低，利用白地 霉的谷氨酸脱氢酶基因为基础，采用基因工程的手段，快速获得能够在酸性条件下高效降 解正己醇和异戊醇的谷氨酸脱氢酶;利用酶法生物转化高级醇，可在数小时之内完成反应， 降解效率高;利用酶法生物转化高级醇，可以摆脱生物细胞生长状况对产物得率的影响，可 控性强;利用酶法转化高级醇，安全性高、专一性强，是一种可工业化大规模定向降低食品 中高级醇的酶学方法，为工业中高级醇的定向降低提供新的思路和途径。
【附图说明】
[0015] 图1为菌体T3d329TF中总RNA及保守区和全长序列扩增图。
[0016] 图中，M: DNA Marker;(左）1，2总RNA (右）1，2保守区基因扩增产物；3,4全长基 因扩增产物。
[0017] 图2为重组蛋白表达形式的鉴定。
[0018] 图3为Ni柱纯化后重组酶的SDS-PAGE电泳图。
[0019] 图中，a:五.co2iBL21(DE3)/pET-28as-GDH-658;b:五.co2iBL21(DE3)/pET-28as- GDH-1359 ; Μ:蛋白标准；50 mM:纯化的重组酶(保守区），如箭头所指；120 mM:纯化重组酶 (全长基因），如箭头所指;28as，对照菌[C02iBL21 (DE3)/pET-28as的全蛋白。
[0020] 图4为Western印记检测。
[0021] 图中，l:28as，对照菌五.co^iBL21(DE3)/pET-28as的全蛋白；2:重组菌五. Co2iBL21(DE3)/pET-28as-GDH-658细胞破碎液上清；3:纯化后基因保守区的重组酶 ;4:重 组菌五.co^iBL21 (DE3)/pET-28as-GDH-1359细胞破碎液上清;5:纯化后基因全长序列的重 组酶.箭头所指为目标蛋白。
[0022] 图5为切除SUM0融合标签。
[0023] 图中，a:重组菌五.co^iBL21(DE3)/pET-28as-GDH-1359细胞破碎液上清;M:蛋白 标准；l，28as，对照菌五.co^iBL21(DE3)/pET-28as的全蛋白；2:重组菌五.co^iBL21(DE3)/ pET-28as-⑶H-1359全蛋白；3:重组菌五.co^iBL21 (DE3) /pET-28as-⑶H-1359细胞破碎液 上清;4:全长序列细胞破碎液上清和被SUM0蛋白酶切掉的SUM0标签。B:纯化的全长序列的 重组酶山纯化的所得酶和被SUM0蛋白酶切掉的SUM0标签。
[0024]图6为重组酶和菌体酶的活性比较。
[0025]图7为重组酶催化正己醇和异戊醇转化产物的GC-MS分析。
[0026] 图8为重组蛋白的底物特异性。
[0027] 图9为表达载体pET-28as-658-GDH的构建。
[0028] 图10为表达载体pET-28as_l 359-GDH的构建。
【具体实施方式】
[0029]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细的说明。
[0030] 本发明涉及的谷氨酸脱氢酶重组基因的获取方法，由以下步骤实现： 步骤一：提取白地霉野ces geoiricA_)T3d329TF(CCTCC Ν0:Μ 208167)菌株 的总RNA，并合成cDNA; 所述白地霉野ces geoiricA應)T3d329TF于2008年10月21日保藏于中国典型 培养物保藏中心，地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，保藏编号为CCTCC Ν0：Μ 208167〇
[0031] 步骤二:对谷氨酸脱氢酶基因的保守区及全长序列进行克隆，获得酶开放阅读框 GenBank 登录号为 KJ442577: 步骤三:对谷氨酸脱氢酶基因的保守区和全长序列进行表达，包括重组表达载体的构 建和酶基因在大肠杆菌中的诱导表达。
[0032] 步骤一中，白地霉（iWacioffijces geoi_ricAt/?)T3d329TF菌株的培养方法由以下 步骤实现： (1) 将白地霉（geoi_ricAt/?)T3d329TF菌株接种于液体培养基中，在28 °C、160rpm的条件下培养18h后，按2.0%的接种量转入液体培养基中，在28 °C、160rpm的条件 下扩大培养38h; 所述液体培养基为土豆汁葡萄糖液体培养基，配方为:20%的马铃薯浸汁1000mL，葡萄 糖20g，pH自然； (2) 所得培养物在5000rpm、4°C下离心10min，收集菌体，并用无菌水重新悬浮和离心， 重复5次，最后在8000rpm、4°C下离心10min，收集湿菌体，用MSM培养基28°C、160rpm下诱导 处理6h后，在5000rpm、4°C下离心10min，收集菌体，无菌水清洗5次，最后在8 000 r/m、4 °C 下离心10 min，收集菌体； 所述MSM培养基为无机盐培养基，配方为:MgS04.7H20 0.5g，KH2P〇4 1.0g，NH4N03 1.0 g，6.67g/L CaCl2溶液3mL，17 g/L的FeCl3溶液3mL，FeS〇4.7H20 0.05g，NaN03 l.Og，蒸馏水 1 000mL〇
[0033] 步骤一中，提取总RNA的提取方法参照生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式 真菌总RNA抽提纯化试剂盒说明进行，cDNA合成采用Invitrogen公司的Superscrip First-Strand cDNA Synthesis System for qRT-PCR 试剂盒进行。
[0034] 步骤二中： 保守区扩增引物为： ⑶H-F1 5'-GGATCCACGCCGCTCAAGGTC-3' BamHI； ⑶H-R1 5 '-AAGCTTTACCAAGAAATCACCGTGGTC-3 ' Hindm； 全长序列扩增引物为： ⑶H-F2 5'-CGGGATCCATCAAAATGGTCCAGCCTTCC-3' BamHI； ⑶H-R2 5'-CCCAAGCTTTTACCAGAAATCACCGTGGTCG-3' Hindm； PCR扩增体系为
PCR反应条件为： 保守区的反应条件:预变性95°C，5 min;变性温度94°C，30s;退火温度55.6°C和58.0 °(：，3〇8;延伸温度72°(：，1:3〇1^11;35个循环后，72°(：延伸1〇1^11 ; 全长序列的反应条件:预变性95°C，3 min;变性温度94 °C，30 s;退火温度58.0°C，30 s;延伸温度72°C，1 min;33个循环后，72°C修复延伸7 min。
[0035] 步骤三中： 重组表达载体的构建包括以下步骤： 重组表达载体的构建包括以下步骤： PCR扩增产物回收后与pMD19-T连接(pMD19-T-658-GDH(保守区）和pMD19-T-1359-⑶Η (全长序列））并转化i cWi DH5a感受态细胞，挑取阳性菌落，提质粒PCR检测后，阳性克隆 已测序;然后对重组T载体(pMD19-T-658-GDH(保守区）和pMD19-T-1359-GDH(全长序列））和 表达载体(pET-28as)进行了 BamHI和Hindm双酶切； 酶切反应体系为：
之后，置于37 °C反应过夜，进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带，用Omega凝胶 回收试剂盒纯化;然后连接表达载体，将酶切后的目的片段和表达载体进行连接； 连接反应体系为：
16°C连接过夜，将构建好的重组表达载体分别命名为pET-28as-658-GDH(保守区）和 pET-28as_1359⑶Η(全长序列）。重组表达载体转化[co2iDH5a感受态细胞，提质粒PCR和双 酶切检测后，阳性克隆测序验证。
[0036]谷氨酸脱氢酶基因在大肠杆菌中的诱导表达： 将重组表达载体转化ico2iBL21(DE3)感受态细胞，从转化平板上分别挑取含有重组 表达载体pET-28as-658-GDH(保守区）、pET-28as-1359-GDH(全长序列）的重组菌和含空载 体的对照菌，接种于含有50yg/mL Kan的表达培养基中，37°C，180r/min培养过夜。然后以 10%的接种量转接到装有30mL表达培养基(2 XYT)的100mL三角瓶中，37°C，180 r/m培养至 0D600为0.6-1.0，补加24yg/mL Kan，并加入IPTG至终浓度0. lmmol/L，180r/m，低温25 °C诱 导7h ; 4 °C，12000 X g离心5min，收集菌体；用PBS悬浮细胞，冰水浴中超声波破碎5min (200W，工作3s，歇58，120次），12000\8离心1511^11，收集上清液测定谷氨酸脱氢酶对正己醇 的活性，并进行SDS-PAGE检测；以转化空质粒pET-28as的重组菌BL21(DE3)/pET28as作为对 照。
[0037] 重组酶活性鉴定： (1)重组酶表达形式鉴定。分别取适量诱导的重组菌体及经诱导的含空载体的对照菌 体，经超声波破碎后，分别取细胞破碎液的上清和沉淀经尿素处理后（Susana et al. 2006)的样品，进行SDS-PAGE电泳(方法1)，并测定正己醇降解活性(方法2)，确定酶的表达 形式。
[0038] (2)重组酶和菌体酶的活性比较。测定重组酶上清(粗酶液）、Ni柱纯化后重组酶、 菌体T3d329TF粗酶及柱层析纯化后纯酶的活性，酶活测定方法同方法2。
[0039] (3)重组酶的底物特异性 以正丙醇、正丁醇、异丁醇、正己醇、异戊醇、谷氨酸和酮戊二酸为底物，酶活测定按 方法2和方法3进行。
[0040] (4)切除SUM0融合标签。取200 yL的重组酶上清(粗酶液)及经Ni-NTA纯化后的纯 酶，加入SUM0蛋白酶1 yL，4 °C条件下，酶切16 h后，SDS-PAGE电泳分析酶切的效果，确定表 达的蛋白是否是目标蛋白。
[0041 ] 方法1高级醇脱氢酶的分子量分析。用Native-PAGE电泳分析其活性酶的整体分子 量。电泳方法参照2.2.6.3进行，测定高级醇脱氢酶的整分子量;垂直板SDS-PAGE电泳参照 Laemml i (1970 )的方法，测定酶的亚基分子量。SDS-PAGE的分析条件为：12%分离胶，5%浓缩 胶，电泳条件：电压200 V，浓缩胶电流10 mA，分离胶电流20 mA。电泳完毕后用考马斯亮蓝 尺-250染色，染色剂配制同2.2.6.3。脱色液:单蒸水67 1^，乙醇25 1^，冰醋酸8 111匕脱色完 毕后用Bio-Rad凝胶成像仪照相。
[0042] 方法2反应体系:含高级醇10 mL柠檬酸缓冲溶液(pH4.0,0.1 mol/L)，所用高级醇 为正丙醇、正丁醇、异丁醇、正己醇和异戊醇，初始浓度为20 mmol/L。酶液用量1 mL。反应条 件：28 °C、160 r/m恒温反应1 h。反应结束后，用气相色谱检测反应体系中的高级醇残留 量。
[0043] 试验方法:测定酶液的高级醇降解活性时，直接在上述反应体系中加入1 mL酶液 进行反应;对照均为用lmL梓檬酸缓冲溶液(pH4.0，0.1 mol/L)代替酶液的反应体系。
[0044] 方法3(1)分光光度计测定。谷氨酸和α-酮戊二酸的测定均在30 °C下进行。参照 Choudhury和Punekar(2009)的方法进行测定及数据分析，谷氨酸脱氢酶活性表示为A340 rim条件下的NADP(H)吸光值的变化。单位降解活性(U)定义为每分钟每毫克蛋白还原/氧化 1 ymolNADP+/NADPH。
[0045] (2)试验条件:色谱柱：岛津Wondasil型C18色谱分析柱(250 X4.6 mm);检测器:紫 外检测器;检测波长:215 nm;柱温:30 °C;进样量:20 yL;流动相:含1%色谱级乙酸的水溶 液：甲醇=95:5。流动相口!1:2.5;流速 :111117111；[11。
[0046] 实施例1: 步骤一:菌体制备： 将白地霉CCTCC NO:Μ 208167菌株接种于土豆汁葡萄糖液体培养基(20%的马铃薯浸汁 1000mL，葡萄糖20 g，pH自然）中，在28°C、160 rpm的条件下培养18h，按2.0%的接种量接入 上述培养基中扩大培养，条件同上，培养时间为38h，所得培养物在5000rpm，4°C下离心 10min，收集菌体，并用无菌水重新悬浮和离心，重复5次，最后在8000rpm，4°C下离心10min， 收集湿菌体，用MSM培养基28°C，160rpm下诱导处理6h后，在5000rpm，4°C下离心10min，收集 菌体，无菌水清洗5次，最后在8 000 r/m，4 °C下离心10 min，收集菌体提取总RNA。
[0047] 步骤二:菌体总RNA提取： 菌体中总RNA提取方法按照生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式真菌总RNA抽提 纯化试剂盒说明进行，采用1%溴化乙锭凝胶（180V，10min)检测完整性，Q5000微量紫外分光 光度计测定Α26〇Γ?/28(ν值和RNA含量。
[0048] 实验结果:总RNA质量较好，28S、18S和5S的条带比较完整，28S和18S的比值在1-2: 1之间；其A260nm/A280nm值为1 · 97，在1 · 8-2 · 0之间，含量926 yg/mL，RNA纯度较高。
[0049] 实施例2: 步骤一:菌体制备： 同实施例1。
[0050] 步骤二:保守区和全长序列的克隆： ① 保守区扩增引物： ⑶H-F1 5'-GGATCCACGCCGCTCAAGGTC-3' BamHI ⑶H-R1 5 '-AAGCTTTACCAAGAAATCACCGTGGTC-3 ' Hindm 全长序列扩增引物： ⑶H-F2 5'-CGGGATCCATCAAAATGGTCCAGCCTTCC-3' BamHI ⑶H-R2 5 '-CCCAAGCTTTTACCAGAAATCACCGTGGTCG-3 ' Hindm ② 谷氨酸脱氢酶基因的保守区和全长序列的PCR扩增体系
③ PCR反应条件 保守区的反应条件:预变性95 °C，5 min;变性温度94 °C，30 s;退火温度55.6 °C和 58.0°(：，3〇8;延伸温度72°(：，1:3〇111丨11;35个循环后，72°(：延伸1〇11^11。
[0051 ] 全长序列的反应条件:预变性95 °C，3 min;变性温度94 °C，30 s;退火温度58.0 °C，30 S;延伸温度72 °C，1 min;33个循环后，72 °C修复延伸7 min。
[0052] 采用1%琼脂糖电泳检测（120V，30-60min)，生工生物工程(上海)股份有限公司测 序。
[0053] 实验结果:PCR扩增，获得目的片段分别为658 bp和1359 bp，测序验证正确。
[0054] 实施例3: 步骤一:菌体制备： 同实施例1。
[0055]步骤二:酶基因保守区和全长序列的表达： (l)PCR 扩增产物回收后与 pMD19-T 连接(pMD19-T-658-GDH(保守区）和 pMD19-T-1359-⑶Η(全长序列））并转化DH5a感受态细胞，挑取阳性菌落，提质粒PCR检测后，阳性克 隆已测序。然后对重组T载体(pMD19-T-658-GDH(保守区）和pMD19-T-1359-GDH(全长序列）） 和表达载体(pET-28as )进行了 BamHI和Hindm双酶切。
[0056] (2)置于37 °C反应过夜，进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带，用Omega凝 胶回收试剂盒纯化。然后连接表达载体，将酶切后的目的片段和表达载体进行连接。
[0057] 16°C连接过夜。将构建好的重组表达载体分别命名为pET-28as-658-GDH(保守区） 和pET-28as_1359⑶Η(全长序列）。重组表达载体转化[co2iDH5a感受态细胞，提质粒PCR和 双酶切检测后，阳性克隆测序验证。
[0058] (3)将重组表达载体转化iC〇2iBL21(DE3)感受态细胞。从转化平板上分别挑取含 有重组表达载体pET-28as-658-GDH(保守区）、pET-28as-1359-GDH(全长序列）的重组菌和 含空载体的对照菌，接种于含有50 yg/mL Kan的表达培养基中，37 °C，180 r/min培养过 夜。然后以10%的接种量转接到装有30 mL表达培养基(2 XYT)的100 mL三角瓶中，37 °C， 180 r/m培养至0D600为0.6-1.0,补加24 yg/mL Kan，并加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L，180 r/m，低温25 °C诱导7 hj °C，12 OOOXg离心5 min，收集菌体。用PBS悬浮细胞，冰水浴中 超声波破碎5 min(200 W，工作3 s，歇5 s，120次），12 OOOXg离心15 min，收集上清液备 用。以转化空质粒pET-28as的重组菌BL21(DE3)/pET28as作为对照。
[0059] 采用1%琼脂糖电泳检测连接效果，SDS-PAGE分析表达产物，气相色谱仪分析正己 醇降解量:同实施例2。
[0060] 实验结果： 基因保守区和全长序列成功转入表达菌[cWiBL21(DE3)，且高效可溶表达。
[0061 ] 实施例5: 步骤一:菌体制备： 同实施例1。
[0062] 步骤二:重组酶活性鉴定： (1)分别取适量诱导的重组菌体及经诱导的含空载体的对照菌体，经超声波破碎后，分 别取细胞破碎液的上清和沉淀经尿素处理后(Susana et al. 2006)的样品，进行SDS-PAGE 电泳(方法1)，并测定正己醇降解活性(方法2)，确定酶的表达形式。
[0063] (2)重组酶和菌体酶的活性比较。测定重组酶上清(粗酶液）、Ni柱纯化后重组酶、 菌体T3d329TF粗酶及柱层析纯化后纯酶的活性，酶活测定方法2。
[0064] (3)重组酶的底物特异性。以正丙醇、正丁醇、异丁醇、正己醇、异戊醇、谷氨酸和α- 酮戊二酸为底物，酶活测定方法2和3。
[0065] (4)切除SUM0融合标签。取200 yL的重组酶上清(粗酶液)及经Ni-NTA纯化后的纯 酶，加入SUM0蛋白酶1 yL，4 °C条件下，酶切16 h后，SDS-PAGE电泳分析酶切的效果，确定表 达的蛋白是否是目标蛋白。
[0066]采用SDS-PAGE和气相色谱仪分析蛋白分布和高级醇降解量:同实施例4。
[0067]实验结果： 对所得基因实现高效可溶表达，活性组分主要在上清部分;基因保守区和全长序列的 表达产物分别为24.3和50.3 kDa;两个表达产物均具有高级醇和谷氨酸催化活性，且基因 保守区的表达产物活性高于基因全长序列的表达产物活性。
[0068]本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书 而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1. 谷氨酸脱氨酶重组基因的获取方法，其特征在于： 由W下步骤实现： 步骤一：提取白地霉（GaJaciomjces T3d329TF菌株的总RNA，并合成 cDNA； 步骤二:对谷氨酸脱氨酶基因的保守区及全长序列进行克隆： 步骤Ξ:对谷氨酸脱氨酶基因的保守区和全长序列进行表达，包括重组表达载体的构 建和酶基因在大肠杆菌中的诱导表达。2. 根据权利要求1所述的谷氨酸脱氨酶重组基因的获取方法，其特征在于： 步骤一中，白地霉（GaJaciomjces geoiricAt/m)T3d329TF菌株的培养方法由W下步骤 实现： (1) 将白地霉（GaJaciomjces geoiricAt/m)T3d329TF菌株接种于液体培养基中，在28 °C、leOrpm的条件下培养1她后，按2.0%的接种量转入液体培养基中，在28°C、160巧m的条件 下扩大培养38h; 所述液体培养基为上豆汁葡萄糖液体培养基，配方为：20%的马铃馨浸汁lOOOmL，葡萄 糖20g，抑自然； (2) 所得培养物在5000巧m、4 °C下离屯、lOmin，收集菌体，并用无菌水重新悬浮和离屯、， 重复5次，最后在8000巧m、4°C下离屯、lOmin，收集湿菌体，用MSM培养基28°C、160巧m下诱导 处理化后，在5000rpm、4°C下离屯、lOmin，收集菌体，无菌水清洗5次，最后在8 000 r/m、4 °C 下离屯、10 min,收集菌体； 所述MSM培养基为无机盐培养基，配方为:MgS04.7此0 0.5g，K出P〇4 1.0g，NH4N〇3 1.0 g，6.67g/L CaCb溶液3血，17 g/L的化Cl3溶液3血，FeS〇4.7出0 0.05g，NaN〇3 l.Og，蒸馈水 1 OOOmLo3. 根据权利要求1所述的谷氨酸脱氨酶重组基因的获取方法，其特征在于： 步骤二中： 保守区扩增引物为： GDH-F1 5 '-GGATCCACGCCGCTCAAGGTC-3 ' BamHI； GDH-R1 5'-AAGCTTTACCAAGAAATCACCGTGGTC-3' Hind虹； 全长序列扩增引物为： GDH-F2 5'-CGGGATCCATCAAAATGGTCCAGCCTTCC-3' BamHI； GDH-R2 5'-CCCAAGCTTTTACCAGAAATCACCGTGGTCG-3' Hind虹； PCR扩增体系为PCR反应条件为： 保守区的反应条件:预变性95°C，5 min;变性溫度94°C，30s ;退火溫度55.6°C和58.0 °(：，3〇3;延伸溫度721：，1:3〇111111;35个循环后，72°(：延伸1〇111111; 全长序列的反应条件:预变性95°C，3 min;变性溫度94 °C，30 S;退火溫度58.0°C，30 S;延伸溫度72°C，1 min;33个循环后，72°C修复延伸7 min。4.根据权利要求1所述的谷氨酸脱氨酶重组基因的获取方法，其特征在于： 步骤二中： 重组表达载体的构建包括W下步骤： PCR 扩增产物回收后与 PMD19-T 连接（PMD19-T-658-GDH(保守区）和 PMD19-T-1359-GDH (全长序列））并转化怎.0册〇感受态细胞，挑取阳性菌落，提质粒PCR检测后，阳性克隆 已测序;然后对重组T载体(PMD19-T-658-GDH(保守区）和PMD19-T-1359-GDH(全长序列））和 表达载体(pET-28as)进行了 BamHI和化nd虹双酶切； 酶切反应体系为：之后，置于37 °C反应过夜，进行1%琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的条带，用Omega凝胶 回收试剂盒纯化;然后连接表达载体，将酶切后的目的片段和表达载体进行连接； 连接反应体系为：16°C连接过夜，将构建好的重组表达载体分别命名为pET-28as-658-GDH(保守区）和 pET-28as-l359GDH(全长序列）；重组表达载体转化凡coJiD册α感受态细胞，提质粒PCR和双 酶切检测后，阳性克隆测序验证； 谷氨酸脱氨酶基因在大肠杆菌中的诱导表达： 将重组表达载体转化i?.co^^21(DE3)感受态细胞，从转化平板上分别挑取含有重组 表达载体祀T-28as-658-GDH(保守区）、pET-28as-1359-GDH(全长序列）的重组菌和含空载 体的对照菌，接种于含有50yg/mL Kan的表达培养基中，37°C，180r/min培养过夜；然后W !〇〇/〇的接种量转接到装有30血表达培养基(2 XYT)的100血Ξ角瓶中，37°C，180 r/m培养至 0D600为0.6-1.0，补加24yg/mL Kan，并加入IPTG至终浓度0.1 mmol/L，180r/m，低溫25 °C诱 导化；4 °C，12000 X g离屯、5min，收集菌体；用PBS悬浮细胞，冰水浴中超声波破碎5min (200W，工作3s，歇5s，120次），12000 Xg离屯、15min，收集上清液测定谷氨酸脱氨酶对正己醇 的活性，并进行SDS-PAGE检测；W转化空质粒祀T-28as的重组菌化2UDE3)/祀T28as作为对 照。5. 根据权利要求1所述的获取方法获得的谷氨酸脱氨酶重组基因。6. 根据权利要求5所述的谷氨酸脱氨酶重组基因定义的谷氨酸脱氨重组酶。7. 根据权利要求6所述的谷氨酸脱氨重组酶在定向降低食品中高级醇含量方面的应 用。
【文档编号】C12N15/10GK106085977SQ201610400139
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月8日
【发明人】师俊玲, 朱静, 徐晓光
【申请人】西北工业大学