一种斜盖菇的保藏方法
【专利摘要】本发明涉及一种斜盖菇的保藏方法，其工艺为：首先将斜盖菇菌丝体与海藻酸钠溶液混合，然后将其滴入到氯化钙溶液中制成小球，最后将该小球放入到纯化水中，在0～4℃温度条件下保藏。本发明提供的斜盖菇的保藏方法能够在保证菌种存活的同时大大延长斜盖菇Clitopilus prunulus的保藏时间，对截短侧耳素及其衍生物的生产和研究具有积极的促进作用。
【专利说明】
_种斜盖薛的保藏方法
技术领域
[0001 ]本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种斜盖燕Clitopilus prunulus的 保藏方法。
【背景技术】
[0002] 斜盖燕Clitopilus prunulus属于担子菌纲、伞菌目、伞菌科、斜盖燕属。该真菌产 生的截短侧耳素可用于合成泰妙菌素。泰妙菌素是新型的抗生素，对革兰氏阳性菌和支原 体具有显著的抑制作用，抗菌能力强、抗菌谱广、毒副作用小、不易产生耐药性。
[0003] 目前，国内保藏斜盖燕Clitopilus prunulus常采用液体石錯保藏法和低温斜面 保藏法。这两种方法存在的不足主要有以下几点：
[0004] 1、液体石蜡对菌体有毒害作用，容易造成菌种死亡。
[0005] 2、液体石蜡会粘附在菌种表面，该方法培养的一代斜面颜色偏灰、长势较差，有时 需要传二代斜面才能正常使用。
[0006] 3、低温斜面保藏法保藏周期仅为1~3个月，保藏时间短。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于克服上述现有技术中的缺陷，提供一种可实现斜盖菇长期、稳 定保藏的斜盖菇的保藏方法。
[0008] 为实现上述目的所采取的技术方案为：
[0009] -种斜盖菇的保藏方法，其特征在于:首先将斜盖菇菌丝体与海藻酸钠溶液混合， 然后将其滴入到氯化钙溶液中制成小球，最后将该小球放入到纯化水中，在〇~4°C温度条 件下保藏。
[0010] 所述斜盖菇菌丝体与海藻酸钠溶液的配比关系为，每lg菌丝体加入5~10ml海藻 酸钠溶液。
[0011] 所述海藻酸钠溶液组成为:鹿糖13.69%，甘油18.4%，海藻酸钠8~12%，其余为 水，pH=6.8~7.0,以质量体积浓度计。
[0012]所述氯化妈溶液组成为:鹿糖13.69%，甘油18.4%，氯化钙1~5%，其余为水，pH =6.8~7.0，以质量体积浓度计。
[0013] 所述海藻酸钠溶液与氯化钙溶液的配比关系为，每lmL海藻酸钠溶液对应使用8~ 10mL氯化钙溶液。
[0014] 本发明提供的斜盖菇的保藏方法能够在保证菌种存活的同时大大延长斜盖菇 Clitopilus prunulus的保藏时间，对截短侧耳素及其衍生物的生产和研究具有积极的促 进作用。
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例对本发明做进一步详细描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0016] 实施例1
[0017] 斜盖燕Clitopilus prunulus纯化水包埋保藏方法如下：
[0018] 1)收集菌丝体：
[0019] 将斜盖菇Clitopilus prunulus，批号TMI14-469(菌种由宁夏泰瑞制药股份有限 公司，种子室提供），接种在液体PDA培养基中，24~26°C，220~240r/min，振荡培养4d(此 时，斜盖燕〇1;11:〇卩;[1118卩1'1111111118处于对数生长期末期）。取上述种子液301111^于501111^无菌离 心管中，3500r/min，离心10min。弃上清，沉淀即为菌丝体，质量为8~10g。
[0020] 2)包埋试剂的制备：
[0021] 海藻酸钠溶液:鹿糖13.69% (w/v)+甘油18.4% (w/v)+海藻酸钠9% (w/v)，配制 50mL〇
[0022] 氯化f丐溶液：鹿糖 13.69% (w/v)+甘油 18.4%(w/v)+氯化f丐 1 · 11% (w/v)，配制 1 瓶，400mL。
[0023] 将上述两种溶液调节pH=6.8~7.0; 121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0024] 3)包埋小球的制备：
[0025]用刀片将5mL移液枪头口径加工成2mm，121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0026]用无菌铲子将菌丝体全部转移至盛有海藻酸钠溶液的瓶子中，充分混匀，制成混 合液。
[0027]调节5mL移液枪量程至3mL，安装好上述枪头后吸取包埋液(菌丝体和海藻酸钠混 合液），将包埋液逐滴加入到氯化钙溶液中，期间轻微摇动氯化钙试剂瓶，防止小球粘连。全 部滴加完毕后，静置20min，使小球表面硬化。
[0028]将硬化后的小球加入到盛有无菌纯化水的小试管中，使纯化水液面至少高于小球 1 cm，封口编号后置于0~4 °C冰箱中保存。
[0029] 经验证，保藏18个月后，包埋小球制备的斜面外观正常，菌丝白色，生长均匀，效价 无明显降低(p>〇.〇5)。
[0030] 纯化水包埋保藏法验证结果：
[0031]
[0032] 实施例2
[0033] 斜盖燕Clitopilus prunulus纯化水包埋保藏方法如下：
[0034] 1)收集菌丝体：
[0035] 将斜盖菇Cl i topi lus prunulus，批号TMI14-469 (菌种由宁夏泰瑞制药股份有限 公司，种子室提供），接种在液体PDA培养基中，24~26°C，220~240r/min，振荡培养4d(此 时，斜盖燕〇1;11:〇卩;[1118卩1'1111111118处于对数生长期末期）。取上述种子液281111^于501111^无菌离 心管中，3000r/min，离心10min。弃上清，沉淀即为菌丝体，质量为8~10g。
[0036] 2)包埋试剂的制备：
[0037] 海藻酸钠溶液:鹿糖13.69% (w/v)+甘油18.4% (w/v)+海藻酸钠11% (w/v)，配制 50mL〇
[0038] 氯化钙溶液:蔗糖13.69%(?八)+甘油18.4%(?八)+氯化钙1.5%(?八），配制2瓶， 每瓶200mL。
[0039] 将上述这两种溶液调节pH=6 · 8~7 · 0; 121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0040] 3)包埋小球的制备：
[00411用刀片将5mL移液枪头口径加工成3mm，121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0042] 无菌铲子将菌丝体全部转移至盛有海藻酸钠溶液的瓶子中，充分混匀，制成混合 液。
[0043] 调节5mL移液枪量程至2.5mL，安装好上述枪头后吸取包埋液，将包埋液(菌丝体和 海藻酸钠混合液)逐滴加入到氯化钙溶液中，每瓶氯化钙溶液加入20~25mL包埋液，静置 30min，使小球表面硬化。
[0044] 将硬化后的小球加入到盛有无菌纯化水的小试管中，使纯化水液面至少高于小球 1 cm，封口编号后置于0~4 °C冰箱中保存。
[0045] 经验证，保藏18个月后，包埋小球制备的斜面外观正常，菌丝白色，生长均匀，效价 无明显降低(p>〇.〇5)。
[0046] 纯化水包埋保藏法验证结果：
[0047]
[0048] 实施例3
[0049] 斜盖菇Clitopilus prunulus纯化水包埋保藏方法如下：
[0050] 1)收集菌丝体：
[0051 ] 将斜盖菇Clitopilus prunulus，批号TMI12-1096(菌种由宁夏泰瑞制药股份有限 公司，种子室提供），接种在液体PDA培养基中，24~26°C，220~240r/min，振荡培养3d(此 时，斜盖燕〇1;11:〇卩;[1118卩1'1111111118处于对数生长期末期）。取上述种子液301111^于501111^无菌离 心管中，3000r/min，离心15min。弃上清，沉淀即为菌丝体，质量为9~10g。
[0052] 2)包埋试剂的制备：
[0053] 海藻酸钠溶液:鹿糖13.69% (w/v)+甘油18.4% (w/v)+海藻酸钠12% (w/v)，配制 50mL〇
[0054] 氯化|丐溶液:鹿糖13.69%(*八)+甘油18.4%(￥八)+氯化|丐3.0%(￥八），配制2瓶， 每瓶250mL。
[0055] 将上述这两种溶液调节pH=6.8~7.0; 121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0056] 2)包埋小球的制备：
[0057]用刀片将5mL移液枪头口径加工成4mm，121°C高压蒸汽灭菌30min。
[0058]用无菌铲子将菌丝体全部转移至盛有海藻酸钠溶液的瓶子中，充分混匀，制成混 合液。
[0059] 调节5mL移液枪量程至2.5mL，安装好上述枪头后吸取包埋液，将包埋液逐滴加入 到氯化钙溶液中，每瓶氯化钙溶液加入20~25mL包埋液，静置40min，使小球表面硬化。
[0060] 将硬化后的小球加入到盛有无菌纯化水的小试管中，使纯化水液面至少高于小球 1 cm，封口编号后置于0~4 °C冰箱中保存。
[0061 ] 经验证，保藏18个月后，包埋小球制备的斜面外观正常，菌丝白色，生长均匀，效价 无明显降低(p>〇.〇5)。
[0062] 纯化水包埋保藏法验证结果：
[0063]
[0064] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均 视为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
[0065]对比实施例1(液体石蜡保藏法）
[0066] 将斜盖燕01;[1：(^;[1118。1'1111111118的斜面用不锈钢接种|产|产取2~40111 2，菌种批号 TMI14-469(由宁夏泰瑞制药股份有限公司，种子室提供），移至装有液体石蜡的小试管中， 使液体石蜡液面没过斜面至少lcm，橡胶塞塞紧试管口，再用封口膜密封管口，0~4°C保藏。 [0067]经验证，液体石蜡保藏法保藏12个月时，效价明显降低(p〈0.05);保藏18个月时菌 种死亡，未获得成活的子代斜面。
[0068]液体石蜡保藏法验证结果：
[0069]
[0070]对比实施例2(低温斜面保藏法）
[0071 ] 将制备好的斜盖燕(31;[1：(^;[1118口1'1111111118斜面放入0~4<€冰箱中保藏，菌种批号 TMI12-1096(由宁夏泰瑞制药股份有限公司，种子室提供）。
[0072]经验证，使用低温斜面保藏法保藏0，1，2个月的斜面，效价出现显著性差异（p〈 0.05)〇
[0073]低温斜面保藏法验证结果：
[0074]
【主权项】
1. 一种斜盖菇的保藏方法，其特征在于:首先将斜盖菇菌丝体与海藻酸钠溶液混合，然 后将其滴入到氯化钙溶液中制成小球，最后将该小球放入到纯化水中，在0~4°c温度条件 下保藏。2. 按照权利要求1所述的斜盖菇的保藏方法，其特征在于所述斜盖菇菌丝体与海藻酸 钠溶液的配比关系为，每lg菌丝体加入5~10ml海藻酸钠溶液。3. 按照权利要求1或2所述的斜盖菇的保藏方法，其特征在于所述海藻酸钠溶液组成 为:蔗糖13.69%，甘油18.4%，海藻酸钠8~12%，其余为水，pH=6.8~7.0，以质量体积浓度计。4. 按照权利要求1所述的斜盖菇的保藏方法，其特征在于所述氯化钙溶液组成为:蔗糖 13.69%，甘油18.4%，氯化钙1~5%，其余为水，pH=6.8~7.0，以质量体积浓度计。5. 按照权利要求1所述的斜盖菇的保藏方法，其特征在于所述海藻酸钠溶液与氯化钙 溶液的使用比例为，每lmL海藻酸钠溶液对应使用8~1 OmL氯化|丐溶液。
【文档编号】C12N1/04GK106085865SQ201610704106
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年8月23日
【发明人】杨智, 孙金刚, 张萍
【申请人】宁夏泰瑞制药股份有限公司