一种低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法及应用
【专利摘要】本发明涉及一种低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法及应用，采用电Fenton法进行，所述电Fenton法的具体操作为：将浓度为60?180mg/mL的粗褐藻多糖溶液通入设有阴、阳极的电解槽中，调节溶液为酸性，按照每升粗褐藻多糖溶液通入4?16L氧气的量，向阴极通入氧气，通入直流电并控制阴极电流密度为8?20mA/cm2，在此条件下，对所述褐藻多糖进行降解，收集电解液；该法操作简单，省时高效，有利于扩大规模生产；且反应条件温和，对环境污染小；与酸法降解和过氧化氢降解法相比，电Fenton法对褐藻多糖的降解率高，得到的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量范围更窄。
【专利说明】
一种低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法及应用
技术领域
[0001 ]本发明涉及医药原料生产领域，具体涉及一种低分子量多糖的制备方法，更具体 地涉及一种低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法及在治疗红斑狼疮肾炎方面的应用。
【背景技术】
[0002] 褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)，又称褐藻糖胶、岩藻聚糖硫酸酯、岩藻聚糖等，主要 从海带、海蕴、泡叶藻、裙带菜、羊栖菜、马尾藻、绳藻等原料中提取得到，而前三者已实现工 业化生产。褐藻多糖硫酸酯是一类化学组成和结构非常复杂的多糖水溶性多糖，以岩藻糖 和硫酸基为主，不同来源的褐藻多糖硫酸酯还含有不同比例的木糖、半乳糖、糖醛酸和少量 的蛋白质。海带褐藻多糖硫酸酯由岩藻糖、木糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖等单糖组 成，以岩藻糖和半乳糖为主，两者的比例大概为3:1。其主链主要是由α-(1-3)连接的L-岩 藻糖组成，硫酸化发生在C4或C2位，部分L-岩藻糖以（1-2)连接的方式存在于侧链中，半乳 糖可能参加了主链的组成，而木糖、鼠李糖等以侧链形式存在。
[0003] 近年来，褐藻多糖硫酸酯因其独特的分子结构和生理活性，尤其是提高免疫力、抗 凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗病毒方面的独特活性引起人们的广泛关注。以褐藻多糖硫酸酯为 原料药，其商品名为海昆肾喜胶囊，是海洋植物海带中提取的二类药物，具有化浊排毒，对 治疗慢性肾功能衰竭(代偿期、失代偿期和尿毒症早期)湿浊症有较好的疗效。经研究表明， 多糖的生物活性与其分子量密切相关，分子量越大，分子体积越大，且溶解性差，随着分子 量的增大，多糖溶液的粘度增高，不利于多糖跨越多重细胞膜障碍进入生物体内发挥生物 学活性。中国专利CN101028282B公开了低分子量褐藻多糖硫酸酯（分子量范围为1000~ 200000)与褐藻多糖硫酸酯相比，在治疗肾脏疾病方面，具有意想不到的良好治疗效果。
[0004] 目前，低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法有物理降解法、化学降解法和酶降解 法。物理降解法如超声波法，可以把大分子量的多糖降解，但此法对设备要求较高，无法达 到工业化生产。酶降解法是用专一性的糖苷酶断开多糖分子中的一个糖苷键来达到降解多 糖的目的，或用非专一性的其他酶对多糖进行降解。酶降解法反应条件温和，无需加入其他 反应试剂，且没有副产物生成，但目前没有成熟的酶，能够用于工业化降解褐藻多糖硫酸 酯。
[0005] 专利W02008054087A1用5~15倍褐藻质量水，在100~120°C条件下提取3~6h，分 离出上清液，得到岩藻多糖溶液，并在含有〇. 1~〇.2g干质量的孤菌属细菌Vibrio hailoticoli及其糖基转移酶的细菌培养液中发酵20min~4h，于90~130°C下加热所得的 发酵溶液20min~2h，使微生物及酶失活并灭菌，即得低分子量岩藻多糖。
[0006] 化学降解法主要包括酸降解法和过氧化氢降解法。酸降解法是利用酸性条件下多 糖分子的糖苷键水解而造成糖链断裂的方法，一般采用盐酸，硫酸水解，此外，也有用三氟 乙酸，乙酸，氢氟酸等水解多糖，是较为经典的降解多糖的方法。中国专利CN1115166C将褐 藻用水浸泡，取得浸泡液后，调pH至5-6，过滤后得到清液，用截留分子量10000-50000的超 滤膜超滤浓缩，加入乙醇分级沉淀除去褐藻胶和杂质，并沉淀出多糖，在pH小于2的条件下 水解l-16h，再经脱色、纯化、真空干燥得到低分子量的岩藻多糖硫酸酯。酸降解法糖苷键断 裂是随机的，产物分子量分布范围较广，硫酸根含量变化较大，对产物的结构和活性具有破 坏性。中国专利CN1267457C公开了用抗坏血酸和过氧化氢降解海藻硫酸多糖得到低分子量 海藻硫酸多糖的方法。张晶晶在其学位论文中模拟了植物体内细胞壁多糖分子在抗坏血 酸-过氧化氢体系中被降解的氧化还原反应，对海带褐藻多糖硫酸酯的降解进行了全面的 研究发现，此方法不仅能够得到低分子量多糖，而且分子量分布范围较窄，保证多糖化学组 分基本不变。该论文还报道了植物体内多糖分子降解的实质是植物体内普遍存在抗坏血酸 诱导的Fenton反应，即抗坏血酸作为还原剂还原体内氧分子产生过氧化氢，抗坏血酸还负 责还原金属离子。过氧化氢和还原态的金属离子可以发生Fenton反应产生的羟基自由基与 植物体内细胞壁多糖分子中糖环中碳上的氢原子反应，即氢抽提反应，使糖苷键断裂。 Fenton法降解多糖应用较广，然而，在工业应用中利用Fenton法降解多糖还存在一些弊端， 如:过氧化氢在贮存和运输过程中存在着潜在的危险、降解率低。
[0007] 因此，提出一种适宜于工业化生产的低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法具有重 要意义。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是提供一种低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法，该方法非常适宜 于大规模的工业化生产。
[0009] 具体而言，本发明采用如下技术方案：
[0010] 一种低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法，包括采用电Fenton法将大分子量粗褐 藻多糖降解为低分子量褐藻多糖硫酸酯的步骤；
[0011]所述电Fenton法的具体操作为:将浓度为60-180mg/mL的粗褐藻多糖溶液通入设 有阴、阳极的电解槽中，调节溶液为酸性，按照每升粗褐藻多糖溶液通入4-16L氧气的量，向 阴极通入氧气，通入直流电并控制阴极电流密度为8-20mA/cm 2,在此条件下，对所述褐藻多 糖进行降解，收集电解液。
[0012] 优选地，按照每升粗褐藻多糖溶液通入4-10L氧气的量，向阴极通入氧气，并控制 阴极电流密度为10-18mA/cm2;最优选地，按照每升粗褐藻多糖溶液通入4-8L氧气的量，向 阴极通入氧气，并控制阴极电流密度为ll-13mA/cm 2。此种条件下，阴极产生的H2〇2能迅速与 溶液中存在的Fe 2+反应生成H0 ·和Fe3+，H0 ·可理想地与粗褐藻多糖反应，将其降解为低分 子量的褐藻多糖硫酸酯，具有降解率高，降解得到的低分子量褐藻多糖硫酸酯分子量分布 窄的优势。
[0013] 进一步优选地，采用含有至少一个通气孔的曝气装置向所述阴极通入氧气，且每 个通气孔中氧气的通入速度为0.2-1.0L/min(优选0.6-0.8L/min，最优选0.7L/min)。此种 通气速度能够较佳地溶于溶液中，稳定高效地产生· 0H，可高效降解多糖，降解充分，降解 率高。
[0014] 本领域技术人员可以理解，用空气替代氧气同样可以实现上述目的，在具体应用 时，可采用增大空气通入量的手段达到与通入纯氧气量相同的目的。
[0015] 本发明所述粗褐藻多糖溶液通过如下方法配制而成：用相当于所述粗褐藻多糖 0.8-1.2倍重量的乙醇分散所述粗褐藻多糖，然后加入水使粗褐藻多糖相对于水的浓度为 60_180mg/mL，即得。
[0016] 优选地，本发明所述粗褐藻多糖相对于水的浓度为60-100mg/mL。
[0017] 粗褐藻多糖分子量大，粘度大，直接以水作为溶剂多糖溶解度较低，不利于降解； 本发明先将多糖分散在乙醇中，可以形成均匀的悬浊液，然后再加入水，此种情况下，多糖 能够均匀分散在水中，极大地促进了多糖在水中的溶解，有助于电解顺利进行，提高降解 率。
[0018] 发明人经过大量研究发现，pH值对粗褐藻多糖的降解有重要影响，pH值偏低或偏 高均不利于粗褐藻多糖的降解，当pH为2-4时，降解率较高；当pH为2.5-3.5，尤其为3时，降 解效率最高，因此，本发明优选的pH值为2-4，进一步优选为2.5-3.5，最优选为3。
[0019] 优选地，在电解时，可在所述粗褐藻多糖溶液中加入电解质，加入电解质可增加溶 液的导电性，有助于电解的顺利进行。针对于本发明60-180mg/mL粗褐藻多糖溶液，优选采 用硫酸钠或氯化钠作为电解质，且当电解质的浓度为〇. 01-0.3mol/L(优选0.02-0. lmol/L) 时，电解效果最佳。
[0020] 优选地，所述阳极材质为铁，所述阴极材质为石墨。阴极材质进一步优选为多孔石 墨。本发明的阳极可使用铁丝网、铁片或铁棒;阴极材料优选为多孔石墨。
[0021] 优选地，上述电Fenton操作在搅拌条件下进行，搅拌状态有助于多糖分子更充分 的与H0 ·接触，促进降解。搅拌速度优选为100-600rpm。
[0022]本发明较佳的电Fenton操作包括如下步骤：
[0023] (1)配制多糖溶液:用相当于所述粗褐藻多糖0.8-1.2倍重量的乙醇分散所述粗褐 藻多糖，然后加入水使粗褐藻多糖相对于水的浓度为60-180mg/mL，即得；
[0024] (2)电解：以铁为阳极，石墨为阴极，将配制好的多糖溶液加入电解槽中，调节溶液 pH为2-4,按照每升粗褐藻多糖溶液通入2-12L氧气的量，向阴极通入氧气，并控制阴极电流 密度为10-18mA/cm2,搅拌状态下，进行电解，收集电解液，即得。
[0025]本发明最佳的电Fenton操作包括如下步骤：
[0026] (1)配制多糖溶液:用相当于所述粗褐藻多糖0.8-1.2倍重量的乙醇分散所述粗褐 藻多糖，然后加入水使粗褐藻多糖相对于水的浓度为60-100mg/mL，即得；
[0027] (2)电解：以铁为阳极，石墨为阴极，将配制好的多糖溶液加入电解槽中，调节溶液 pH为3，加入硫酸钠或氯化钠，并调节其浓度为0. Ι-lmol/L。按照每升粗褐藻多糖溶液通入 3-8L氧气的量，向阴极通入氧气，并控制阴极电流密度为ll-13mA/cm2,搅拌状态下，进行电 解，收集电解液，即得。
[0028] 本发明的电Fenton法特别适宜于电解分子量为200KDa~lOOOKDa的粗褐藻多糖， 具有理想的降解率。其中，所述的大分子量粗褐藻多糖可市购获得，或按照现有技术公开的 方法提取得到。
[0029] 优选地，本发明所述的粗褐藻多糖是通过如下方法制备得到的:将海带粉碎后，以 水为溶剂进行超高压提取;将所得提取液调为酸性，静置，离心，取清液;将所述清液调为中 性，脱色；向所得脱色液中加入乙醇，静置，离心，收集沉淀，即得。
[0030] 所述超高压提取的条件优选为:在100-600MPa压力下提取l-5min，重复上述操作 卜4次。
[0031] 所述超高压提取的条件进一步优选为:在400-600MPa压力下提取l-3min，重复上 述操作3次。
[0032] 优选地，向脱色液中加入的乙醇量以使体系中乙醇的体积浓度为60-75 %为宜。
[0033] 本领域技术人员可以理解，在粉碎前还可包括清洗海带除去泥沙的操作。所述"静 置"的时间以可以观察到溶液中不再有沉淀产生的时间为准。粉碎得到的颗粒的粒径以10-100目为宜。脱色采用活性炭为吸附剂，其加入量为本领域常规技术人员所知晓。离心的转 速以 3000-7000rpm 为宜。
[0034] 本发明较佳的粗褐藻多糖制备方法为:将海带粉碎为10-100目的颗粒，按照3-10L 水/kg海带的量，加入30-60 °C的水，与海带颗粒在100_600MPa压力下提取l-5min，重复上述 操作1-4次;调节所得提取液的pH为1-3,静置，离心，取清液;调节所述清液的pH值为中性， 采用活性炭脱色，收集脱色液；向所述脱色液中加入乙醇并控制乙醇的体积浓度为60-75%，静置，离心，收集沉淀，即得。
[0035] 上述提取方法以海带作为原料，具有原料价廉，来源广泛，操作简单，易于工业化 的优势。重要的是，上述方法的粗褐藻多糖提取率高，提取得到的产物分子量分布范围适 宜，特别适宜作为电Fenton法的原料制备低分子量褐藻多糖硫酸酯。
[0036] 本发明所述的方法还包括对从电解液中提取低分子量褐藻多糖硫酸酯的步骤，所 述"提取"可采用本领域常规技术手段，本发明优选采用超滤膜过滤法进行提取，进一步优 选采用截留分子量10KDa-60KDa的超滤膜超滤所述电解液。超滤过后收集浓缩液经冷冻干 燥，即得。
[0037] 优选地，在提取前，调节电解液为中性。
[0038] 本发明最佳的技术方案包括如下步骤：
[0039] (1)制备粗褐藻多糖:将海带粉碎为10-100目的颗粒，按照3-10L水/kg海带的量， 加入30-60 °C的水，与海带颗粒在100_600MPa压力下提取l-5min，重复上述操作1-4次;调节 所得提取液的pH为1-3,静置，离心，取清液；调节所述清液的pH值为中性，脱色，收集脱色 液；向所述脱色液中加入乙醇并控制乙醇的体积浓度为60-75 %，静置，离心，收集沉淀，即 得；
[0040] (2)配制多糖溶液：用相当于步骤（1)制备得到的粗褐藻多糖0.8-1.2倍重量的乙 醇分散所述粗褐藻多糖，然后加入水使粗褐藻多糖相对于水的浓度为60-180mg/mL，即得； [0041 ] (3)电Fenton法降解粗褐藻多糖：将粗褐藻多糖溶液通入设有阴、阳极的电解槽 中，调节溶液pH值为2-4，按照每升粗褐藻多糖溶液通入4-16L氧气的量，向阴极通入氧气， 通入直流电并控制阴极电流密度为8-20mA/cm2,在此条件下，对所述粗褐藻多糖进行降解， 收集电解液；
[0042] (4)分离低分子量褐藻多糖硫酸酯：调节电解液为中性，用超滤膜超滤所述电解 液，冷冻干燥所得浓缩液，即得。
[0043] 本发明所述的方法工艺操作简单，省时高效，有利于扩大规模生产;且反应条件温 和，对环境污染小；重要的是，与酸法降解和过氧化氢降解法相比，电Fenton法对褐藻多糖 的降解率高，可达60%左右，且得到的低分子量褐藻多糖硫酸酯的分子量范围更窄。
[0044] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，即得本发明各较佳 实施例。
【具体实施方式】
[0045] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。涉及到的原料或试剂 均为已知物质，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
[0046] 以下各实施例和对比例中，各指标的计算公式及测定方法如下：
[0047] 褐藻多糖硫酸酯提取率（％ )=(褐藻多糖硫酸酯的重量/海带重量）X 100%
[0048] 低分子量褐藻多糖硫酸酯提取率（％ )=(低分子量褐藻多糖硫酸酯的重量/海带 重量）Χ1〇〇%
[0049] 岩藻糖含量（％ )=(岩藻糖重量/褐藻多糖硫酸酯的重量）X 100%
[0050] 海带岩藻糖含量（％ )=(岩藻糖重量/海带重量）X 100%
[0051 ]硫酸根含量（％ )=(硫酸根重量/褐藻多糖硫酸酯的重量）X 100%
[0052] 海带硫酸根含量（％ )=(海带硫酸根重量/海带重量）X 100%
[0053]降解率（％ )=(低分子量褐藻多糖硫酸酯重量/粗褐藻多糖硫酸酯重量）X 100 [0054]岩藻糖含量的检测方法，包括如下步骤：
[0055] (1)对照品溶液的制备取岩藻糖对照品适量，精密称定，加水制成每lml含0.12mg 的溶液，即得。标准曲线的制备精密吸取对照品溶液〇 . 2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、 1.2ml，分别置15ml具塞试管中，各加水至2.0ml，迅速精密加入0.1 %蒽酮硫酸溶液6ml，立 即摇匀，放置15分钟，立即置冰浴中冷却15分钟，取出，以相应试剂为空白，照紫外-可见分 光光度法(通则0401 )，在580nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制 标准曲线。
[0056] (2)海带中岩藻糖的测定方法:取海带粉末(过三号筛）约1 g，精密称定，置圆底烧 瓶中，加水200ml，静置1小时，加热回流4小时，放冷，转移至250ml的离心杯中离心（转速为 每分钟9000转）30分钟。吸取上清液，转移至250ml量瓶中，沉淀用少量水分次洗涤，移置 50ml离心管中，离心（转速为每分钟9000转）30分钟。吸取上清液，置同一量瓶中，加水至刻 度，摇匀。精密量取上清液5ml，置100ml离心管中，边搅拌边缓慢滴加乙醇75ml，摇匀，4°C放 置12小时，取出，离心(转速为每分钟9000转)30分钟，弃去上清液，沉淀加沸水适量溶解，放 冷，转移至20ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，离心，精密量取上清液2ml，置15ml具塞试管中， 照标准曲线的制备项下的方法，自"迅速精密加入0.1 %蒽酮硫酸溶液6ml"起，依法测定吸 光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含岩藻糖的重量(mg)，计算，即得。
[0057] (3)褐藻多糖硫酸酯中岩藻糖测定方法:精密称定样品粉末(过三号筛)5mg，置于 100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，精密量取溶液2ml，置15ml具塞试管中，照标准曲线的制 备项下的方法，自"迅速精密加入0.1%蒽酮硫酸溶液6ml"起，依法测定吸光度，从标准曲线 上读出供试品溶液中含岩藻糖的重量(mg)，计算，即得。
[0058]硫酸根含量的检测方法，包括如下步骤：
[0059] (1)试剂制备
[0060] 标准硫酸钾溶液的配制：将硫酸钾在105-110 °C烘3h，放干燥器中冷至室温，准确 称取72.66mg左右，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，硫酸根离子的浓度0.4mg/ml。 [0061 ]明胶氯化钡溶液的配制：1.0g明胶加100ml蒸馏水与60_70°C溶解，4°C下过夜，第 二天把〇. 5g氯化钡溶于溶液中，静置2h后方可使用。
[0062] (2)标准曲线的制备:分别取标准硫酸钾溶液0 · 1ml，0 · 2ml，0 · 3ml，0 · 4ml，0 · 5ml， 加 1. Omol/1 HC1至0.5ml，加入3%三氟乙酸溶液7.5ml，明胶氯化钡溶液2.0ml，充分摇匀， 放置30min后于360nm处测其吸光度，以硫酸根浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准 曲线。
[0063] (3)样品测定
[0064]海带中硫酸根含量的测定方法:取海带粉末(过三号筛)约lg，精密称定，置圆底烧 瓶中，加水200ml，静置1小时，加热回流4小时，放冷，转移至250ml的离心杯中离心（转速为 每分钟9000转）30分钟。吸取上清液，转移至250ml量瓶中，沉淀用少量水分次洗涤，移置 50ml离心管中，离心（转速为每分钟9000转）30分钟。吸取上清液，置同一量瓶中，加水至刻 度，摇匀。精密量取上清液5ml，置100ml离心管中，边搅拌边缓慢滴加乙醇75ml，摇匀，4°C放 置12小时，取出，离心(转速为每分钟9000转)30分钟，弃去上清液，沉淀加沸水适量溶解放 入试管中，加 lmol/1 HC1 3.21111，密封，待样品溶胀后，封管，在水浴锅中加热411，取出冷至 室温。放入小烧杯中用蒸馏水慢慢少量冲洗，然后定容至50ml。量取0.5ml定容后的溶液，加 入3%三氟乙酸溶液9.41111，明胶氯化钡溶液2.51111，充分摇匀，放置3〇1^11后于36〇11111处测其 吸光度。
[0065]褐藻多糖硫酸酯硫酸根含量的测定方法:取褐藻多糖硫酸酯(粉末状)25mg放入试 管中，加 lmo 1 /1 HC1 2.5ml，密封，待样品溶胀后，封管，在水浴锅中加热4h，取出冷至室温。 放入小烧杯中用蒸馏水慢慢少量冲洗，然后定容至50ml。量取0.5ml定容后的溶液，加入3 % 三氟乙酸溶液7.5ml，明胶氯化钡溶液2.0ml，充分摇匀，放置30min后于360nm处测其吸光 度。
[0066] 分子量与分子量分布检测方法
[0067] (1)色谱条件凝胶排阻色谱柱：TSKgel G4000SW(7 · 5mmX 300mm);流动相：0 · 71 % 硫酸钠溶液（内含〇. 02%叠氮化钠）；柱温35°C ;流速:0.5ml/min;示差折光检测器。
[0068] (2)测定方法：分别取重均分子量为10000，40000，80000，133800，150000，270000， 410000的葡聚糖适量，用流动相溶解制成浓度为5mg/ml的溶液，振摇，室温放置过夜，按上 述色谱条件分别注入色谱仪，记录色谱图，以各标准多糖己知分子量的对数与相应的保留 时间作图，得到标准曲线。根据标准曲线及样品的保留时间计算出分子量及分子量分布。 [0069] 实施例1
[0070] -种提取低分子量褐藻多糖硫酸酯的方法，包括如下步骤：
[0071] (1)称取1.67Kg海带，清洗除去泥沙后，粉碎成50目颗粒，加入10L温度为50°C的 水，装入超高压处理设备中，500MPa条件下保压2min，泄压时间为2s，提取后的料液不放出， 按照此条件继续超高压提取2次后，放出料液。用lmol/L盐酸将料液的pH调至2,静置至不再 产生沉淀，以6000转/min的速度离心，取清液，用lmol/L的氢氧化钠溶液将其pH调至中性 后，缓慢加入装有417g活性炭的层析柱中脱色，收集脱色液。向脱色液中加入95%乙醇 21.7L，使多糖溶液中乙醇浓度为65%，静置，以6000转/min的速度离心，收集沉淀得到粗褐 藻多糖 51.77g(3.1%)。
[0072] (2)称取2700g步骤（1)方法得到的粗褐藻多糖硫酸酯，分散到2.7Kg无水乙醇中， 加入到15L蒸馏水中，制成浓度为180mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中，称取 106.5g硫酸钠溶解于多糖溶液中，用lmol/L盐酸调pH至3。以20cm X 20cm铁丝网为阳极， 20cm X 20cm多孔石墨为阴极，两极间距离为8cm，通入12V直流电，电流密度为1 OmA/cm2，并 用曝气装置以2.2L/min的速度通入净化空气（或以0.7L/min的速度通入氧气，曝气装置含 两个通气孔，两个通气孔同时鼓入氧气），每升粗褐藻多糖溶液通入空气的量约为14.67L (每升粗褐藻多糖溶液通入空气的量约为4.67L)，搅拌器以250rpm的速度搅拌，室温条件下 电解50min后，停止通电通气，将电解液用1M的氢氧化钠溶液中和至中性后用截留分子量 30KDa-50KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，褐藻多糖硫酸酯823. Olg，用凝胶排阻 色谱法测定平均分子量为36. lKDa，降解率为30.48%。
[0073] 实施例2
[0074]称取实施例中步骤（1)得到的粗褐藻多糖硫酸酯1500g，分散到1.8Kg无水乙醇中， 加入15L蒸馏水，制成浓度为100mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中。称取149.1 g硫 酸钠溶解于多糖溶液中，用lmol/L盐酸调pH至3,以30cm X 20cm铁丝网为阳极，30cmX 20cm 多孔石墨为阴极，两极间距离为6cm，通入15V直流电，电流密度为12mA/cm2,并用曝气装置 以0.8L/min的速度通入氧气(曝气装置含两个通气孔，两个通气孔同时鼓入氧气），每升粗 褐藻多糖溶液通入氧气的量约为6.4L，搅拌器以250rpm的速度搅拌，室温条件下电解60min 后，停止通电通气，将电解液用截留分子量10KDa-30KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干 燥，褐藻多糖硫酸酯388.28g，降解率为25.89%，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量为 22.3KDa〇
[0075] 实施例3
[0076] 称取900g褐藻多糖硫酸酯（海黍子，980KDa)，分散到0.72Kg无水乙醇中，加入到 15L蒸馏水中，制成浓度为60mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中，称取127.8g硫酸 钠溶解于多糖溶液中，用lmol/L盐酸调pH至3，以20cmX 30cm铁板为阳极，20cm X 30cm多孔 石墨为阴极，两极间距离为5cm，通入15V直流电，电流密度为13mA/cm2,并用曝气装置以 0.6L/min的速度通入氧气（曝气装置含三个通气孔，三个通气孔同时鼓入氧气），每升粗褐 藻多糖溶液通入氧气的量约为7.2L，搅拌器以250rpm的速度搅拌，室温条件下电解60min 后，停止通电通气，将电解液用截留分子量10KDa-30KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干 燥，得到褐藻多糖硫酸酯189.63g，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量为19.2KDa。
[0077] 实施例4
[0078] 称取1200g粗褐藻多糖硫酸酯（鼠尾藻，650KDa)，分散到1.2Kg无水乙醇中，加入到 15L蒸馏水中，制成浓度为80mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中，称取106.5g硫酸 钠溶解于多糖溶液中，用lmol/L盐酸调pH至3,以20cmX 20cm铁丝网为阳极，20cmX 20cm多 孔石墨为阴极，两极间距离为7cm，通入15V直流电，电流密度为llmA/cm2,并用曝气装置以 0.6L/min的速度通入氧(曝气装置含四个通气孔，四个通气孔同时鼓入氧气），每升粗褐藻 多糖溶液通入氧气的量约为6.4L，搅拌器以250rpm的速度搅拌，室温条件下电解40min后， 停止通电通气，将电解液用截留分子量10KDa-30KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥， 得到褐藻多糖硫酸酯366.18g。用凝胶排阻色谱法测定平均分子量为24.7KDa。
[0079] 对比例1酸法降解多糖
[0080] 称取实施例1步骤（1)降解得到的粗褐藻多糖硫酸酯225g，分散到225g无水乙醇 中，加入到15L蒸馏水中，制成浓度为15mg/ml的糖溶液，用lmol/L的盐酸调节溶液pH至2，室 温条件下搅拌水解3.5h，溶液粘度显著降低后，用截留分子量10KDa-50KDa的超滤膜超滤， 收集浓缩液，冷冻干燥，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量。
[0081] 对比例2过氧化氢法
[0082]称取300g实施例1步骤（1)降解得到的粗褐藻多糖硫酸酯，分散到300g无水乙醇 中，加入到15L蒸馏水中，制成浓度为20mg/ml的糖溶液，加入66.05g抗坏血酸，过氧化氢 45.15ml(密度为1.13g/ml)，硫酸亚铁104.26g，室温条件下搅拌反应2h，用截留分子量 10KDa-50KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，用凝胶排阻色谱法测定平均分子量。
[0083] 对比例3
[0084]称取2700g步骤(1)方法得到的粗褐藻多糖硫酸酯，分散到2.7Kg无水乙醇中，加入 至|J 15L蒸馏水中，制成浓度为180mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中，称取106.5g硫 酸钠溶解于多糖溶液中，用lmol/L盐酸调pH至3。以20cmX20cm铁丝网为阳极，20cmX20cm 多孔石墨为阴极，两极间距离为8cm，通入12V直流电，并用曝气装置以0.7L/min的速度通入 氧气（曝气装置一个通气孔通氧气），每升粗褐藻多糖溶液通入2.33L氧气的量，搅拌器以 250rpm的速度搅拌，室温条件下电解50min后，停止通电通气，将电解液用截留分子量 30KDa-50KDa的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，褐藻多糖硫酸酯739.8g，用凝胶排阻色 谱法测定平均分子量为42.3KDa，硫酸根含量30.25 %，岩藻糖含量30.02，降解率27.4 %。 [0085] 对比例4
[0086]称取300g步骤（1)方法得到的粗褐藻多糖硫酸酯，分散到300g无水乙醇中，加入到 15L蒸馏水中，制成浓度为20mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中，称取106.5g硫酸 钠溶解于多糖溶液中，用lmol/L盐酸调pH至3。以20cmX 20cm铁丝网为阳极，20cmX 20cm多 孔石墨为阴极，两极间距离为8cm，通入12V直流电，并用曝气装置以0.7L/min的速度通入氧 气(两个通气孔同时通氧气），每升粗褐藻多糖溶液通入4.67L氧气的量搅拌器以250rpm的 速度搅拌，室温条件下电解50min后，停止通电通气，将电解液用截留分子量5000Da的超滤 膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，褐藻多糖硫酸酯20.37g，，降解率为6.79 %。用凝胶排阻色 谱法测定平均分子量为5.33Kda，硫酸根含量26.72 %，岩藻糖含量25.43 %。
[0087] 对比例5
[0088]称取2700g步骤(1)方法得到的粗褐藻多糖硫酸酯，分散到2.7Kg无水乙醇中，加入 至|J 15L蒸馏水中，制成浓度为180mg/ml的糖溶液，装入体积为24L的电解槽中，称取106.5g硫 酸钠溶解于多糖溶液中，用lmol/L盐酸调pH至5。以20cmX 20cm铁丝网为阳极，20cmX 20cm 多孔石墨为阴极，两极间距离为8cm，通入12V直流电，并用曝气装置以0.7L/min的速度通入 氧气(两个通气孔同时通氧气），每升粗褐藻多糖溶液通入4.67L氧气的量搅拌器以250rpm 的速度搅拌，室温条件下电解50min后，停止通电通气，将电解液用截留分子量10KDa-50KDa 的超滤膜超滤，收集浓缩液，冷冻干燥，得到褐藻多糖硫酸酯104.49g，降解率为3.87 %。用 凝胶排阻色谱法测定平均分子量为47. lKda。硫酸根含量29.1 %，岩藻糖含量29.9%。
[0089]表1是对实施例1的原料，粗褐藻多糖硫酸酯，低分子量褐藻多糖硫酸酯的分析结 果：
[0090]表1实施例1的提取分析结果
[0091]
[0092 ]表2列出了本发明实施例1 -4，对比例1 -5的结果。
[0093] 表2:实施例1-4,对比例1-5的结果对比
[0094]
[0095] 从上表可以看出，酸法降解的降解率较低，硫酸根含量较少，过氧化氢法得到的低 分子量多糖岩藻糖和硫酸根含量与本发明接近，但耗时较多，降解率较本发明低。本发明降 解得到的低分子量多糖的平均分子量低于酸法和过氧化氢法。
[0096] 动物实验
[0097] 选取NZBXNZWF1雌性小鼠 90只，8-10周龄，体重18-24g，随机分为六组，每组15只， 分别为空白对照组(记为I组）、地塞米松组(记为π组）、地塞米松联合环磷酰胺组(记为m 组）、褐藻多糖硫酸酯A组(实施例3平均分子量为19.2KDa的低分子量褐藻多糖硫酸酯，记为 IV组）、褐藻多糖硫酸酯B组(实施例1平均分子量为36. lKDa的低分子量褐藻多糖硫酸酯，记 为V组）、褐藻多糖硫酸酯C组(实施例3平均分子量为19.2KDa的低分子量褐藻多糖硫酸酯 联合地塞米松，记为VI组）。
[0098] 给药情况：I组:正常喂养；Π 组:地塞米松lmg/kg每日一次腹腔注射；ΙΠ 组:地塞米 松lmg/kg每日一次腹腔注射，环磷酰胺0.08mg/kg每两周一次静脉注射;IV组:实施例3平均 分子量为19.2KDa的低分子量褐藻多糖硫酸酯20mg/kg每天一次灌胃给药；V组:实施例1平 均分子量为36. lKDa的低分子量褐藻多糖硫酸酯20mg/kg每天一次灌胃给药;VI组:实施例1 平均分子量为19.2KDa的低分子量褐藻多糖硫酸酯20mg/kg每天一次灌胃给药，地塞米松 lmg/kg每日一次腹腔注射。每隔1月收集一次尿液，测定尿蛋白含量，结果如表3所示：
[0099] 表3各组小鼠尿蛋白变化均值表(mg/ml)
[0100]
[0101] 经分析，各组治疗3个月后，与I组相比有显著性差异(p〈0.05)。
[0102] 从表3可知，ΙΠ 组、IV组、V组、VI组对狼疮肾炎有较好的疗效，四组之间实验结果 无显著性差异，其中平均分子量为19.2KDa的褐藻多糖硫酸酯的治疗效果与平均分子量为 36. lKDa的褐藻多糖硫酸酯的治疗效果相当；单独用低分子量的褐藻多糖硫酸酯治疗效果 与低分子量的褐藻多糖硫酸酯联合地塞米松的治疗效果相差不大;并且，IV组、V组、VI组 未使用免疫抑制剂环磷酰胺同样起到很好的疗效。由此可见，低分子量的褐藻多糖硫酸酯 对狼疮肾炎有很好的治疗作用。
[0103] 虽然，上文中已经用一般性说明、【具体实施方式】及试验，对本发明作了详尽的描 述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见 的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的 范围。
【主权项】
1. 一种低分子量褐藻多糖硫酸酯的制备方法，其特征在于，包括采用电Fenton法将大 分子量粗褐藻多糖降解为低分子量褐藻多糖硫酸酯的步骤； 所述电Fenton法的具体操作为:将浓度为60-180mg/mL的粗褐藻多糖溶液通入设有阴、 阳极的电解槽中，调节溶液为酸性，按照每升粗褐藻多糖溶液通入4-16L氧气的量，向阴极 通入氧气，通入直流电并控制阴极电流密度为8-20mA/cm 2，在此条件下，对所述褐藻多糖进 行降解，收集电解液。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：按照每升粗褐藻多糖溶液通入4-10L 氧气的量，向阴极通入氧气，并控制阴极电流密度为10-18mA/cm2; 优选地，按照每升粗褐藻多糖溶液通入4-8L氧气的量，向阴极通入氧气，并控制阴极电 流密度为ll-13mA/cm2〇3. 根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，所述粗褐藻多糖溶液通过如下方 法配制而成：用相当于所述粗褐藻多糖0.8-1.2倍重量的乙醇分散所述粗褐藻多糖，然后加 入水使粗褐藻多糖相对于水的浓度为60-180mg/mL，即得； 所述粗褐藻多糖的浓度优选为60-100mg/mL。4. 根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于，所述粗褐藻多糖溶液的pH为 2-4;和/或， 所述电解槽中添加有电解质，所述电解质为氯化钠或硫酸钠，优选所述电解质的浓度 为0.01-0.3111〇1/1;和/或， 所述阳极材质为铁，所述阴极材质为石墨;和/或， 所述降解在搅拌条件下进行，优选搅拌速度为100-600rpm。5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述大分子量粗褐藻多糖通过如下方 法制备得到:将海带粉碎后，以水为溶剂进行超高压提取;将所得提取液调为酸性，静置，离 心，取清液;将所述清液调为中性，脱色；向所得脱色液中加入乙醇，静置，离心，收集沉淀， 即得。6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超高压提取的操作为：在100-600MPa压力下提取l-5min，重复上述操作1-4次;优选在400-600MPa压力下提取l-3min，重 复上述操作3次。7. 根据权利要求1或2或5或6所述的制备方法，其特征在于，所述大分子量粗褐藻多糖 的分子量为200KDa~1 OOOKDa。8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括采用超滤膜超滤所述电解液以 提取低分子量褐藻多糖硫酸酯的步骤； 优选地，提取前，调节电解液为中性。9. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 制备粗褐藻多糖:将海带粉碎为10-100目的颗粒，按照3-10L水/kg海带的量，加入 30-60°C的水，与海带颗粒在100_600MPa压力下提取l-5min，重复上述操作1-4次;调节所得 提取液的pH为1-3，静置，离心，取清液;调节所述清液的pH值为中性，脱色，收集脱色液；向 所述脱色液中加入乙醇并控制乙醇的体积浓度为60-75%，静置，离心，收集沉淀，即得； (2) 配制多糖溶液：用相当于步骤（1)制备得到的粗褐藻多糖0.8-1.2倍重量的乙醇分 散所述粗褐藻多糖，然后加入水使粗褐藻多糖相对于水的浓度为60-180mg/mL，即得； (3) 电Fenton法降解粗褐藻多糖:将粗褐藻多糖溶液通入设有阴、阳极的电解槽中，调 节溶液pH值为2-4,按照每升粗褐藻多糖溶液通入4-16L氧气的量，向阴极通入氧气，通入直 流电并控制阴极电流密度为8-20mA/cm 2,在此条件下，对所述粗褐藻多糖进行降解，收集电 解液； (4) 分离低分子量褐藻多糖硫酸酯：调节电解液为中性，用超滤膜超滤所述电解液，冷 冻干燥所得浓缩液，即得。10.权利要求1-9任一项所述的方法制备得到的低分子量褐藻多糖硫酸酯在制备治疗 狼疮肾炎药物中的应用。
【文档编号】C25B3/00GK106084085SQ201610572971
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月19日
【发明人】石清东, 王姣
【申请人】北京颐方生物科技有限公司