蛋白质lmm5.1在调控植物抗病性与超敏反应性中的应用

蛋白质lmm5.1在调控植物抗病性与超敏反应性中的应用
【专利摘要】本发明公开了蛋白质LMM5.1在调控植物抗病性与超敏反应性中的应用。本发明公开的应用中，蛋白质LMM5.1所述蛋白质LMM5.1是如下A1)、A2)或A3)：A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。实验证明，本发明的LMM5.1与植物的抗病性相关，还可以调控植物的超敏反应性，可以利用LMM5.1及其编码基因调控植物的抗病性与超敏反应性。CGMCC No.1194720160527
【专利说明】
蛋白质LMM5.1在调控植物抗病性与超敏反应性中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域中蛋白质LMM5.1在调控植物抗病性与超敏反应性中的 应用。
【背景技术】
[0002] 为了应对自然环境中病原菌的进攻，植物进化出复杂的防御机制。其中，最有效的 方式之一是超敏反应(Hypersensitive response，HR)。超敏反应是指当植物受到非亲和病 原菌侵染后，被侵染部位细胞迅速死亡，从而限制病原菌增殖的一种防卫反应，属于细胞程 序性死亡（programmed cell death，PCD)(Greenberg, 1997)。类病变突变体（lesion mimic mutants)在没有病原菌侵染的情况下，就能自发的形成类似超敏反应的坏死斑（lesion)， 因此类病变突变体是研究植物细胞死亡、超敏反应和防卫反应的重要材料。类病变突变体 最早在玉米中报道(Hoisington et al.，1982)，随后在大麦(Wolter et al.，1993)、拟南 芥（Dietrich et al.，1994;Greenberg and Ausubel，1993;Greenberg et al.,1994)、水 稻(Takahashi et al. ,1999)等物种中均有发现。水稻作为重要的粮食作物和模式植物，对 其细胞死亡和抗病机制的研究具有重要的意义。

【发明内容】

[0003] 本发明所要解决的技术问题是如何调控植物的抗病性与超敏反应性。
[0004] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质LMM5.1在调控植物抗病性和/或 调控植物超敏反应性中的应用;所述蛋白质LMM5.1是如下Al)、A2)或A3):
[0005] A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质；
[0006] A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
[0007] A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
[0008] 其中，序列2由655个氨基酸残基组成。
[0009] 为了使A1)中的蛋白质便于纯化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的 蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
[0010] 表1、标签的序列
[0011]
[0012]
[0013] 上述A2)中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10 个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
[0014] 上述A2)中LMM5.1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
[0015] 上述A2)中LMM5.1的编码基因可通过将序列1或序列3的第1490-6521位所示的DNA 序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变， 和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。
[0016] 为解决上述技术问题，本发明还提供了与LMM5.1相关的生物材料在调控植物抗病 性和/或调控植物超敏反应性中的应用;所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种：
[0017] B1)编码LMM5.1的核酸分子；
[0018] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
[0019] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
[0020] B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
[0021 ] B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
[0022] B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
[0023] B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
[0024] B8)含有Μ)所述重组载体的重组微生物；
[0025] Β9)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
[0026] Β10)含有Β2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
[0027] Β11)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物组织；
[0028] Β12)含有Β2)所述表达盒的转基因植物组织；
[0029] Β13)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物器官；
[0030] Β14)含有Β2)所述表达盒的转基因植物器官；
[0031] Β15)降低LMM5.1表达的核酸分子；
[0032] Β16)含有Β15)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞 系。
[0033] 上述应用中，Β1)所述核酸分子为如下bl)_b4)中任一种：
[0034] bl)编码序列是序列表中序列3的第1490-6521位核苷酸的cDNA分子或DNA分子；
[0035] b2)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；
[0036] b3)与bl)或b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码LMM5.1的 cDNA分子或基因组DNA分子；
[0037] b4)在严格条件下与bl)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码LMM5.1的cDNA分子 或基因组DNA分子；
[0038] B2)所述表达盒为序列3所示的DNA分子；
[0039] B15)所述核酸分子为与序列3的第1490-6521位或序列1所不的DNA分子中任一片 段反向互补的DNA分子。
[0040] 其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可 以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0041]其中，序列1由1968个核苷酸组成，编码序列2所示的蛋白质。序列3的第1-1489位 所示的DNA分子可以启动LMM5.1基因的转录，序列3的第6522-8075位所示的DNA分子可以终 止LMM5.1基因的转录，序列3的第1490-6521位为LMM5.1基因的基因组序列。
[0042]本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方 法，对本发明的编码LMM5.1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分 离得到的LMM5.1的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码11^5.1且具有 LMM5.1功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
[0043]这里使用的术语"同一性"指与天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括与本发 明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或 更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件 进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（％ )表示，其可以 用来评价相关序列之间的同一性。
[0044] 上述应用中，所述严格条件是在2 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68°C下杂交并洗膜 2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下杂交并洗膜2次，每次15min; 或，0.1 X SSPE(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。
[0045] 上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。
[0046] 上述应用中，B2)所述的含有编码LMM5.1的核酸分子的表达盒(LMM5.1基因表达 盒），是指能够在宿主细胞中表达LMM5.1的DNA，该DNA不但可包括启动LMM5.1基因转录的启 动子，还可包括终止LMM5.1基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。 可用于本发明的启动子包括但不限于:组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和 诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S:来自西 红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶（〃1^^〃，〇1 &〇等人（1999)?1&的？1^以〇1120: 979-992);来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和BTH(苯并噻二 唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导）；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2)或LAP启动子(均可用 茉莉酮酸甲酯诱导）；热休克启动子(美国专利5，187,267);四环素诱导型启动子(美国专利 5,057,422);种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子?？128(0价010631398(中国专利 [0047] 200710099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子（例如，菜豆球蛋白、napin， oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人（1985)EMB0 J.4:3047-3053))。它们 可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适 的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(N0S终止子）、花椰菜花叶病毒 CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参 见，例如：Odell等人（I985)Nature 313:810;Rosenberg等人（1987)Gene，56:125;Guerineau 等人（1991)Mol .Gen.Genet,262:141 ;Proudfoot(1991)Cell ,64:671 ;Sanfacon等人Genes Dev.，5:141;Mogen等人（1990)Plant Cell，2:1261 ;Munroe等人（1990)Gene，91:151; Ballad等人（1989)Nucleic Acids Res.l7:7891;Joshi等人（1987)Nucleic Acid Res·， 15:9627)。
[0048]可用现有的表达载体构建含有LMM5.1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体 包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、 pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb (CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷 酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷 酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠癭瘤诱导(Ti)质粒基因（如胭脂碱合成酶基因 Nos)、 植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3'端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因 构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可 以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整 个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可 以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细 胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编 码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基 因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptll基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar 基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草 甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能 力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基 因，直接以逆境筛选转化植株。
[0049]上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述质粒具体可为 PCAMBIA1300或pTCK303。
[0050] B3)所述重组载体可含有序列3的第1490-6521位或序列1所示的用于编码LMM5.1 的DNA序列;进一步B3)所述重组载体具体可为pLMM5.1: : LMM5.1。所述pLMM5.1: : LMM5.1为 将PCAMBIA1300的BamH I和Hindm识别位点间的DNA序列替换为序列3所示的DNA序列得到 的表达序列2所示的LMM5.1的重组载体。
[0051] B16)所述重组载体可含有降低LMM5.1表达的核酸分子。在本发明的一个实施例 中，所述重组载体为pTCK303-RNAi，所述pTCK303-RNAi为在BamHI和ΚρηΙ识别位点间反向插 入序列表中序列1的第515bp至第840bp所示的核苷酸序列，并在内含子之后的Spel和SacI 识别位点间正向插入序列表中序列1第515bp至第840bp所示的核苷酸序列得到的重组载 体。
[0052]上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。所述细菌具体可为农杆菌，如 农杆菌EHA105。
[0053]上述应用中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包 括繁殖材料。
[0054]上述应用中，B15)所述核酸分子具体可为与序列表中序列1的第515-840位核苷酸 所示的DNA片段反向互补的DNA分子。
[0055] 为解决上述技术问题，本发明还提供了 LMM5.1或所述生物材料的下述任一应用：
[0056] H1、在培育抗病性降低或增加植物中的应用；
[0057] H2、在制备降低或提高植物抗病性产品中的应用；
[0058] H3、在培育超敏反应性降低或增加植物中的应用；
[0059] H4、在制备降低或提尚植物超敏反应性广品中的应用；
[0060] H5、在制备类病变突变体中的应用。
[0061] 为解决上述技术问题，本发明还提供了调控植物抗病性或超敏反应性产品，所述 产品含有LMM5.1或所述生物材料。
[0062]上述产品中，所述产品可以以LMM5.1或所述生物材料作为活性成分，还可以将 LMM5.1或所述生物材料与其它抗病性物质进行组合得到的组合物作为活性成分。
[0063] 为解决上述技术问题，本发明还提供了下述Ml)-M4)中的任一种：
[0064] Ml)培育抗病性转基因植物的方法，包括降低目的植物中LMM5.1的编码基因的表 达，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物；
[0065] M2)培育超敏反应性增强转基因植物的方法，包括降低目的植物中LMM5.1的编码 基因的表达，得到超敏反应高于所述目的植物的转基因植物；
[0066] M3)培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入下述1)或2)得 到转基因植物；
[0067] 1)LMM5.1的编码基因；
[0068] 2)含有LMM5.1的编码基因的表达盒；
[0069] 所述转基因植物与所述受体植物相比抗病性降低；
[0070] M4)培育超敏反应性降低的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述1)或 所述2)得到转基因植物;所述转基因植物与所述受体植物相比超敏反应性降低。
[0071 ]上述方法中，降低目的植物中LMM5.1的编码基因的表达是通过将B15)所述核酸分 子导入所述目的植物实现的；
[0072]所述LMM5.1的编码基因为B1)所述核酸分子;所述表达盒为B2)所述表达盒。
[0073] 在本发明的实施例中，所述LMM5.1的编码基因（即序列3的第1490-6521位核苷酸 所示的DNA分子)通过含有LMM5.1基因表达盒的LMM5.1基因重组表达载体导入目的植物中。 所述LMM5.1基因表达盒中，启动LMM5.1基因转录的启动子为序列3的第1 -1489位所示的DNA 分子，终止LMM5.1基因转录的终止子为序列3的第6522-8075位所示的DNA分子。
[0074] 上述方法中，其中所述LMM5.1基因可先进行如下修饰，再导入受体种子植物中，以 达到更好的表达效果：
[0075] 1)根据实际需要进行修饰和优化，以使基因高效表达;例如，可根据受体植物所偏 爱的密码子，在保持本发明所述LMM5.1基因的氨基酸序列的同时改变其密码子以符合植物 偏爱性;优化过程中，最好能使优化后的编码序列中保持一定的GC含量，以最好地实现植物 中导入基因的高水平表达，其中GC含量可为35%、多于45%、多于50%或多于约60% ;
[0076] 2)修饰邻近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻译有效起始;例如，利用在植物中已 知的有效的序列进行修饰；
[0077] 3)与各种植物表达的启动子连接，以利于其在植物中的表达;所述启动子可包括 组成型、诱导型、时序调节、发育调节、化学调节、组织优选和组织特异性启动子；启动子的 选择将随着表达时间和空间需要而变化，而且也取决于靶物种；例如组织或器官的特异性 表达启动子，根据需要受体在发育的什么时期而定;尽管证明了来源于双子叶植物的许多 启动子在单子叶植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，选择双子叶植物启动子用于 双子叶植物中的表达，单子叶植物的启动子用于单子叶植物中的表达；
[0078] 4)与适合的转录终止子连接，也可以提高本发明基因的表达效率；例如来源于 CaMV的tml，来源于rbcS的E9;任何已知在植物中起作用的可得到的终止子都可以与本发明 基因进行连接；
[0079] 5)引入增强子序列，如内含子序列（例如来源于Adhl和bronzel)和病毒前导序列 (例如来源于TMV，MCMV和AMV)。
[0080] 所述LMM5.1基因表达载体可通过使用T i质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转 化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化 的植物组织培育成植株。
[0081] 所述方法还包括从导入序列3的第1490-6521位或序列1所示的LMM5.1的编码区序 列的植株中筛选表达所述编码基因的植株，得到转基因植物。
[0082]在本发明的一个实施例中，与序列表中序列1的第515-840位核苷酸所示的DNA片 段反向互补的DNA分子通过pTCK303载体导入所述目的植物中。
[0083]本发明中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述LMM5.1基因转化目的植物得到 的第一代转基因植物和降低LMM5.1表达的转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可 以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种， 特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
[0084] 本发明中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物;所述目的植物和所述受体植 物均可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物为禾本科植物，如水稻。
[0085] 本发明中，所述抗病性可为抗白叶枯病或稻瘟病。所述白叶枯病可由白叶枯病菌 引起，所述稻瘟病可由稻瘟病菌引起。所述白叶枯病菌可为白叶枯病生理小种PX0145,所述 稻瘟病菌可为稻瘟病生理小种JL062401、JL021605、G9、G11、B8和/或823。
[0086] 实验证明，本发明的LMM5.1与植物的抗病性相关。1 )LMM5.1基因的表达抑制后植 物的抗病性增强：用白叶枯病生理小种PX0145侵染LMM5.1基因的表达受到抑制的植物 (Nip. LMM5.u转基因植株），Nip.LMM5.u转基因植株的白叶枯病斑长度(0.7±0.6cm)显著短于 野生型植物(6.5± 1.6cm)。2)11^5.1可以降低植物的抗病性：用白叶枯病生理小种PX0145 侵染转LMM5.1基因植物，转LMM5.1基因植物的白叶枯病斑长度(6.8 ± 1.7cm)显著长于未转 LMM5.1基因植物（1.3 ±0.8cm)。本发明的LMM5.1可以调控植物的超敏反应性。LMM5.1基因 的表达抑制后植物的超敏反应性增强:LMM5.1基因的表达受到抑制的植物叶片与叶鞘形成 褐色的斑点，并且台酚蓝染色发现植株上的斑点部位的细胞已经死亡或正在死亡的进行 中；转空载体植株与日本晴的表型基本无差异，均无褐色斑点。LMM5.1可以降低植物的超敏 反应性:将LMM5.1基因转至发生超敏反应的植物中，超敏反应性下降。实验证明，可以利用 LMM5.1及其基因调控植物的抗病性与超敏反应性。
[0087] 生物材料保藏说明
[0088] 生物材料的分类命名：水稻(Oryza sativa)
[0089] 生物材料的菌株编号：lmm5
[0090] 生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 [0091 ] 生物材料的保藏单位简称:CGMCC
[0092]生物材料的保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物 研究所，邮政编码:100101
[0093]生物材料的保藏日期:2016年05月27日
[0094] 生物材料的保藏中心登记入册编号:CGMCC No. 11947
【附图说明】
[0095] 图1为pTCK300-RNAi的LB与RB间的结构示意图。
[0096] 图2为lmm5在RNAi抑制转基因植株中的表达。
[0097] 图3为突变体1_5的表型鉴定。其中，A为整株表型，B为叶片表型，C为叶鞘表型。
[0098] 图4为台酸蓝染色结果。
[0099] 图5为RNAi抑制转基因植株Nip. ^*5上的表型。
[0100] 图6为RNAi抑制转基因植株的白叶枯病斑长度。
[0101 ]图7为日本晴和lmm5对稻瘟病的抗性调查。
[0102]图8为日本晴和lmm5对5个白叶枯病小种的抗性调查。
[0103] 图9为表达载体pLMM5.1: :LMM5.1的LB与RB间的结构。
[0104] 图10为表达载体pUbi: :LMM5.4的LB与RB间的结构。
[0105] 图11为转基因植株的表型。
[0106] 图12为转基因植株的白叶枯病斑长度。
[0107] 其中，Nip.表示日本晴。
【具体实施方式】
[0108] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐 明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0109] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0110] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0111] 下述实施例中的pTCK303(Wang，M.，Chen，C.，Xu，Y.Y.，Jiang，R.X.，Han，Y.，Xu， Z.H.,and Chong,K.(2004).A practical vector for efficient knockdown of gene expression in rice(0ryza sativa L.).Plant Molecular Biology Reporter 22,409-417.)公众可从
【申请人】处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不 可作为其它用途使用。
[0112] 下述实施例中的白叶枯病生理小种PX0145(Chen，H.，Li，C.，Liu，L.，Zhao，J.， Cheng,X.,Jiang,G.,and Zhai,ff.(2016).The Fd-G0GATlmutant gene lc7 confers resistance to Xanthomonas oryzae pv.Oryzae in rice.Scientific reports 6.)公众 可从
【申请人】处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。 [0113]下述实施例中的稻瘟病生理小种B23 (孙雁，王云月，何月秋，李成云，周江鸿，朱有 勇，候选抗病基因在水稻品种多样性研究中的应用，中国农业科学，2005,38(11):2227-2232)公众可从
【申请人】处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它 用途使用。
[0114] 实施例1、抑制LMM5.1基因的表达可以提高水稻的抗病性
[0115] 一、LMM5. lRNAi质粒pTCK303-LMM5. li的构建
[0116] 1、提取水稻品种日本晴的总RNA，反转录为cDNA。
[0117] 2、根据LMM5.1的CDS序列设计引物RNAi-F和RNAi-R，其中在RNAi-F的5'端加入Spe Ι/Κρη I酶切位点，在RNAi-R的5'端加入Sac I/BamH I酶切位点。
[0118] RNAi-F:5 '-actagtggtaccAGAATGAGGATGTGGCCCAG-3 '
[0119] RNAi-R:5 '-gagctcggatccTTCACTGCTTTCATCCATAGCC-3 '
[0120] 3、以步骤1的cDNA为模板，用RNAi-F和RNAi-R组成的引物对进行PCR扩增，得到扩 增产物。
[0121] 4、回收扩增产物，与pEASY-Blunt载体(北京全式金生物技术有限公司)连接，获得 重组载体 PEASY-LMM5.1 i。
[0122] 5、用限制性内切酶Κρη I和BamH I酶切质粒pEASY-LMM5.1i，回收338bp左右的酶 切产物；用限制性内切酶Κρη I和BamH I酶切RNAi双元载体pTCK303,回收骨架载体;将上述 两种回收产物相连，测序，将序列正确的载体命名为中间载体pTCK303-LMM5.1i-re VerSe。
[0123] 6、用限制性内切酶Spe I和Sac I酶切pEASY-LMM5.1i，回收350bp左右的酶切产 物；用限制性内切酶Spe I和Sac I酶切中间载体pTCK303-LMM5. li-reverse;将上述两种回 收产物相连，测序，将序列正确的载体命名为PTCK303-LMM5.1 i。
[0124] 根据测序鉴定，对pTCK303_RNAi的结构描述如下:在植物玉米Ubiquitin启动子后 的BamHI和ΚρηΙ识别位点间反向插入序列表中序列1的第515bp至第840bp所示的核苷酸序 列，其后是一个载体自带的水稻内含子，在内含子之后的Spel和SacI识别位点间正向插入 序列表中序列1第515bp至第840bp所示的核苷酸序列。重组质粒pTCK300-RNAi的LB与RB间 的结构示意图见图1。
[0125] 二、转基因植物的获得
[0126] 将pTCK303-RNAi导入农杆菌EHA105中，利用得到的重组农杆菌与农杆菌介导的转 基因方法(Kumar et al. ,2005)转化日本晴，获得了47个To代阳性转基因植株(Nip.?ΜΜ5·η)。
[0127] 将pTCK303导入农杆菌ΕΗΑ105中，转化日本晴，得到转空载体植株。
[0128] 在47个To代阳性转基因植株(Ν?ρ···η)中随机选取15株（linel-linel5)，利用引 物对（LMM-F: CTTGACTCTCCAGGCCATAAA 和 LMM-R: GTCCATGCCAGCTTCAAATG)在 RNA 水平上对 LMM5.1基因的表达量进行检测，结果如2所示，结果显示，与野生型相比（Nip.)，各 Nip.^*5·11株系中的LMM5.1基因的表达量均显著下降。
[0129] 三、转基因植株的表型鉴定和抗病性鉴定
[0130] 突变体lmm5从苗期开始，该突变体叶片上自发形成褐色的斑点，当完全叶抽出以 后，叶鞘上也会出现类似的斑点，这些斑点呈散发状独立存在，并且一直持续到植株自然死 亡（图3)。
[0131] 用台酸蓝(Trypan Blue)染色法检测lmm5叶片上褐色斑点处的细胞是否死亡。台 酚蓝是一种细胞活性染料，正常的活细胞胞膜结构完整，台酚蓝不能进入胞内，细胞无法被 染色;而细胞死亡或细胞膜出现不可逆损伤时，胞膜的通透性增加，细胞可以被台酚蓝染成 蓝色。经台酚蓝染色后发现，日本晴的叶片上无蓝色斑点的生成，而突变体lmm5叶片上斑点 处及斑点周围有深蓝色着色点，说明该部位的细胞已经死亡或正在死亡的进程中（图4)。
[0132] 而在47个To代Nip._·η阳性转基因植株中，43株的叶片与叶鞘均表现出与lmm5相 同的表型（图5)，叶片与叶鞘形成褐色的斑点，并且台酚蓝染色发现植株上斑点处及斑点周 围有深蓝色着色点，表明斑点部位的细胞已经死亡或正在死亡的进行中；转空载体植株与 日本晴的表型基本无差异，均无褐色斑点。
[0133] 将上述43株To代Nip.^?5·11阳性转基因植株进行自交，得到不再发生性状分离的 Nip .LMM5'U T2代阳性转基因植株（即纯合转基因植株），用白叶枯病生理小种PX0145进行侵 染，以日本晴、转空载体植株和1_5为对照，具体侵染方法如下：
[0134] 将保存于-70°C的白叶枯病生理小种ΡΧ0145接种到PSA培养基（马铃薯300g/L，Ca (NOS)〗· 4H20 0.5g/L，Na2HP〇4 · 12H20 2.0g/L，蔗糖 15g/L，琼脂粉 15g/L)上复苏，保存至4 °C冰箱内备用。经在鉴定水稻品种上检测其具有标准毒性后，于接种前在PSA培养基上划 线，28 °C培养72小时。待细菌长的浓密而均匀，用纯净水洗脱细菌，调节浓度至109cfu/ml进 行接种。接菌（菌侵染）方法采用人工剪叶接种法（Kauffman，H.，Reddy，A.，Hsiek, S. and Merca,S.(1973).An improved technique for evaluating resistance of rice varieties to Xanthomonas oryzae pv.oryzae.Plant Dis.Rep.57,537_541 ·)，每株接种 3-5个叶片，每个叶片减去顶端l-2cm。接种两周后，当病斑长度明显且稳定时进行调查，每 一植株测量3-5个叶片，最少调查10株，求其平均值并计算正负偏差作为抗性指标。
[0135] 两周后调查病情。结果显示，Nip. L·5·11转基因植株的白叶枯病斑长度（0.7 土 0.6cm)与lmm5(l · 3±0.8cm)无显著差异，但显著短于日本晴(6.5± 1.6cm)(图6)，转空载体 植株的白叶枯病斑长度与日本晴无显著差异。
[0136] 以上结果说明，通过对日本晴中LMM5.1的表达进行干扰，转基因植株无论在表型 上还是在抗病性上，均与lmm5突变体一致，LMM5.1的表达受到干扰后水稻的抗病性增强。
[0137] 上文中，lmm5 ( 1 e s i on mimi c mutan t 5 )是由日本晴（Ory za sat i va 8 8口.」3口〇11；^3)得到的一个性状稳定的类病变突变体，11]11115已于2016年05月27日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号:CGMCC No. 11947。 利用苗期喷雾法和分蘖期注射法对日本晴和lmm5接种6个稻瘟病生理小种几062401、 几021605、69、611、88和823，分别于三天和一周后进行抗性调查。结果显示，无论在苗期还 是在分蘖期，接过菌的日本晴叶片上都有明显的稻瘟病病斑，说明这六个小种是日本晴的 亲和小种;在接过菌的1_5叶片上，虽然有自发形成的褐色坏死斑，却几乎没有稻瘟病菌侵 染的痕迹（图7)。因此，lmm5对所有用于检测的稻瘟病小种均有较高的抗性。用剪叶法在分 蘖期对日本晴和lmm5接种5个白叶枯病生理小种PX086、PX071、PX099、PX0145和PX0280，接 种两周后进行病情调查。结果显示，日本晴对这5个小种均有不同程度的感病，而lmm5却对 每个小种都表现出高抗（图8)。以上结果显示，lmm5对所有用于接种的稻瘟病和白叶枯病小 种抗性均显著提高。
[0138] 实施例2、LMM5.1和LMM5.4可以降低水稻的抗病性
[0139] -、表达载体pLMM5.1: :LMM5.1 的构建
[0140] 1、提取水稻品种日本晴的DNA。
[0141] 2、以步骤1的DNA为模板，用LMM5. lcoml-F和LMM5. lcoml-R组成的引物对进行PCR 扩增，得到5181bp的扩增产物"片段a"。
[0142] LMM5.lcoml-F:5'-GGTTAATGTTGGCGCCGCTGGTGGTATTCATC-3'
[0143] LMM5.lcoml-R:5'-CCAGGTAACAGATGAATCTTTGAAGTTGCATG-3'
[0144] 回收扩增产物，与pEASY-Blunt载体连接，构建重组质粒pEASY-a。
[0145] 3、以步骤1的DNA为模板，用LMM5.1com2-F和LMM5.1com2-R组成的引物对进行PCR 扩增，得到3196bp的扩增产物"片段b"，其中5'端加入一个Xba I酶切位点。
[0146] LMM5.lcom2-F:5，-tctagaAGACTTTGGTGGTGACCCTGAGATA-3'
[0147] LMM5·1com2-R:5 '-CAAATAACTAAAAGAGTGACGG-3 '
[0148] 回收扩增产物，与pEASY-Blunt载体连接，构建重组质粒pEASY-b。
[0149] 4、以步骤1的DNA为模板，用LMM5.1com3-F和LMM5.1com3-R组成的引物对进行PCR 扩增，得到3342bp的扩增产物"片段c"，其中3'端加入一个Hindm酶切位点。
[0150] LMM5.lcom3-F:5'-AAGCTTCGGCGTTGAACAGCTTATTGTT-3'
[0151] LMM5·1com3-R:5 '-aagcttTGATCCCTCAACACCCCGATGAAAGAACAG-3 '
[0152] 回收扩增产物，与pEASY-Blunt载体连接，构建重组质粒pEASY-c。
[0153] 5、用限制性内切酶Pst I和Hindm酶切步骤4中的重组质粒pEASY-c，回收1742bp 的插入片段；用限制性内切酶Pst I和Hindm酶切双元表达载体PCAMBIA1300,回收骨架片 段;将上述两种回收产物相连，得到中间质粒pCAMBIAl 300-c。
[0154] 6、用限制性内切酶Xba I和Pst I酶切步骤3中的重组质粒pEASY-b，回收3057bp的 插入片段;用限制性内切酶Xba I和Pst I酶切步骤5中的中间载体pCAMBIA1300-c，回收酶 切产物;将上述两种回收产物相连，得到中间质粒pCAMBIA1300-(b+c)。
[0155] 7、用限制性内切酶BamH I和Mfe I酶切步骤2中的重组质粒pEASY-a，回收3905bp 的插入片段;用限制性内切酶BamH I和Mfe I酶切步骤6中的中间质粒pCAMBIA1300-(b+c)， 回收酶切产物;将上述两种回收产物相连，得到重组质粒pCAMBIA1300-(a+b+c)，即互补表 达载体PLMM5.1: : LMM5.1。
[0156] 根据测序鉴定，对pLMM5.1: :LMM5.1的结构描述如下:pLMM5.1: :LMM5.1为在双元 载体pCAMBIA1300的BamH I和HindΙΠ 酶切位点之间插入了序列3所示的DNA分子得到的重组 载体，重组质粒PLMM5.1: : LMM5.1的LB与RB间结构示意图见图9。
[0157] 序列3的第1490-6521位为LMM5.1基因的序列，编码序列2所示的LMM5.1蛋白质， LMM5.1基因的CDS序列如序列1所示。重组质粒pLMM5.1: :LMM5.1中，序列3的第1-1489位启 动LMM5.1基因的表达，序列3的第6522-8075位终止LMM5.1基因的表达。
[0158] 二、表达载体pUbi: :LMM5.4的构建
[0159 ] 1、提取水稻品种明恢63的总RNA，反转录为cDNA。
[0160] 2、以步骤1的cDNA为模板，用LMM5.40E1-F和LMM5.40E1-R组成的引物对进行PCR扩 增，得到1988bp的扩增产物"片段d"，其中通过引物在5'端和3'端分别加入Κρη I和Spe I酶 切位点以及保护碱基。
[0161] LMM5·40E1-F:5 '-CGGggtaccATGCCACGCAAGGTTGTCTC-3 '
[0162] LMM5·40E1-R:5 '-GGactagtTCAGTTCTGATCTTGCCGGAGTAC-3 '
[0163] 3、用限制性内切酶Κρη I和Spe I酶切步骤2中的"片段d"，回收产物。
[0164] 4、用限制性内切酶Κρη I和Spe I酶切pTCK303,回收酶切骨架载体。
[0165] 5、将步骤3和步骤4中的回收产物连接，获得重组载体，将得到的重组载体命名为 pUbi::LMM5.4〇
[0166] 根据测序鉴定，对pUbi: :LMM5.4的结构描述如下：pUbi: :LMM5.4为在双元载体 PTCK303的Ubiquitin启动子之后的Spe I和Κρη I识别位点间插入序列表中序列4所示的 197lbp LMM5.4基因得到的重组载体。重组质粒pUbi : : LMM5.4的LB与RB间的结构示意图见 图10，pUbi: :LMM5.4能表达序列5所示的LMM5.4蛋白质。
[0167] 三、转基因植物的获得
[0168] 将pLMM5.1: :LMM5.1导入农杆菌EHA105中，利用得到的重组农杆菌与农杆菌介导 的转基因方法(Kumar et al.，2005)转化Imm5(lmm5已于2016年05月27日保藏于中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号:CGMCC No. 11947)，获得 了 41个To代阳性转基因植株·1)。
[0169] 将植物双元载体pCAMBIA1300导入农杆菌EHA105中，利用得到的重组农杆菌与农 杆菌介导的转基因方法(Kumar et al.，2005)转化1_5,得到转空载体水稻，作为转基因水 稻的对照。共获得40个T0代阳性转基因植株(lmm513QQ)。
[0170] 将pLMM5.1: :LMM5.1导入农杆菌EHA105中，利用得到的重组农杆菌与农杆菌介导 的转基因方法（Kumar et al. ,2005)转化lmm5,获得了33个To代阳性转基因植株 (lmm5LMM5'40E)〇
[0171] 将pTCK303导入农杆菌EHA105中，利用得到的重组农杆菌与农杆菌介导的转基因 方法(Kumar et al.，2005)转化lmm5,得到转空载体水稻，作为转基因水稻的对照。共获得 40个T0代阳性转基因植株(其名称为l_5 13QQUbi)。
[0172] 四、转基因植株的表型鉴定和抗病性鉴定
[0173] 实验重复三次：
[0174] 所有41个Ιπιπιδ?5·1和33个lmm5LMM5'4QE To代植株叶片和叶鞘上均无类病斑的发生 (图11)，表型与日本晴相同。Ιπιπιδ··1和Ιπιπιδ··41^^!代和T 2代的阳性转基因植株也无类 病斑的发生。而40个lmm513QQ和lmm513_ bi与lmm5的表型无明显不同，均有斑点，并且经台酚 蓝染色，发现斑点处及斑点周围有深蓝色着色点，说明该部位的细胞已经死亡或正在死亡 的进程中，lmm5 13QQ和lmm513_bi与Nip ·LMM5·u仍然保持类病变表型（图11)。说明LMM5 · 1和 LMM5.4均可以功能互补LMM5.1基因的表达受抑制而引起的细胞死亡表型。
[0175] 将上述To代Ιπιπιδ^Μ5·1和Ιπιπιδ^Μ5·4?阳性转基因植株进行自交，得到不再发生形状 分离的1πιπι5?ΜΜ5 · 代阳性转基因植株(即纯合转基因植株)与1πιπι5?ΜΜ5 · 4C)ET2代阳性转基因植 株（即纯合转基因植株），用白叶枯病生理小种PX0145侵染进行侵染，以日本晴、Nip.^胃 5·11、 和l_513(K)Ubl为对照，具体侵染方法如下：
[0176] 将保存于_70°C的白叶枯病生理小种PX0145接种到PSA培养基（马铃薯300g/L，Ca (NOS)〗· 4H20 0.5g/L，Na2HP〇4 · 12H20 2.0g/L，蔗糖 15g/L，琼脂粉 15g/L)上复苏，保存至4 °C冰箱内备用。经在鉴定水稻品种上检测其具有标准毒性后，于接种前在PSA培养基上划 线，28 °C培养72小时。待细菌长的浓密而均匀，用纯净水洗脱细菌，调节浓度至109cfu/ml进 行接种。接菌（菌侵染）方法采用人工剪叶接种法（Kauffman，H.，Reddy，A.，Hsiek, S. and Merca,S.(1973).An improved technique for evaluating resistance of rice varieties to Xanthomonas oryzae pv.oryzae.Plant Dis.Rep.57,537-541 ·)，每株接种 3-5个叶片，每个叶片减去顶端l-2cm。接种两周后，当病斑长度明显且稳定时进行调查，每 一植株测量3-5个叶片，最少调查10株，求其平均值并计算正负偏差作为抗性指标。
[0177] 两周后调查病情。结果显示，两种转基因植株的白叶枯病斑长度均与日本晴基本 无显著差异，并且均分别显著长于lmm5和lmm5 13QQ(图代阳性转基因植株、 lmm5LMM5'4QET2代阳性转基因植株、日本晴、lmm5和lmm5 13QQ的白叶枯病斑长度分别为6 · 8 土 1.7cm、6.6±1.7cm、6.5±l. 6cm、1 · 3±0 · 8cm和1 · 0±0 · 6cm，代阳性转基因植株 的白叶枯病斑长度分别为日本晴、lmm5和lmm513QQ的1 · 0倍、5 · 2倍和6 · 8倍，lmm5LMM5'4QET2代 阳性转基因植株的白叶枯病斑长度分别为日本晴、1_5和1_5 13()()的1.0倍、5.1倍和6.5倍。 说明LMM5.1和LMM5.4均能回复由LMM5.1基因的表达受抑制而引起的植株抗病性增强表型， LMM5.1和LMM5.4均可以降低水稻的抗病性。
【主权项】
1. 蛋白质LMM5.1在调控植物抗病性和/或调控植物超敏反应性中的应用;所述蛋白质 1^丽5.1是如下厶1)^2)或八3) : A1)氨基酸序列是序列2的蛋白质； A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且具有相同功能的蛋白质； A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。2. 与权利要求1中所述蛋白质LMM5.1相关的生物材料在调控植物抗病性和/或调控植 物超敏反应性中的应用;所述生物材料为下述B1)至B16)中的任一种： B1)编码权利要求1中所述蛋白质LMM5.1的核酸分子； B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体； B4)含有B2)所述表达盒的重组载体； B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物； B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物； B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物； B8)含有Μ)所述重组载体的重组微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物细胞系； Β10)含有Β2)所述表达盒的转基因植物细胞系； Β11)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物组织； Β12)含有Β2)所述表达盒的转基因植物组织； Β13)含有Β1)所述核酸分子的转基因植物器官； Β14)含有Β2)所述表达盒的转基因植物器官； Β15)降低权利要求1中所述蛋白质LMM5.1表达的核酸分子； Β16)含有Β15)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。3. 根据权利要求2所述应用，其特征在于:Β1)所述核酸分子为如下bl )-b4)中任一种： bl)编码序列是序列表中序列3的第1490-6521位核苷酸的cDNA分子或DNA分子； b2)核苷酸序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子； b3)与bl)或b2)限定的核苷酸序列具有75%或75%以上同一性，且编码权利要求1中所 述蛋白质LMM5.1的cDNA分子或基因组DNA分子； b4)在严格条件下与bl)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述蛋白质 LMM5.1的cDNA分子或基因组DNA分子； B2)所述表达盒为序列3所示的DNA分子； B15)所述核酸分子为与序列3的第1490-6521位或序列1所不的DNA分子中任一片段反 向互补的DNA分子。4. 权利要求1中所述蛋白质LMM5.1或权利要求2或3中所述生物材料的下述任一应用： H1、在培育抗病性降低或增加植物中的应用； H2、在制备降低或提高植物抗病性产品中的应用； H3、在培育超敏反应性降低或增加植物中的应用； H4、在制备降低或提尚植物超敏反应性广品中的应用； H5、在制备类病变突变体中的应用。5. 调控植物抗病性或超敏反应性产品，含有权利要求1中所述蛋白质LMM5.1或权利要 求2或3中所述生物材料。6. 下述Ml) -M4)中的任一种： Ml)培育抗病性转基因植物的方法，包括降低目的植物中权利要求1中所述蛋白质 LMM5.1的编码基因的表达，得到抗病性高于所述目的植物的转基因植物； M2)培育超敏反应性增强转基因植物的方法，包括降低目的植物中权利要求1中所述蛋 白质LMM5.1的编码基因的表达，得到超敏反应高于所述目的植物的转基因植物； M3)培育抗病性降低的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入下述1)或2)得到转 基因植物； 1) 权利要求1中所述蛋白质LMM5.1的编码基因； 2) 含有权利要求1中所述蛋白质LMM5.1的编码基因的表达盒； 所述转基因植物与所述受体植物相比抗病性降低； M4)培育超敏反应性降低的转基因植物的方法，包括向受体植物中导入所述1)或所述 2)得到转基因植物;所述转基因植物与所述受体植物相比超敏反应性降低。7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于：降低目的植物中权利要求1中所述蛋白质 LMM5.1的编码基因的表达是通过将权利要求2或3中B15)所述核酸分子导入所述目的植物 实现的； 权利要求1中所述蛋白质LMM5.1的编码基因为权利要求2或3中B1)所述核酸分子;所述 表达盒为权利要求2或3中B2)所述表达盒。8. 根据权利要求1-4中任一所述应用、权利要求5所述产品或权利要求6或7所述方法， 其特征在于:权利要求1-5中任一所述植物为单子叶植物或双子叶植物;权利要求6或7中所 述目的植物和所述受体植物均为单子叶植物或双子叶植物。9. 根据权利要求8所述应用、所述产品或所述方法，其特征在于:所述单子叶植物为禾 本科植物。10. 根据权利要求1-4中任一所述应用，权利要求5所述产品，权利要求6或7所述方法， 或权利要求8或9所述应用、所述产品或所述方法，其特征在于： 所述抗病性为抗白叶枯病或稻痕病； 和/或，所述白叶枯病由白叶枯病菌引起，所述稻瘟病由稻瘟病菌引起。
【文档编号】C07K14/415GK106084022SQ201610460806
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月22日
【发明人】江光怀, 赵纪莹, 翟文学
【申请人】中国科学院遗传与发育生物学研究所