一种乙酰化柚皮苷合成物及在成骨细胞增殖中的医用用图
【专利摘要】本发明公开了一种乙酰化柚皮苷合成物(NGA)，本发明还进一步提供了该化合物在小鼠成骨细胞增殖中的应用，提供了一种柚皮苷新产物NGA，以天然产物柚皮苷为底物酶促乙酰化合成的新化合物，能够显著促进小鼠正常成骨细胞和经TNF?α诱导损伤的成骨细胞增殖，可以制备促进成骨细胞增殖药物；本发明合成工艺比较简单，成本较低，有利于工业化成产。
【专利说明】
一种乙酰化柚皮苷合成物及在成骨细胞増殖中的医用用途
技术领域
[0001] 本发明公开了一种乙酰化柚皮苷合成物(NGA)，本发明还进一步提供了该化合物 在小鼠成骨细胞增殖中的应用，属于涉及酶合成和医药应用技术领域。
【背景技术】
[0002] 骨代谢是成骨细胞和破骨细胞的动态平衡过程，该平衡的失调将引发骨代谢性疾 病。牙周炎是最常见和多发的口腔骨代谢疾病，我国大部分人患有各种牙周炎，且呈现逐年 上升的趋势，牙周炎主要的病理改变是牙周袋形成和牙槽骨吸收，导致牙松动甚至脱落。长 期以来，国内外学者一直致力于研究牙槽骨再生和重建方法，然而这些方法虽有一定的应 用价值和前景，但是各自都存在着一定的缺憾。至今，临床上不能根治牙周炎的主要原因之 一是无效果良好的阻断牙槽骨吸收或促进牙槽骨再生的药物，因此寻求一种既费用经济、 疗效显著而又安全无明显毒副作用的治疗方法十分紧迫。
[0003] 中医认为骨碎补有明显镇静和镇痛作用，并可刺激成骨细胞代偿性增生，改善成 骨细胞功能，推迟其退行性病变。李顺祥等报道指出柚皮苷(Naringin，NG)为骨碎补的主要 有效成分，大量存在于柚、葡萄柚和酸橙及其变种的果皮及果实中，属于二氢黄酮甙类，黄 酮贰的甙元，为黄酮类化合物，药理作用广泛，具有促进骨细胞增殖和分化、抗过敏、抗炎、 抗氧化、降血脂、抑癌等多种药理活性，药典规定其含量不少于0.5%。国内外学者在大量的 临床实践中，发现柚皮苷能促进小鼠 MC3T3-E1细胞、小鼠原代培养成骨细胞、人原代培养成 骨细胞和人骨髓间充质干细胞等多种成骨细胞的增殖和分化，且对牙周炎等骨代谢疾病的 防治和治疗有确实疗效。但柚皮苷分子中存在多个酚羟基，脂溶性差，化学性质不稳定，限 制了其生物疗效的发挥。于人体功效方面，柚皮苷不易透过双脂层脂质细胞膜，难以到达靶 向作用点而大大降低其应有的药物效果。本发明涉及一种乙酰化柚皮苷合成物，通过改变 其分子结构，有效的提高柚皮苷对骨代谢疾病的防治疗效。
【发明内容】
[0004] 本发明公开一种乙酰化柚皮苷合成物(缩写:NGA)，是一种以天然产物柚皮苷为底 物酶促乙酰化合成的新化合物，能够显著促进小鼠正常成骨细胞和经TNF-α诱导损伤的成 骨细胞增殖。
[0005] 本发明进一步公开了一种酶促乙酰化柚皮苷合成物的制备方法，适用于工业化大 规模生产。
[0006] 本发明还提供NGA在促进小鼠成骨细胞增殖的医用用途，一定浓度的NGA对小鼠正 常成骨细胞和经TNF-α诱导损伤的成骨细胞的增殖具有显著的促进作用。
[0007] 本发明所述的一种酶促乙酰化柚皮苷合成物(NGA)，具有以下结构式：
其化学名称为:NGA;分子式为:C29H34〇i5;相对分子量为:622.19，核磁鉴定图谱如图1、 图2所示。
[0008] 本发明所述的一种乙酰化柚皮苷合成物的合成方法，包括以下步骤： 将0.05-0.4mmol的柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中；再加入2-4mmol的乙酸乙稀酯，混合均 勾后，另加入8〇-120mg CSL( 1 ipase from Candida sp)或Novozym 435 (immobilized lipase B from Candida antarctica)酶，放置于30°C，100rpm恒温摇床中，保持水活度 0.60，反应24h;反应结束时将酶过滤终止反应并将溶剂旋转浓缩。
[0009] 本发明所述的一种乙酰化柚皮苷合成物的合成方法，最佳制备工艺如下： 柚皮苷和乙酸乙烯酯的摩尔比为〇. 05:2-0.2:3，反应溶剂为20mL丙酮溶液;混合均匀 后，另加入80-120mg CSL或Novozym 435酶，置于30°C，100rpm恒温摇床中，保持水活度 0.60，反应24h;反应结束时将酶过滤终止反应并将溶剂旋转浓缩。
[0010] 本发明所述的一种乙酰化柚皮苷合成物在制备促进成骨细胞增殖药物中的用途。
[0011] 本发明化合物作为药效活性成分能够显著的促进小鼠成骨细胞的增殖，和未修饰 的柚皮苷母体相比，对正常成骨细胞的增殖，相比提高了 1.5-2.8倍;对经TNF-α诱导损伤的 成骨细胞的增殖，相比提高了 2.5-3.6倍。
[0012] 通过以下实验验证本发明的乙酰化柚皮苷合成物能够显著的促进小鼠成骨细胞 增殖 首先建立小鼠成骨细胞培养体系，通过柚皮苷和乙酰化柚皮苷对正常成骨细胞及经 TNF-a诱导损伤成骨细胞刺激作用，以观察对比柚皮苷和乙酰化柚皮苷对成骨细胞增殖的 影响，为乙酰化柚皮苷在成骨损伤组织修复应用上提供实验依据。因此，选用相同浓度梯度 的柚皮苷和乙酰化柚皮苷对小鼠正常成骨细胞及经TNF-a诱导的成骨细胞进行干预，探索 柚皮苷和乙酰化柚皮苷对小鼠成骨细胞增殖的影响。
[0013] 从实验MTT法结果中可以看出：低浓度组对成骨细胞的增值无明显促进作用。中浓 度的柚皮苷和乙酰化柚皮苷对正常成骨细胞以及经TNF-a诱导损伤的成骨细胞增殖都具有 促进作用，且乙酰化柚皮苷的促进作用更显著。高浓度组仅与实验对照组相比有显著性差 异。在正常成骨细胞MTT法结果中发现，lOμg/ml的柚皮苷和乙酰化柚皮苷对正常成骨细胞 的具有促进作用，且和柚皮苷相比，乙酰化柚皮苷对正常成骨细胞的促进作用提高了 1.5-2.6倍。在经TTNF-a诱导损伤的成骨细胞增殖结果中发现，20μg/ml的柚皮苷和乙酰化柚皮 苷对经TTNF-a诱导损伤的成骨细胞增殖具有促进作用，且和柚皮苷相比，乙酰化柚皮苷对 经TTNF-α诱导损伤的成骨细胞促进作用提高了 2.5-3.8倍。可见，经酶促合成的乙酰化柚皮 苷对正常成骨细胞和经TTNF-α诱导损伤的成骨细胞的促进作用都显著提高，分析原因可能 是由于柚皮苷分子结构的改变，增加了其通过磷脂双分子层细胞的能力，更好的发挥了体 内生物活性作用。
[0014] 本发明的积极效果在于:提供了一种柚皮苷新产物NGA，以天然产物柚皮苷为底物 酶促乙酰化合成的新化合物，能够显著促进小鼠正常成骨细胞和经TNF-α诱导损伤的成骨 细胞增殖，可以制备促进成骨细胞增殖药物;本发明合成工艺比较简单，成本较低，有利于 工业化成产。
【附图说明】
[0015] 图1、图2为本发明NGA的核磁鉴定图谱； 图3为本发明NGA和NG对小鼠正常成骨细胞的增殖作用对比； 图4为本发明NGA和NG对经TNF-α诱导损伤的小鼠成骨细胞增殖作用对比。
【具体实施方式】
[0016] 现结合实施例，对本发明做进一步具体说明，但本发明的范围不限于以下实施例。 [0017] 实施例！ 称取0.05mmol柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中，加入2mmo 1乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加 入80mg CSL酶，放置于30° C，lOOrpm恒温摇床中，保持水活度0.60，反应24h。反应结束时将 酶过滤终止反应并将溶剂旋转浓缩。利用HPLC分离纯化反应产物，分离条件为:Thermo C18 (4.6 mmX250 mm Χ5μηι，Agilent, USA)色谱柱；流动相是水(A)和甲醇（13)，〇-5111；[1140-80%(B)，5-15min维持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速1 ·0 ml/min。柱温30°C，进样量为 10 μL;检测波长为330 nm，乙酰化柚皮苷的保留时间分别为10.8 min，收率为89.0%。经核 磁共振谱仪对产物进行结构鉴定，确定反应合成的该物质为目标产物NGA，分子式为： C29H34O15;相对分子量为:622.19。
[0018] 实施例2 称取0.2mmol柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中，加入4mmol乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加入 100mg CSL酶，放置于30° C，lOOrpm恒温摇床中，保持水活度0.60，反应24h。反应结束时将酶 过滤终止反应并将溶剂旋转浓缩。利用HPLC分离纯化反应产物，分离条件为:Therm 〇 C18 (4.6 mmX250 mm Χ5μηι，Agilent, USA)色谱柱；流动相是水(A)和甲醇（13)，〇-5111；[1140-80%(B)，5-15min维持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速1 ·0 ml/min。柱温30°C，进样量为 10 μL;检测波长为330 nm，乙酰化柚皮苷的保留时间分别为10.8 min，收率为92.6%。经核 磁共振谱仪对产物进行结构鉴定，确定反应合成的该物质为目标产物NGA，分子式为： C29H34O15;相对分子量为:622.19。
[0019] 实施例3 称取0.4mmo 1柚皮苷溶于2OmL乙腈溶液中，加入6mmo 1乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加入 120mg CSL酶，放置于30° C，lOOrpm恒温摇床中，保持水活度0.60，反应24h。反应结束时将酶 过滤终止反应并将溶剂旋转浓缩。利用HPLC分离纯化反应产物，分离条件为:Therm 〇 C18 (4.6 mmX250 mmX 5μηι，Agilent，USA)色谱柱；流动相是水（A)和甲醇（B)，0_5min 40- 80%(B)，5-15min维持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速1 ·0 ml/min。柱温30°C，进样量为 10 μL;检测波长为330 nm，乙酰化柚皮苷的保留时间分别为10.8 min，收率为92.0%。经核 磁共振谱仪对产物进行结构鉴定，确定反应合成的该物质为目标产物NGA，分子式为： C29H34O15;相对分子量为:622.19。
[0020] 实施例4 称取0.2mmol柚皮苷溶于20mL丙酮溶液中，加入4mmol乙酸乙稀酯，混合均勾后，另加入 lOOmg Novozym 435酶，放置于30°C，100rpm恒温摇床中，保持水活度0.60,反应24h。反应结 束时将酶过滤终止反应并将溶剂旋转浓缩。利用HPLC分离纯化反应产物，分离条件为： Thermo C18(4.6 mmX250 mmX5ym, Agilent, USA)色谱柱;流动相是水(A)和甲醇(B)，〇-5min 40-80%(B)，5-15min维持80%(B)，15-20min 80-40%(B);流速 1.0 ml/min。柱温30°C， 进样量为10 μL;检测波长为330 nm，乙酰化柚皮苷的保留时间分别为10.8 min，收率为 91.0%。经核磁共振谱仪对产物进行结构鉴定，确定反应合成的该物质为目标产物NGA，分子 式为:C29H34O15;相对分子量为:622.19。
[0021] 以下试验表明本发明合成化合物NGA在促进小鼠成骨细胞增殖方面的效果 试验例1对小鼠正常成骨细胞增殖的促进作用 (1)取对数生长期的小鼠成骨细胞MC3T3-E1至离心管内，调整细胞的浓度为5X104个 细胞/ml，每孔100 μL接种于96孔细胞培养板中，过夜培养，保证细胞状态良好，贴壁正常； (2 )将原料NG和实施例1 -实施例4合成的化合物NGA，过滤除菌，DMEM培养基稀释，作用 小鼠正常成骨细胞MC3T3-E1 48 h，每一个实验组均设置三个重复孔； (3) 药物作用结束后，无菌条件下加入20 μL MTT溶液，在5% C02培养箱中孵育4小时； (4) 加入150 μL DMS0溶解产生的蓝紫色晶体，在492 nm波长条件下测定光吸收值即0D 值； (5) 计算细胞增值率，每个实验组取三个重复孔的平均值； 试验结果：与原料NG相比，使用实施例1-实施例4合成的化合物NGA处理正常成骨细胞 48 h后，对正常成骨细胞的增殖均表现为促进作用。结果见图3。
[0022]结论:实施例1-实施例4合成的化合物NGA与NG原料相比，均可显著促进正常成骨 细胞的增殖，且实施例2合成的化合物NGA对正常成骨细胞的增殖促进作用最显著，相比NG 提高了2.6倍。
[0023] 试验例2 本发明合成化合物NGA对经TNF-α诱导损伤成骨细胞增殖的促进作用 (1)取对数生长期的小鼠成骨细胞MC3T3-E1至离心管内，调整细胞的浓度为5X104个 细胞/ml，每孔100 μL接种于96孔细胞培养板中，过夜培养，保证细胞状态良好，贴壁正常； (2 )将原料NG和实施例1 -实施例4合成的化合物NGA，过滤除菌，DMEM培养基稀释，作用 加入TNF-a诱导损伤的小鼠成骨细胞MC3T3-E1 48 h，每一个实验组均设置三个重复孔； (3) 药物作用结束后，无菌条件下加入20 μL MTT溶液，在5% C02培养箱中孵育4小时； (4) 加入150 μL DMS0溶解产生的蓝紫色晶体，在492 nm波长条件下测定光吸收值即0D 值； (5) 计算细胞增值率，每个实验组取三个重复孔的平均值； 试验结果:与原料NG相比，实施例1-实施例4合成的化合物NGA处理TNF-a诱导损伤的成 骨细胞48 h后，对TNF-α诱导损伤的成骨细胞的增殖均表现为促进作用。结果见图4。
[0024] 结论:实施例1-实施例4合成的化合物NGA与NG原料相比，可显著促进TNF-α诱导损 伤的成骨细胞的增殖，且实施例2合成的化合物NGA对TNF-a诱导损伤的成骨细胞的增殖促 进作用最显著，相比NG提高了 3.8倍。
【主权项】
1. 一种乙酷化抽皮巧合成物，具有W下结构式：其化学名称为:NGA;分子式为:C2讯34〇15;分子量为:622.19。2. 根据权利要求1所述的一种乙酷化抽皮巧合成物的合成方法，包括W下步骤： 将0.05-0.4mmol的抽皮巧溶于20血丙酬溶液中；再加入2-4mmol的乙酸乙締醋，混合均 匀后，另加入80-120mg C化或Novozym 435酶，放置于30°C，100rpm恒溫摇床中，保持水活度 0.60，反应2地;反应结束时将酶过滤终止反应并将溶剂旋转浓缩。3. 根据权利要求1所述的一种乙酷化抽皮巧合成物的合成方法，最佳制备工艺如下： 抽皮巧和乙酸乙締醋的摩尔比为0.05 : 2-0.2 :3，反应溶剂为20mL丙酬溶液;混合均匀 后，另加入80-120mg C化或Novozym 435酶，置于30°C，100巧m恒溫摇床中，保持水活度 0.60，反应2地;反应结束时将酶过滤终止反应并将溶剂旋转浓缩。4. 根据权利要求1所述的一种乙酷化抽皮巧合成物在制备促进成骨细胞增殖药物中的 用途。
【文档编号】C12P19/60GK106083955SQ201610418761
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年6月13日 公开号201610418761.8, CN 106083955 A, CN 106083955A, CN 201610418761, CN-A-106083955, CN106083955 A, CN106083955A, CN201610418761, CN201610418761.8
【发明人】闫国栋, 张迪, 盖彦忻, 王雅妮, 叶绪廷, 姜丽艳, 孟庆繁, 滕利荣
【申请人】吉林大学