黑蚁中含氮化合物的提取方法及含氮化合物的应用

黑蚁中含氮化合物的提取方法及含氮化合物的应用
【专利摘要】本发明公开一种黑蚁中含氮化合物的提取方法及含氮化合物的应用，黑蚁原材料先经二氯甲烷溶剂室温冷浸提取后得到黑蚁滤渣，再将黑蚁滤渣采用质量百分比为60?80 %甲醇溶液室温冷浸提取，提取后的甲醇浓缩液经冷冻干燥处理得甲醇浸膏，然后甲醇浸膏先后经过乙酸乙酯溶液、乙酸乙酯?甲醇混合溶液洗脱后，得到的馏分经进一步分离纯化最终提取出6个含氮化合物。该方法能够使黑蚁中富含抗菌的含氮化合物较高的富集或尽可能多的被提取出来，同时提取分离得到的含氮化合物具有较好的抗菌活性，可进一步为抗菌新药的研发提供先导化合物。
【专利说明】
黑蚁中含氮化合物的提取方法及含氮化合物的应用
技术领域
[0001] 本发明属于天然产物提取领域，具体设及一种黑蚁中含氮化合物的提取方法及含 氮化合物的应用。
【背景技术】
[0002] 拳生昆虫肆虐的生存环境，就像超级细菌体一样，天生能够避开任何入侵的细菌 感染的攻击，呈现特殊的抗菌生存能力，具有很强的防御微生物、细菌的能力，运一生物学 特点为我们寻找新的抗菌天然化合物、解决当前抗生素耐药性的问题提供潜在可能。黑蚁 (化lyrhachzs vzczna Roger)又叫作拟黑多刺蚁，是节肢动物口、昆虫纲、缺翅目、蚁科多 刺蚁属的昆虫，是一种及其远古的社会性昆虫。近年来研究发现黑蚁中存在大量有价值的 次生代谢物和生物活性多样性物质，尤其是其体内含有的抗菌活性成分有待深入研究。

【发明内容】

[0003] 本发明的目的是提供一种黑蚁中含氮化合物的提取方法及含氮化合物的应用，该 方法能够使黑蚁中富含抗菌的含氮化合物较高的富集或尽可能多的被提取出来，同时提取 分离得到的含氮化合物具有较好的抗菌活性，可进一步为抗菌新药的研发提供先导化合 物。
[0004] 本发明所采用的技术方案是：黑蚁中含氮化合物的提取方法，黑蚁原材料先经二 氯甲烧溶剂室溫冷浸提取后得到黑蚁滤渣，再将黑蚁滤渣采用质量百分比为60-80 %甲醇 溶液室溫冷浸提取，提取后的甲醇浓缩液经冷冻干燥处理得甲醇浸膏，然后甲醇浸膏先后 经过乙酸乙醋溶液、乙酸乙醋-甲醇混合溶液洗脱后，得到的馈分经进一步分离纯化最终提 取出6个含氮化合物。
[0005] 作为本发明一种黑蚁中含氮化合物的提取方法的进一步优化，包括W下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料，清洗干净后放入45-50°C烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑 蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量5-10倍的二氯甲烧溶剂室溫冷浸，48-50h 后过滤，将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量5-10倍的二氯甲烧重复提取，过滤，分别 收集滤液和滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤Ξ、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为60-80 %的甲 醇溶液室溫冷浸提取48-5化后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为60- 80 %甲醇溶液室溫冷浸提取，重复上述操作若干次，合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁 60-80 %甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于-10-20°C冰箱中冷冻至结冰状，取出再放置于冷冻 干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑蚁的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤Ξ得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，采用柱色谱法进行分离，先 用乙酸乙醋洗脱后，再用乙酸乙醋、甲醇的混合液进行梯度洗脱，洗脱得到的馈分经进一步 分离纯化得到化合物1-6，结构式如下：
[0006] 作为本发明一种黑蚁中含氮化合物的提取方法的进一步优化，步骤四所述的分离 提纯的具体步骤为:将步骤Ξ得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，用硅胶拌样后，利用 湿法上柱，进行柱色谱分离;取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样，用7-10倍柱体积的乙酸 乙醋洗脱，收集乙酸乙醋馈分，合并浓缩后得到乙酸乙醋提取浸膏，备用；接着用7-10倍柱 体积的乙酸乙醋-甲醇混合液进行梯度洗脱，乙酸乙醋-甲醇洗脱液的梯度比例依次为10: 1、8:2、6:4、4:6、2:8、1:10和0:10，梯度洗脱后，收集得到的乙酸乙醋-甲醇溶液馈分，合并 浓缩后得到乙酸乙醋-甲醇混合浸膏，备用； 取上述黑蚁的乙酸乙醋提取浸膏用乙酸乙醋溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油酸-乙酸乙醋溶液 进行梯度洗脱，石油酸-乙酸乙醋洗脱液的梯度比例依次为1〇:1、8:2、6:4、4:6、2:8、1:10和 0:10，分别收集馈分，TLC检测合并相同馈分，得到不同馈分段共8个组分； 取梯度比例为2:8的石油酸-乙酸乙醋馈分段，进一步通过Se地adex LH-20凝胶色谱进 行纯化制备，收集合并馈分，经过化C分析，分别得到化合物3和化合物4; 取乙酸乙醋-甲醇混合浸膏，用甲醇溶剂充分溶解并拌样干燥，进行柱色谱分离，取 200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后用氯仿-甲醇溶液梯度洗脱，氯仿-甲醇洗脱液的 梯度比例为9:1、7:1、7:3、5:4、4:5、3:7、1:7和1:9，分别收集馈分，化(：检测合并相同馈分， 得到不同馈分段共11个组分； 梯度比例为9:1的氯仿-甲醇馈分经分离纯化后在室溫下静置有淡黄色粉末析出，即化 合物6; 梯度比例为7:1的氯仿-甲醇馈分用液相色谱分离纯化，得到化合物1和化合物2; 梯度比例为5:1的氯仿-甲醇馈分用薄层色谱分离纯化，得到淡黄色油脂状化合物，即 化合物5。
[0007] 作为本发明一种黑蚁中含氮化合物的提取方法的进一步优化，梯度比例为2:8的 石油酸-乙酸乙醋馈分采用Se地adex LH-20凝胶色谱进行纯化过程中，流动相采用摩尔比 例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为3-4滴/min。
[000引作为本发明一种黑蚁中含氮化合物的提取方法的进一步优化，梯度比例为7:1的 氯仿-甲醇馈分用液相色谱分离纯化的色谱条件为：流速：8mL/min;流动相：CH30H:H20= 65% :35%等度分离。
[0009] 作为本发明一种黑蚁中含氮化合物的提取方法的进一步优化，梯度比例为5:1的 氯仿-甲醇馈分用薄层色谱分离纯化，溶剂洗脱剂为摩尔比为7:3的氯仿-丙酬混合溶液。
[0010] 所述的黑蚁中含氮化合物的提取方法中得到的化合物1和化合物2在抗菌方面的 应用。
[0011] 所述的黑蚁中含氮化合物的提取方法中得到的化合物1和化合物2在抗金黄色葡 萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆 菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性中的应用。
[0012] 与现有技术相比，本发明至少具有下述优点及有益效果： 本发明提供的黑蚁中含氮化合物的提取方法能够使黑蚁中富含抗菌的含氮化合物较 高的富集或尽可能多的被提取出来，同时提取分离得到的含氮化合物具有较好的抗菌活 性，可进一步为抗菌新药的研发提供先导化合物，为进一步提升黑蚁的药用价值提供了新 的科学依据。
[0013] 本发明提供的方法从黑蚁中提取含氮化合物，经药理实验证明，具有良好的抗金 黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、绿脈杆菌的广谱抗菌活性。本发明的方法是天然微量 化合物的追踪提取，本发明采用70%的甲醇溶液浸溃提取，能够使含氮的化合物高度富集后 尽可能多的提取出来，并使单体化合物充分富集后微量的含氮化合物容易获得。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明6个含氮化合物的抗菌活性实验结果图。
【具体实施方式】
[0015] 黑蚁中含氮化合物的提取方法，包括W下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料，清洗干净后放入45-50°C烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑 蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量5-10倍的二氯甲烧溶剂室溫冷浸，48-50h 后过滤，将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量5-10倍的二氯甲烧重复提取，过滤，分别 收集滤液和滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤Ξ、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为60-80 %的甲 醇溶液室溫冷浸提取48-5化后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为60- 80 %甲醇溶液室溫冷浸提取，重复上述操作若干次，合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁 60-80 %甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于-10-20°C冰箱中冷冻至结冰状，取出再放置于冷冻 干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑蚁的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤Ξ得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，用硅胶拌样后，利用湿法上 柱，进行柱色谱分离;取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样，用7-10倍柱体积的乙酸乙醋洗 脱，收集乙酸乙醋馈分，合并浓缩后得到乙酸乙醋提取浸膏，备用；接着用7-10倍柱体积的 乙酸乙醋-甲醇混合液进行梯度洗脱，乙酸乙醋-甲醇洗脱液的梯度比例依次为10:1、8:2、 6:4、4:6、2:8、1:10和0:10,梯度洗脱后，收集得到的乙酸乙醋-甲醇溶液馈分，合并浓缩后 得到乙酸乙醋-甲醇混合浸膏，备用； 取上述黑蚁的乙酸乙醋提取浸膏用乙酸乙醋溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油酸-乙酸乙醋溶液 进行梯度洗脱，石油酸-乙酸乙醋洗脱液的梯度比例依次为1〇:1、8:2、6:4、4:6、2:8、1:10和 0:10，分别收集馈分，TLC检测合并相同馈分，得到不同馈分段共8个组分； 取梯度比例为2:8的石油酸-乙酸乙醋馈分段，进一步通过Se地adex LH-20凝胶色谱进 行纯化制备，流动相采用摩尔比例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为3-4滴/min,收 集合并馈分，经过化C分析，分别得到化合物3和化合物4; 取乙酸乙醋-甲醇混合浸膏，用甲醇溶剂充分溶解并拌样干燥，进行柱色谱分离，取 200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后用氯仿-甲醇溶液梯度洗脱，氯仿-甲醇洗脱液的 梯度比例为9:1、7:1、7:3、5:4、4:5、3:7、1:7和1:9，分别收集馈分，化(：检测合并相同馈分， 得到不同馈分段共11个组分； 梯度比例为9:1的氯仿-甲醇馈分经分离纯化后在室溫下静置有淡黄色粉末析出，即化 合物6; 梯度比例为7:1的氯仿-甲醇馈分用液相色谱分离纯化，色谱条件为:流速:8mL/min;流 动相:C册OH:肥0=65%: 35%等度分离，得到化合物1和化合物2; 梯度比例为5:1的氯仿-甲醇馈分用薄层色谱分离纯化，溶剂洗脱剂为摩尔比为7:3的 氯仿-丙酬混合溶液得到淡黄色油脂状化合物，即化合物5。
[0016] 化合物1-6的结构式如下：
[0017] 上述化合物分别被命名为： 化合物 1:黑蚁多己胺素 A-2 (Polyrhachzside dopamine A-2)。
[001引化合物2:黑蚁素 B(PolyrhachzsideB)。化学名称为2,2'-醋代，5,5'-氧代双化 咯。
[0019] 化合物3:3-苯基，5-氨化1，2,4-^氮杂苯。
[0020] 化合物4:N-甲基，3-苯基，5-氨化1，2,4-Ξ氮杂苯。
[0021] 化合物5:1-甲基-4-Ν-甲基降冰片烧。
[0022] 化合物6:Allantoin。化学名称为Ν-(2,5-二氧代-4-咪挫嘟晚基)尿素，俗名尿囊 素。
[0023] 经文献调研和Seifind数据库检索，化合物1、2、3、4和5均为新化合物。化合物1、 2、3、4、5和6都是首次从黑蚁中分离得到。
[0024] 所述的黑蚁中含氮化合物的提取方法中得到的化合物1和化合物2在抗菌方面的 应用。进一步的，化合物1和化合物2在抗金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌、大 肠杆菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性中的 应用。
[002引抗菌活性试验： 上述6个含氮化合物的抗菌活性实验详见图1(抗菌筛选采用抑菌圈的大小表示)其中 具有抗菌活性化合物1和化合物2的详细抗菌结果见表1和表2(抗菌筛选结果采用抑菌圈 的大小(魯.* ,m ?沉)及最小抑菌浓度MIC值的大小表示(MIC，y g/mL )的如表1所示： 表1.化合物1最小抑菌浓度(MIC)值的测定
T曰b.l The Minimum Inhibitory Concentration of compound 1. 从表1的最小抑菌浓度MIC值测定结果可知，化合物1抗革兰氏阳性菌的MIC值为31化g/ ιΛ;抗革兰氏阴性菌的MIC值15化g/mL，该测试结果表明化合物1为一个具有广谱抗菌活性 的含氮化合物。
[00%]表2.化合物2最小抑菌浓度(MIC)值的测定
Τ曰b.2 The Minimum Inhibitory Concentration of compound 2 从表2的最小抑菌浓度MIC值测定结果可知，化合物2抗枯草杆菌的MIC为31化g/mL、抗 金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度MIC为31化g/mL、抗大肠杆菌的最小抑菌浓度MIC为31化g/ mL、抗绿脈杆菌的最小抑菌浓度MIC为31化g/mL。
[0027] 化合物3、化合物4、化合物5、化合物6均没有检测到抗菌活性。
[0028] 为使本发明的内容更明显易懂，W下结合具体实施例，对本发明进行详细描述。
[0029] 实施例1: 黑蚁中含氮化合物的提取方法，包括W下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料1.5始，清洗表面泥溃及除去存放处理用无机盐，清洗干净后放 入45°C烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量5倍的二氯甲烧溶剂室溫冷浸，48h后过滤， 将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量5倍的二氯甲烧重复提取，过滤，分别收集滤液和 滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤Ξ、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为60 %的甲醇 溶液室溫冷浸提取4她后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为60 %甲醇 溶液室溫冷浸提取，重复上述操作若干次，直至得到的滤液中全部为质量百分比为60%的甲 醇溶液，合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁60%甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于-10°C冰 箱中冷冻至结冰状，取出再放置于冷冻干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑蚁的 60%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置于-80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤Ξ得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，用硅胶拌样后，利用湿法上 柱，进行柱色谱分离;取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样，用7倍柱体积的乙酸乙醋洗脱， 收集乙酸乙醋馈分，合并浓缩后得到乙酸乙醋提取浸膏，备用；接着用7倍柱体积的乙酸乙 醋-甲醇混合液进行梯度洗脱，乙酸乙醋-甲醇洗脱液的梯度比例依次为10:1、8:2、6:4、4: 6、2:8、1:10和0:10,梯度洗脱后，收集得到的乙酸乙醋-甲醇溶液馈分，合并浓缩后得到乙 酸乙醋-甲醇混合浸膏，备用； 取上述黑蚁的乙酸乙醋提取浸膏用乙酸乙醋溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油酸-乙酸乙醋溶液 进行梯度洗脱，石油酸-乙酸乙醋洗脱液的梯度比例依次为1〇:1、8:2、6:4、4:6、2:8、1:10和 0:10，分别收集馈分，TLC检测合并相同馈分，得到不同馈分段共8个组分； 取梯度比例为2:8的石油酸-乙酸乙醋馈分段，进一步通过Se地adex LH-20凝胶色谱进 行纯化制备，流动相采用摩尔比例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为3-4滴/min,收 集合并馈分，经过化C分析，分别得到化合物3和化合物4; 取乙酸乙醋-甲醇混合浸膏，用甲醇溶剂充分溶解并拌样干燥，进行柱色谱分离，取 200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后用氯仿-甲醇溶液梯度洗脱，氯仿-甲醇洗脱液的 梯度比例为9:1、7:1、7:3、5:4、4:5、3:7、1:7和1:9，分别收集馈分，化(：检测合并相同馈分， 得到不同馈分段共11个组分； 梯度比例为9:1的氯仿-甲醇馈分经分离纯化后在室溫下静置有淡黄色粉末析出，即化 合物6; 梯度比例为7:1的氯仿-甲醇馈分用液相色谱分离纯化，色谱条件为:流速:8mL/min;流 动相:C册OH:肥0=65%: 35%等度分离，得到化合物1和化合物2; 梯度比例为5:1的氯仿-甲醇馈分用薄层色谱分离纯化，溶剂洗脱剂为摩尔比为7:3的 氯仿-丙酬混合溶液得到淡黄色油脂状化合物，即化合物5。
[0030] 上述分离纯化得到的6个化合物，经过波谱分析和化学分析手段W及元素分析等， 确定他们都是小分子含氮的生物碱化合物，并且都是首次被从节肢动物昆虫的黑蚁中分离 得到。
[0031] 实施例2: 黑蚁中含氮化合物的提取方法，包括W下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料2.5kg，清洗表面泥溃及除去存放处理用无机盐，清洗干净后放 入48°C烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量7倍的二氯甲烧溶剂室溫冷浸，4化后过滤， 将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量7倍的二氯甲烧重复提取，过滤，分别收集滤液和 滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤Ξ、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为70 %的甲醇 溶液室溫冷浸提取49h后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为70 %甲醇 溶液室溫冷浸提取，重复上述操作若干次，直至得到的滤液中全部为质量百分比为70 %的 甲醇溶液，合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁70 %甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于-15 °C冰箱中冷冻至结冰状，取出再放置于冷冻干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑 蚁的70%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置于-80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤Ξ得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，用硅胶拌样后，利用湿法上 柱，进行柱色谱分离;取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样，用9倍柱体积的乙酸乙醋洗脱， 收集乙酸乙醋馈分，合并浓缩后得到乙酸乙醋提取浸膏，备用；接着用9倍柱体积的乙酸乙 醋-甲醇混合液进行梯度洗脱，乙酸乙醋-甲醇洗脱液的梯度比例依次为10:1、8:2、6:4、4: 6、2:8、1:10和0:10,梯度洗脱后，收集得到的乙酸乙醋-甲醇溶液馈分，合并浓缩后得到乙 酸乙醋-甲醇混合浸膏，备用； 取上述黑蚁的乙酸乙醋提取浸膏用乙酸乙醋溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油酸-乙酸乙醋溶液 进行梯度洗脱，石油酸-乙酸乙醋洗脱液的梯度比例依次为1〇:1、8:2、6:4、4:6、2:8、1:10和 0:10，分别收集馈分，TLC检测合并相同馈分，得到不同馈分段共8个组分； 取梯度比例为2:8的石油酸-乙酸乙醋馈分段，进一步通过Se地adex LH-20凝胶色谱进 行纯化制备，流动相采用摩尔比例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为3-4滴/min,收 集合并馈分，经过化C分析，分别得到化合物3和化合物4; 取乙酸乙醋-甲醇混合浸膏，用甲醇溶剂充分溶解并拌样干燥，进行柱色谱分离，取 200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后用氯仿-甲醇溶液梯度洗脱，氯仿-甲醇洗脱液的 梯度比例为9:1、7:1、7:3、5:4、4:5、3:7、1:7和1:9，分别收集馈分，化(：检测合并相同馈分， 得到不同馈分段共11个组分； 梯度比例为9:1的氯仿-甲醇馈分经分离纯化后在室溫下静置有淡黄色粉末析出，即化 合物6; 梯度比例为7:1的氯仿-甲醇馈分用液相色谱分离纯化，色谱条件为:流速:8mL/min;流 动相:C册OH:肥0=65%: 35%等度分离，得到化合物1和化合物2; 梯度比例为5:1的氯仿-甲醇馈分用薄层色谱分离纯化，溶剂洗脱剂为摩尔比为7:3的 氯仿-丙酬混合溶液得到淡黄色油脂状化合物，即化合物5。
[0032] 上述分离纯化得到的6个化合物，经过波谱分析和化学分析手段W及元素分析等， 确定他们的化学结构同实施例1。
[0033] 实施例3: 黑蚁中含氮化合物的提取方法，包括W下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料3.0kg，清洗表面泥溃及除去存放处理用无机盐，清洗干净后放 入50°C烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量10倍的二氯甲烧溶剂室溫冷浸，5化后过 滤，将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量10倍的二氯甲烧重复提取，过滤，分别收集滤 液和滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤Ξ、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为80 %的甲醇 溶液室溫冷浸提取50h后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为80 %甲醇 溶液室溫冷浸提取，重复上述操作若干次，直至得到的滤液中全部为质量百分比为80 %的 甲醇溶液，合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁80 %甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于-20 °C冰箱中冷冻至结冰状，取出再放置于冷冻干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑 蚁的80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置于-80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤Ξ得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，用硅胶拌样后，利用湿法上 柱，进行柱色谱分离；取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样，用10倍柱体积的乙酸乙醋洗 脱，收集乙酸乙醋馈分，合并浓缩后得到乙酸乙醋提取浸膏，备用；接着用10倍柱体积的乙 酸乙醋-甲醇混合液进行梯度洗脱，乙酸乙醋-甲醇洗脱液的梯度比例依次为10:1、8:2、6: 4、4:6、2:8、1:10和0:10,梯度洗脱后，收集得到的乙酸乙醋-甲醇溶液馈分，合并浓缩后得 到乙酸乙醋-甲醇混合浸膏，备用； 取上述黑蚁的乙酸乙醋提取浸膏用乙酸乙醋溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油酸-乙酸乙醋溶液 进行梯度洗脱，石油酸-乙酸乙醋洗脱液的梯度比例依次为1〇:1、8:2、6:4、4:6、2:8、1:10和 0:10，分别收集馈分，TLC检测合并相同馈分，得到不同馈分段共8个组分； 取梯度比例为2:8的石油酸-乙酸乙醋馈分段，进一步通过Se地adex LH-20凝胶色谱进 行纯化制备，流动相采用摩尔比例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为3-4滴/min,收 集合并馈分，经过化C分析，分别得到化合物3和化合物4; 取乙酸乙醋-甲醇混合浸膏，用甲醇溶剂充分溶解并拌样干燥，进行柱色谱分离，取 200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后用氯仿-甲醇溶液梯度洗脱，氯仿-甲醇洗脱液的 梯度比例为9:1、7:1、7:3、5:4、4:5、3:7、1:7和1:9，分别收集馈分，化(：检测合并相同馈分， 得到不同馈分段共11个组分； 梯度比例为9:1的氯仿-甲醇馈分经分离纯化后在室溫下静置有淡黄色粉末析出，即化 合物6; 梯度比例为7:1的氯仿-甲醇馈分用液相色谱分离纯化，色谱条件为:流速:8mL/min;流 动相:C册0H:肥0=65%: 35%等度分离，得到化合物1和化合物2; 梯度比例为5:1的氯仿-甲醇馈分用薄层色谱分离纯化，溶剂洗脱剂为摩尔比为7:3的 氯仿-丙酬混合溶液得到淡黄色油脂状化合物，即化合物5。
[0034]上述分离纯化得到的6个化合物，经过波谱分析和化学分析手段W及元素分析等， 确定他们的化学结构同实施例1。
【主权项】
1. 黑蚁中含氮化合物的提取方法，其特征在于：黑蚁原材料先经二氯甲烧溶剂室溫冷 浸提取后得到黑蚁滤渣，再将黑蚁滤渣采用质量百分比为60-80 %甲醇溶液室溫冷浸提取， 提取后的甲醇浓缩液经冷冻干燥处理得甲醇浸膏，然后甲醇浸膏先后经过乙酸乙醋溶液、 乙酸乙醋-甲醇混合溶液洗脱后，得到的馈分经进一步分离纯化最终提取出6个含氮化合 物。2. 如权利要求1所述的黑蚁中含氮化合物的提取方法，其特征在于:包括W下步骤： 步骤一、取黑蚁原材料，清洗干净后放入45-50°C烘箱中鼓风干燥至恒重，粉碎，得到黑 蚁粉末，备用； 步骤二、将步骤一得到的黑蚁粉末用其重量5-10倍的二氯甲烧溶剂室溫冷浸，48-50h 后过滤，将黑蚁残渣滤出后再次加入黑蚁残渣重量5-10倍的二氯甲烧重复提取，过滤，分别 收集滤液和滤渣，滤渣经过干燥，得到黑蚁滤渣粉，备用； 步骤Ξ、将步骤二得到的黑蚁滤渣粉放置通风处风干，加入质量百分比为60-80 %的甲 醇溶液室溫冷浸提取48-5化后过滤，收集滤液，滤出的黑蚁渣粉再次加入质量百分比为60- 80 %甲醇溶液室溫冷浸提取，重复上述操作若干次，合并滤液，减压下除去溶剂后得到黑蚁 60-80 %甲醇浓缩液;然后将浓缩液置于-10-20°C冰箱中冷冻至结冰状，取出再放置于冷冻 干燥仪中，调至-40°C下冷冻干燥处理，得到黑蚁的60-80%甲醇浸膏，甲醇浸膏密封后放置 于-80°C冰箱中，备用； 步骤四、将步骤Ξ得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，采用柱色谱法进行分离，先 用乙酸乙醋洗脱后，再用乙酸乙醋、甲醇的混合液进行梯度洗脱，洗脱得到的馈分经进一步 分离纯化得到化合物1-6，结构式如下：3. 如权利要求2所述的一种黑蚁中含氮化合物的提取方法，其特征在于:步骤四所述的 分离提纯的具体步骤为:将步骤Ξ得到的甲醇浸膏用甲醇溶剂充分溶解后，用硅胶拌样后， 利用湿法上柱，进行柱色谱分离;取100-200目硅胶装入色谱柱中，上样，用7-10倍柱体积的 乙酸乙醋洗脱，收集乙酸乙醋馈分，合并浓缩后得到乙酸乙醋提取浸膏，备用；接着用7-10 倍柱体积的乙酸乙醋-甲醇混合液进行梯度洗脱，乙酸乙醋-甲醇洗脱液的梯度比例依次为 1 ο: 1、8: 2、6:4、4:6、2:8、1:1 ο和ο: 1 ο，梯度洗脱后，收集得到的乙酸乙醋-甲醇溶液馈分， 合并浓缩后得到乙酸乙醋-甲醇混合浸膏，备用； 取上述黑蚁的乙酸乙醋提取浸膏用乙酸乙醋溶剂充分溶解，加入硅胶充分拌样干燥， 进行柱色谱分离，取200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后分别用石油酸-乙酸乙醋溶液 进行梯度洗脱，石油酸-乙酸乙醋洗脱液的梯度比例依次为1〇:1、8:2、6:4、4:6、2:8、1:10和 0:10，分别收集馈分，TLC检测合并相同馈分，得到不同馈分段共8个组分； 取梯度比例为2:8的石油酸-乙酸乙醋馈分段，进一步通过S邱hadex LH-20凝胶色谱进 行纯化制备，收集合并馈分，经过化C分析，分别得到化合物3和化合物4; 取乙酸乙醋-甲醇混合浸膏，用甲醇溶剂充分溶解并拌样干燥，进行柱色谱分离，取 200-300目硅胶装入色谱柱中，上样，然后用氯仿-甲醇溶液梯度洗脱，氯仿-甲醇洗脱液的 梯度比例为9:1、7:1、7:3、5:4、4:5、3:7、1:7和1:9，分别收集馈分，化(：检测合并相同馈分， 得到不同馈分段共11个组分； 梯度比例为9:1的氯仿-甲醇馈分经分离纯化后在室溫下静置有淡黄色粉末析出，即化 合物6; 梯度比例为7:1的氯仿-甲醇馈分用液相色谱分离纯化，得到化合物1和化合物2; 梯度比例为5:1的氯仿-甲醇馈分用薄层色谱分离纯化，得到淡黄色油脂状化合物，即 化合物5。4. 如权利要求3所述的一种黑蚁中含氮化合物的提取方法，其特征在于:梯度比例为2: 8的石油酸-乙酸乙醋馈分采用S邱hadex LH-20凝胶色谱进行纯化过程中，流动相采用摩尔 比例为1:1的氯仿-甲醇溶液等度洗脱，流速为3-4滴/min。5. 如权利要求3所述的一种黑蚁中含氮化合物的提取方法，其特征在于:梯度比例为7: 1的氯仿-甲醇馈分用液相色谱分离纯化的色谱条件为:流速:8mL/min;流动化C册OH:肥0= 65% :35%等度分离。6. 如权利要求3所述的一种黑蚁中含氮化合物的提取方法，其特征在于:梯度比例为5: 1的氯仿-甲醇馈分用薄层色谱分离纯化，溶剂洗脱剂为摩尔比为7:3的氯仿-丙酬混合溶 液。7. 如权利要求2或3所述的黑蚁中含氮化合物的提取方法中得到的化合物1和化合物2 在抗菌方面的应用。8. 如权利要求7所述的黑蚁中含氮化合物的提取方法中得到的化合物1和化合物2在抗 金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌、鲍 曼不动杆菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性中的应用。
【文档编号】C07C233/18GK106083641SQ201610347055
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年5月24日
【发明人】尹卫平, 李海迪, 高嘉屿, 刘军娜, 刘华清
【申请人】河南科技大学