一种检测牛hcd携带者的特异性pcr引物、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明涉及检测引物与试剂盒，具体公开了检测牛HCD携带者的特异性PCR引物及试剂盒。所述引物包括如SEQ ID NO.1～3所示的核苷酸序列，以待测样本总DNA为模板，利用所述引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR扩增产物中仅出现171bp的电泳条带时，表示待测样本不携带HCD；当PCR扩增产物中同时出现171bp和366bp电泳条带时，表示待测样本携带HCD的杂合子；当PCR扩增产物中仅出现366bp电泳条带时，表示待测样本为HCD纯合子。
【专利说明】
-种检测牛HCD携带者的特异性PCR引物、试剂盒及检测方法
技术领域
[0001]本发明涉及检测引物与试剂盒，具体地说，涉及检测牛HCD携带者的特异性PCR引 物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 在奶牛育种中，由于后裔测定、基因组选择等现代育种技术的应用，在极大地提高 了选择准确性的同时，也潜在地提高了选择强度。由于人工授精(AI)等繁殖生物技术的应 用，使个别优秀种公牛得到广泛使用，增加了群体的近交系数，降低了有效群体含量，隐性 基因纯合的概率加大，使不良基因在奶牛群体中不断出现，随着基因组学研究的不断深入 和高通量测序技术的迅猛发展，加快了奶牛隐性遗传缺陷的挖据、鉴定与应用。
[0003] 单倍型，在遗传学上是指在同一染色体上进行共同遗传的多个基因座上等位基因 的组合。有害单倍型是新近几年在牛群中出现的隐性遗传缺陷的新形式，在荷斯坦牛群中 已经发现20多种单倍型，成功进行区间定位的单倍型有15种。当这些单倍型隐性纯合时，就 会表现出不同类型的临床症状、胚胎早期死亡等，是影响奶牛群繁殖健康的隐性杀手，严重 影响着奶牛养殖者的经济效益。
[0004] 胆固醇缺乏单倍型（HCD，Hap 1 〇 t yp e as so c i at ed w i th Cho 1 e s t er ο 1 Deficiency)是在荷斯坦牛群中新发现的一种隐性遗传缺陷。其遗传方式是当一头犊牛从 其父母处都遗传了 HCD基因时，称为感染者(纯合子）。感染牛的血液中胆固醇含量极低，可 阻止奶牛正常的体脂沉积，其临床表现为慢性腹泻、生长缓慢、体重降低，通常6月龄的犊牛 易早期死亡。目前已知该遗传缺陷基因最早的来源是加拿大种公牛Maughlin Storm (H0CANM5457798)。
[0005] HCD的分子遗传基础是在牛11号染色体(BTA11)上APOB(Apolipoprotein B)基因 编码区有1299bp转录调控元件ERV2-1的插入突变，导致ΑΡ0Β基因转录终止、剪接异常，使原 4567个氨基酸肽链被135个氨基酸残肽所取代，丢失了97 %的蛋白质(Menzi等，2016)。
[0006] 2015年加拿大使用的荷斯坦种公牛约10%是已知或可能的HCD携带者。在LPI前 100名的验证公牛中，有5头是HCD携带者；在基因组测定前100名的青年公牛中，有2头是携 带者;Kipp等(2015)预测，德国每年大约有3400个HCD纯合子出生，携带率约8.7%。
[0007] 牛冷冻精液和人工授精技术的普及和广泛应用，导致优秀种公牛的影响和使用范 围是世界性的。一头优秀种公牛一生可以生产几十万剂甚至上百万剂冷冻精液，其遗传影 响可想而知。由于优秀种公牛冷冻精液在全世界范围内的流通和广泛使用，荷斯坦牛群中 发现的有害单倍型带来的都是世界性的问题。这导致近年来奶牛育种工作者在重视优秀种 公牛生产性能表现的同时，更加重视优秀种公牛是否携带一些不良隐性基因的影响。因此， 建立一种有效的检测胆固醇缺乏单倍型的分子生物学方法，制定合理选种选配方案，是降 低HCD纯合子的最好方法。
[0008] 目前，我国尚未开展相关的研究和检测工作，HCD单倍型在我国荷斯坦牛群中的携 带情况尚不清楚。
【发明内容】
[0009] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测牛HCD携带者的 特异性PCR引物、试剂盒及检测方法。
[0010] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0011] 第一方面，本发明经严格筛选后提供一种检测牛HCD携带者的特异性PCR引物，其 特征在于，所述引物包括：
[0012] 上游引物F: 5' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3' ；
[0013] 下游引物R1:5' -AGATGATGCCCCTCTTGATG-3' ；
[0014] 下游引物R2:5 ' -CACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '。
[0015] 进一步地，本发明提供了前述引物在制备检测牛HCD携带者的试剂盒方面的应用， 并提供了含有前述引物的试剂或试剂盒。
[0016] 所述试剂盒包括:本发明所述特异性PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、10 X Buffer、 ddH20〇
[0017] 所述试剂盒的工作程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，58±8°C退火30s，72°C 延伸30s，35个循环；72°C延伸7min。
[0018] 经过对PCR反应程序试剂盒的优化发现，当退火温度为62°C时，PCR扩增特异性最 好，条带单一，且最亮。能够有效保证扩增的有效性和准确性。
[0019] 第二方面，本发明还提供了一种非疾病的诊断和治疗目的的检测牛HCD携带者的 方法，该方法可用于牛HCD单倍型的筛选和鉴定工作。所述方法具体为：以待测样本总DNA为 模板，利用本发明所述引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR扩增产物中仅出 现17lbp的电泳条带时，表示待测样本不携带HCD;当PCR扩增产物中出现366bp电泳条带时， 表示待测样本携带HCD。且进一步地，当PCR扩增产物中同时出现171bp和366bp电泳条带时， 表示待测样本为携带HCD的杂合子;当PCR扩增产物中仅出现366bp电泳条带时，表示待测样 本为HCD纯合子。
[0020] 进一步地，本发明PCR反应体系总体积25yL:
[0023] 更进一步地，PCR工作程序为：94°C预变性5min; 94°C变性30s，58 ± 8 °C退火30s，72。(:延伸30s，35个循环;72°C延伸7min。优选退火温度为62°C。
[0021]
[0022]
[0024]本发明的有益效果在于：
[0025]本发明提供了检测牛HCD携带者的特异性PCR引物及试剂盒，并提供了利用所述特 异性PCR引物进行多重PCR法检测牛胆固醇缺乏单倍型的方法，具体为利用SEQ ID NO. 1~3 所示的核苷酸序列为引物，对牛的总DNA进行PCR扩增，得到SEQ ID NO.4和或SEQ ID NO. 5 所示的DNA序列，通过琼脂糖电泳检测，得到如附图1所示的基因型，从而可以直接判定HCD 携带者的基因型。
[0026] 本发明还优化了上述PCR的反应程序，开发了一套检测HCD单倍型的的PCR检测方 法，为荷斯坦牛的选种、选配提供了技术支撑。
[0027] 本发明建立了一种快速、准确、高效的胆固醇缺乏单倍型(H⑶)分子检测方法，为 奶牛Η⑶单倍型因的分子筛查提供一种技术手段，为在今后的育种工作中有计划地降低HCD 单倍型频率提供了技术支撑，为奶牛场进行科学的选种选配提供了依据。
【附图说明】
[0028]图1为检测牛胆固醇缺乏单倍型(HCD)携带者的PCR电泳图；其中，泳道1、3、4:不携 带HCD单倍型;泳道2:HCD单倍型携带者;泳道5:阳性对照;M:100bp DNA ladder Marker。
[0029] 图2为正常个体和HCD携带者的测序峰图。
【具体实施方式】
[0030] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实 施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技 术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
[0031 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0032]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0033]实施例1引物设计
[0034] 依据 GenBank 上牛 ΑΡ0Β 基因序列（ID:494004)，并参考 Schiitz 等（2016)针对 ΑΡ0Β 基 因设计的检测HCD单倍型的引物序列，利用在线引物设计软件(http://bioinfo.ut.ee/ primer3-0.4.0/)进行检测HCD的特异性引物设计，获得引物对:上游引物AP0B-Pr imer-F: 5 ' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3 ' ；下游引物AP0B-Primer-Rl: 5 ' -AGATGATGCCCCTCTTGATG-3 '， 该引物对横跨ΑΡ0Β基因1299bp的插入序列，从理论上讲，正常个体可以扩增处171bp的长度 片段;Η⑶携带者个体能扩增出171/1470bp长度的片段，Η⑶纯合子能扩增出1470bp的长度 片段。经过第一轮引物的筛选和优化，当对HCD携带者进行扩增时，该引物对仅能扩增出 171bp的片段，1470bp的长度片段不能正常的扩增出来，可能是由于171bp的短片段扩增会 抑制长片段的扩增，而且，长片段本身就容易扩增。又重新设计了两对特异性PCR引物，通过 PCR条件的筛选和优化，仍然不能扩增出长片段的扩增片段。目前，还没有资料显示，1299bp 片段的插入突变能够直接用PCR扩增出来。所以，采用简单PCR引物进行直接扩增的方案是 不可行的。
[0035] 鉴于以上的经验，本发明通过巧妙构思，设计多条引物，采用复合式PCR来检测部 分插入序列的方法来对HCD携带者进行鉴定。于是，本发明补充设计了第三条引物ΑΡ0Β-Primer-R2：
[0036] 5 ' -ACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '，该引物序列是1299bp插入序列的一部分，是用来检 测HCD单倍型的特异性引物。该方法具有快速、准确的特定。
[0037]所设计的引物一览表：
[0038]
[0039] 经试验，最后确定了如下检测HCD携带者的特异性PCR引物APOB-Primers:
[0040]上游引物APOB-Primer-F: 5 ' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3 ' ；
[0041 ]下游引物APOB-Primer-Rl: 5 ' -AGATGATGCCCCTCTTGATG-3 ' ；
[0042]下游引物AP0B-Primer-R2:5 ' -ACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '。
[0043] F/R1引物对扩增片段长度：171bp;
[0044] F/R2引物对扩增片段长度:366bp。
[0045] 上述引物相对其他设计得到的大量引物来说，具有专一性高、特异性强、目的条带 容易识别等特点，能够更好的实现HCD基因的快速、准确检测。
[0046] 实施例2 PCR反应程序的优化
[0047] 本发明基于设计得到的特异性PCR引物，进一步对PCR的反应程序进行了优化。
[0048] 最终确定了鉴定HCD携带者的PCR反应程序与反应体系。
[0049] 所述反应程序为：
[0050] 94°C 预变性 5min;94°C 变性 3〇8,62°(：退火3〇8,72°(：延伸3〇8，进行35个循环；721€ 延伸7min，然后4°C保存。其中，最佳退火温度为62 °C
[0051 ] 所述PCR反应体系：总体积25yL
[0052]
[0053] 实施例3
[0054] 1、牛总DNA的提取
[0055] 选择北京市种公牛站的荷斯坦公牛为实验材料，提取总DNA，总DNA可以从血液(例 如，新鲜或冷冻的）、精液(例如，新鲜或冷冻的）、组织样品（如耳组织等)或含有毛囊的牛毛 样品中提取、分离和纯化。
[0056] 2、PCR扩增和基因型判定
[0057] 根据实施例1筛选得到的特异性引物对，和实施例2优化得到的PCR反应条件及反 应体系进行多重PCR扩增。
[0058]取4yL PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR扩增结果如附图1所示。
[0059] 基因型判定：
[0060]健康奶牛:基因型为AA型，仅出现171bp电泳条带；
[0061 ] HCD隐性携带者:基因型为AB型，即出现171 bp电泳条带和366bp电泳条带；
[0062] Η⑶纯合子:基因型为BB型，仅出现366bp电泳条带。Η⑶单倍型在胚胎早期多数致 死或出生后死亡，在牛群中很少出现，我们筛查隐性有害单倍型HCD的目的就是要找出HCD 隐性携带者。
[0063] 利用上述建立的分子检测方法，对北京地区的138头荷斯坦公牛和90头母牛进行 了检测分析，结果分别检测到了7头和1头HCD携带者，携带率分别为5.07%、1.11%。
[0064] 3、测序验证
[0065]对全部HCD携带者个体进行测序验证。
[0066] 为了进一步验证基因分型结果，将具有不同基因型的个体进行测序，用DNAMAN软 件与GenBank上的基因序列进行同源性比对发现，ΑΑ基因型的ΑΡ0Β基因扩增序列与GenBank 上的基因序列（ID:494004)相同，该基因型属正常牛只，在国际上统一采用"Η⑶0"标识；而 ΑΒ基因型的ΑΡ0Β基因的第24位碱基和25位碱基之间插入了 LTR(末端重复序列)转录调控元 件序列(http://www.ncbi .nlm.nih.gov/dbvar)(登录号:NSTD119)，该基因型的牛只是ΗΟ) 携带者，在国际上统一采用"HCD1"标识。测序结果见附图2。研究结果表明附图1中的基因分 型结果是正确的，而且准确率达100%，说明建立的检测HCD有害单倍型的方法是可靠的。 [0067] 4、系谱验证
[0068] 通过系谱追踪发现，7头HCD携带者公牛的共同祖先是Maugh 1 in Storm (H0CA匪5457798,1991)，与国际上报道的可追溯到的共同祖先相一致，更加证实了所建立 方法的准确性和可靠性。本发明对我国荷斯坦牛进行了 HCD单倍型的分子诊断，并证实HCD 单倍型在我国荷斯坦牛群中存在一定比例，有必要对我国荷斯坦牛群进行大规模的筛查， 标识或淘汰HCD单倍型携带者，降低HCD带来的潜在危害。
[0069]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种检测牛HCD携带者的特异性PCR引物，其特征在于，所述引物包括： 上游引物F: 5 ' -TGCAAAGCCACCTAGCCTAT-3 ' ； 下游引物R1:5 '-AGATGATGCCCCTCTTGATG-3 ' ； 下游引物R2:5 ' -CACTCCTAATTGCCCAGGAA-3 '。2. 权利要求1所述的引物在制备检测牛HCD携带者的试剂盒方面的应用。3. 含有权利要求1所述的引物的试剂或试剂盒。4. 一种检测牛HCD携带者的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括:权利要求1所述的特 异性PCR引物、Taq DNA聚合酶、dNTP、10 X Buffer、ddH20及阳性对照。5. 根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应程序为:94°C预变性 5min;94°C 变性 30s，62°C 退火 30s，72°C 延伸 3〇8,35个循环；72°(：延伸711^11。6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，退火温度为62 °C。7. -种非疾病的诊断和治疗目的的检测牛HCD携带者的方法，其特征在于，以待测样本 总DNA为模板，利用权利要求1所述引物进行PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳检测，当PCR扩增 产物中仅出现17lbp的电泳条带时，表示待测样本不携带HCD;当PCR扩增产物中同时出现 171bp和366bp电泳条带时，表示待测样本为携带HCD的杂合子；当PCR扩增产物中仅出现 366bp泳条带时，表示待测样本为HCD纯合子。8. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR反应体系总体积25yL: dNTP 混合物，（4><2.5mmol/L) 2.0tuL; lOxBuffer (含 Mg2+ ) 2.5μΙ.; 上游引物 F (: 20pmol/L ) 0.5μΙ; 下游引物 R ]. ( 20pmoL/L ) 0.5μL; 下游引物 R1 ( 20pmoL/L ) 0.5μL； Taq DNA 聚合酶（3U/pL) 0.5μΙ; 模板 DNA ( 50ng/:uL ) 0.5μΙ; ddH20 18.0μLο9. 根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，PCR工作程序为:94°C预变性5min; 94°C 变性 30s，58 ±8 °C 退火 30s，72 °C 延伸 30s，35 个循环；72 °C 延伸 7min。10. 根据权利要求9所述的方法，其特征在于，退火温度为62 °C。
【文档编号】C12Q1/68GK106065416SQ201610659243
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年8月11日
【发明人】李艳华, 麻柱, 刘林, 赵凤, 吕小青, 韩广文, 朱玉林, 孙东晓
【申请人】北京奶牛中心