构建的鲤凋亡基因、载体及其应用
【专利摘要】本发明涉及一种鲤凋亡基因、载体及其应用。所构建的鲤凋亡基因，从5’至3’依次由鲤MT?1启动子、鲤Caspase?8小亚基(P10)编码序列、鲤Caspase?8大亚基(P20)编码序列、鲤MT?1polyA信号序列组成。本发明的所述鲤DNA疫苗载体，包括真核表达载体及插入在所述真核表达载体中的上述鲤基因的凋亡基因。本发明以鲤的MT启动子和Caspase?8为基础，构建诱导型凋亡基因，将其插入pEGFP?N1载体构建“自杀性”DNA疫苗载体，该凋亡基因可以响应金属离子(例如Zn2+)等条件的诱导，表达Caspase?8诱导转染细胞的凋亡，可应用于鲤DNA疫苗的制备，以进一步提高DNA疫苗的安全性。
【专利说明】
构建的绳调亡基因、载体及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体是设及构建的經调亡基因、载体及其应用。
【背景技术】
[0002] DNA疫苗自问世W来，就W其制备、运输、存胆简单并且能同时诱导体液免疫与细 胞免疫等优点成为新型疫苗研究的重要方向。但是DNA疫苗接种后持续表达，可能诱导宿主 自身免疫反应和免疫耐受，并且增加了疫苗DNA整合到宿主基因组的风险。尽管W甲病毒复 审巧为基础的"自杀伴'DNA疫苗极大缩短了疫苗DNA在机体内的存在时间，但是此类疫苗载 体也存在一些缺点：（1)甲病毒复制子片段过大(〉化b)，加上质粒复制及筛选、报告基因等 必要元件，疫苗载体超过1化b，影响了载体容量，并且由于插入外源基因后的DNA疫苗过大， 也增加了疫苗的构建难度，并且影响了转染效率。（2)调亡进程无法控制，在接种"自杀性" DNA疫苗后2~5天后，疫苗即被清除，如果能延迟调亡进程，则有可能获得更好的免疫效果。
[0003] "自杀性"IHNV DNA疫苗的研究为新型疫苗载体构建提供了有益的启示。IHNV是一 种严重危害虹縛(Oncorhynchus mykiss)等鱼类的病毒，该病毒编码6个蛋白，其中囊膜G蛋 白可W诱导产生中和抗体，也是目前商品化IHNV DNA疫苗的祀分子（IHNV DNA疫苗已于 2005年7月在加拿大获准上市）；基质蛋白M(mat;rix protein，M)是IHNV的主要结构蛋白之 一，作为主要毒力因子，可W诱导病毒感染后的细胞调亡。Alonso等将M蛋白基因与虹縛金 属硫蛋白酶基因（metallothionein，MT)的启动子(pMT)结合，构建pMT-M调亡元件，将其插 入含有IHNV G蛋白基因的DNA疫苗中，构建了"自杀性"DNA疫苗。该疫苗可W在金属离子 (例如化2+)诱导下表达M蛋白，进而诱导细胞调亡，清除了疫苗DNA。
[0004] 目前，經的DNA疫苗载体采用的是普通真核表达载体，例如pIRES-neo等，运些质粒 一般包含了在大肠杆菌中的的复制起点(ori)，抗性筛选标记(例如，氨节霉素抗性基因、新 霉素抗性基因），W及真核细胞中的启动子(例如，pCMV启动子)等结构。接种后外源基因持 续表达，可能诱导宿主自身免疫反应和免疫耐受，并且增加了疫苗DNA整合到宿主基因组的 风险。
【发明内容】
[0005] 基于此，本发明的目的之一是提供一种构建的經的调亡基因。
[0006] 实现上述目的的技术方案如下。
[0007] -种构建的經调亡基因，从5'至3'依次由經金属硫蛋白酶基因 l(MT-l)启动子、經 Caspase-8小亚基（P10)编码序列、經Caspase-8大亚基（P20)编码序列、經MT-lpolyA信号序 列组成。
[000引在其中一个实施例中，所述經的调亡基因，其碱基序列为如SEQ ID No. 19所示，或 其碱基序列为为SEQ ID No. 19的同义突变序列。
[0009]本发明的另一目的是提供一种DNA疫苗载体，该DNA疫苗载体，在經体内可W响应 Zn2+的诱导，诱导细胞调亡，进而清除疫苗载体。
[0010] 实现上述目的的技术方案如下。
[0011] -种經DNA疫苗载体，包括真核表达载体及插入在所述真核表达载体中的上述构 建的經调亡基因。
[0012] 在其中一个实施例中，所述真核表达载体为祀GFP-N1。
[0013] 本发明的另一目的是提供一种DNA疫苗载体的构建方法。
[0014] 实现上述目的的技术方案如下。
[0015] -种經DNA疫苗载体的构建方法，包括W下步骤：
[0016] (1)W經的组织DNA为模板，WSEQ ID N0.1和SEQ ID ^.2引物，克隆^-1全基因， 并构建MT-1质粒；
[0017] (2)^經的。0魁为模板，^沈9 10顯.3、569 10^.4引物，克隆化3口日36-8〔05， 并构建化spase-8质粒；
[001引 （3)^11'-1质粒、化39日36-8质粒为模板，分别^沈9 10側.1、和沈9 10側.5为引 物，克隆^-1的启动子序列；^569 10^.6和569 10^.7为引物进行扩增，克隆化39日36- 8小亚基编码序列；WSEQ ID N0.8、SEQ ID ^.9为引物进行扩增，克隆化39日3日-8大亚基编 码序列；WSEQIDN0.10、SEQIDN0.2为引物进行扩增，克隆MTpolyA信号序列；上述扩增 产物经PCR纯化后，等量加入PCR反应体系中，不加引物进行扩增，得总的扩增产物；
[0019] (4)采用SEQ ID NO. 1USEQ ID NO. 12为引物，步骤(3)中的总的扩增产物为模板， 扩增全长的融合片段；
[0020] (5)通过酶切，将纯化的步骤(4)所述的全长的融合片段插入到真核表达载体中， 构建得到經DNA疫苗载体。
[0021] 本发明的另一个目的是提供上述构建的經调亡基因或的經DNA疫苗载体应用。
[0022] 具体技术方案如下。
[0023] 上述构建的經调亡基因在制备經DNA疫苗中的应用。
[0024] 上述經DNA疫苗载体在制备經DNA疫苗中的应用。
[0025] 本发明W經的MT启动子和化spase-8(含半脫氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8)为基 础，构建诱导型调亡基因，将其插入祀GFP-N1载体构建"自杀性"DNA疫苗载体，该调亡元件 可W响应金属离子(例如化2+)等条件的诱导，表达化spase-8诱导转染细胞的调亡，W进一 步提高DNA疫苗的安全性。
【附图说明】
[0026] 图巧"自杀伴' DNA疫苗载体的构建示意图；
[0027] 图2为调亡基因构成片段的PCR扩增结果示意图，其中，M:DNA分子量标准； 启动子；2 : Caspase-8小亚基编码序列；3 : Caspase-8大亚基编码序列。4 : MT-lpolyA signal。
[002引图3为调亡基因的重叠 PCR扩增结果示意图，M:DNAmarke;r ; 1 iMT-lpromoter、 化spase-8小亚基编码序列、化spase-8大亚基编码序列、MT-lpolyA si即al的融合片段。
[0029] 图4为调亡基因的核巧酸序列。
[0030] 图5为"自杀性"载体诱导的NGF-2细胞调亡结果示意图。
[0031] 图6为载体免疫后的组织分布结果示意图，载体拷贝数值为106个宿主细胞中的检 测值。
[0032] 图7为Zn2+诱导20天后的载体拷贝数检测结果示意图，载体拷贝数值为lO6个宿主 细胞中的检测值。
[0033] 图8为化诱导20天后调亡基因的PCR扩增结果示意图，其中M:DNA分子量标准；1~ 5: Zn2+诱导的锦經;6~10:未诱导的锦經;+:阳性对照(祀GFP-N1-MTCAS8作为模板）；一:阴 性对照(dd出0作为模板）。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合【具体实施方式】和附图对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式 不限于此。
[0035] 应理解，运些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例 中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室 手册（New York:Cold Spring 化rbor Laboratoir Press, 1989)中所述的条件，或按照制 造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0036] 本发明在其中一个方面，克隆了經的金属硫蛋白酶基因1(MT-1)W及化spase-8的 完整编码序列（complete CDS),构建了诱导型调亡基因，该基因包含：經MT-1启动子、經 Caspase-8小亚基（P10)编码序列、經Caspase-8大亚基（P20)编码序列、經MT-lpolyA信号序 列。将该调亡基因插入祀GFP-N1质粒，构建了"自杀性"DNA疫苗载体。
[0037] 本发明在另一个方面，通过体内外试验证实，该"自杀性"DNA疫苗载体可W响应 Zn2+的诱导，诱导细胞调亡，进而清除疫苗载体。
[003引实施例1
[0039] 1、材料
[0040] 經基因组DNA、cDNA、细胞株
[0041 ] 經基因组DNA提取自經脑组织；采用Trizol试剂从监419毒株细胞培养物中提取 RNA，提取的RNA作为模板，参照PrimeScHp愧)lst S化and cDNA合成试剂盒说明书反转录 第一链cDNAdNGF-2细胞由本研究室保存。锦經(20g左右)购自广州市芳村花鸟鱼虫市场。
[0042]主要试剂
[004；3] PMD18-T 载体试剂盒、PrimeScript?n 1st Strand cDM 合成试剂盒、 巧TARK|GXL DNA聚合酶、Afl n内切酶购自IMaRa公司。hizol试剂购自Invihogen 公司。转染试剂Instant FECT购自广州好芝生物科技有限公司。无内毒素质粒提取试剂盒 购自天根公司。
[0044] 主要仪器
[0045] 罗氏Li曲t切cler 96巧光定量PCR仪，巧光倒置显微镜（ZEISS，Axio Observer Al)。
[0046] 2、实验方法
[0047] 2.1"自杀性"DM疫苗载体的构建思路
[004引按照"诱导启动子+调亡基因"的调亡元件构建策略，本研究W經MT-l、Caspase-8 基因为基础构建调亡基因，具体包括：經MT-1启动子+經Caspase-8小亚基编码序列+經 化spase-8大亚基编码序列+經MT-lpolyA信号序列。将构建的调亡元件插入祀GFP-N1质粒， 获得"自杀性"DM疫苗载体，构建流程见图1。
[0049] 2.2 經 MT-1 基因与 Caspase-8CDS 的克隆
[00加]W經的组织DNA为模板，根据MT-1基因序列（AF001983)设计了MT-1F(SEQ ID N0.1)、MT-1R(SEQ ID騰.2)引物（表6.1)，克隆^-1全基因。^經的。0論为模板，根据 化3口日36-8〔05序列化〔822471)设计了化38。1(569 10^.3)、(：日381?(沈9 10^.4)引物（表 6.1)，克隆 Caspase-8CDS。反应体系见表 6.2，反应程序：941：5111111(预变性）；941：3〇3,551： 303,721：2111111(35个循环）；721：5111111(总延伸）。？〇?产物纯化后与91018-1'载体连接，转化大 肠杆菌ToplO,具体操作参照PMD18-T载体说明书进行。PCR筛选阳性克隆送上海生工测序。
[0051]表r自杀性"疫苗载体构建中的引物
[0054]注:保护性碱基用斜体标出，酶切位点用下划线标出，[005日]表2 PCR反应体系（50化）
[0化2]
[0化3]
[0056:
[0057]注：引物序列见表1。
[0化引 2.3。自杀性"调亡基因的重叠 PCR扩增
[0化9]首先W2.2中构建的MT-1质粒、Caspase-8质粒为模板，分别扩增經MT-1启动子、經 Caspase-8小亚基（P10)编码序列、經Caspase-8大亚基（P20)编码序列、經MT-lpolyA信号序 列:反应体系参照表2，引物及反应程序：
[0060] MT-1F(沈Q ID N0.1)、MT-lPrR(SEQ ID ^.5)克隆脚'-1的启动子序列；]\0'?巧1(^ (沈Q ID N0.6)、LinkP10R(沈Q ID顯.7)克隆化3口日36-8小亚基。10)编码序列；1^1证？2(^ (沈Q ID N0.8)、P20R(沈Q ID顯.9)克隆0曰3口曰36-8大亚基。20)编码序列；？2011'化。（沈9 IDN0.10)、MT-lR(SEQIDN0.2)克隆MTpolyA信号序列；反应程序为采用94°C2min(预变 性）；941：3〇3,591：9〇3,721：453(35个循环）；721：2111111(总延伸）。
[0061] 上述扩增产物经PCR纯化后，等量加入50化的PCR体系中，反应体系参照表2,不加 引物及模板进行扩增，反应程序:94°C5min; 94°C30s，59°C30s，72°C2min(15个循环）。上述 扩增产物1:100稀释后取1化作为模板，采用MTAFL2F(SEQ ID N0.11)、MTAFL2R(SEQ ID NO. 12)引物（见表1)扩增融合片段全长，反应体系参照表2,反应程序:94°C2min(预变性）； 94°C30s，60°C90s，72°C90s(35 个循环）；72°C2min(总延伸）。
[0062] 2.4"自杀性"DNA疫苗载体的构建
[0063] 将Clontech公司的pEGFP-Nl与上述调亡基因采用Afin内切酶进行酶切，酶切产 物纯化后进行连接反应，将调亡基因插入祀GFP-N1构建"自杀性"DNA疫苗载体。该载体命名 为PEGFP-N1-MTCAS8,将载体转化入大肠杆菌ToplO,通过PCR筛选阳性克隆送上海生工测 序。酶切、连接、转化等操作按照常规方法。
[0064] 2.5 "自杀伴' DNA疫苗载体体外诱导清除试验
[0(?日]采用无内毒素质粒提取试剂盒制备pEGFP-Nl-MTCASS质粒，将质粒与Instant 阳CT混合后转染NGF-2细胞，同时设立祀GFP-N1对照组，具体转染步骤参照Instant阳CT转 染试剂说明书。转染后观察EGFP的表达情况，转染1周后采用150iiM ZnCb诱导处理，诱导后 巧光显微镜观察统计细胞调亡情况。
[0066] 2.6 "自杀伴' DM疫苗载体体内诱导清除试验
[0067] 采用常规碱裂解法(Sambrook，2005)制备祀GFP-N1-MTCAS8质粒，免疫20g左右的 锦經，免疫方式为臀罐后缘基部肌肉注射免疫，免疫剂量为化g/尾，免疫2周后采集5尾锦經 的觸、脑、屯、、肝、肾、肠、脾、肌肉通过文献报道的Taqman PCR方法，W葡萄糖激酶基因 (glucokinase gene)作为内参(Gilad et al，2004)，根据载体中的EGFP基因的拷贝数，分 析载体的组织分布(Rakus et al，2012);剩余锦經分为2组，一组采用50咖ZnS化诱导，另 一组作为对照组，在诱导后20天采集肌肉，提取组织DNA，通过上述real time PCR分析诱导 组与对照组锦經的祀GFP-N1-MTCAS8质粒拷贝数变化，同时采用MT-1 PrP 1 OF、MT-1R作为上 下游引物(见表1)，扩增"自杀性"载体调亡基因中的重构型化spase-8W及MT polyA信号序 列。
[006引表3化qman PCR引物及探针
[0069]
[0070] 注：引物及探针序列引自文献报道(Gilad et al，2004;Rakus et al，2012)。
[0071] 3结果与分析
[0072] 3.1调亡基因的构建
[0073] 测序证实，本研究成功克隆了 MT-1全基因与化spase-8CDS。并进一步克隆了 MT-1 的启动子、polyAf目号序列W及化spase-8的小亚基编码序列、大亚基编码序列（图2)。經中 存在两种MT基因:MT-UMT-2,其中MT-1在多种组织中对金属离子、低溫等的诱导更加敏感。 例如水体中lOmg/L的Cu2+或As2+诱导48小时后，經屯、脏MT-lmRNA水平提高了 11~12倍，MT-2 贝1J只提高了 3倍;低溫(5°C )诱导后，經肝脏MT-lmRNA水平可W提高4~6倍，MT-2则只提高了 2~3倍;高溫诱导（26°C或29°C)几乎不会影响两者的mRNA水平，低溫诱导MT-lmRNA水平提 高的现象在經脑组织中也存在。經MT-1启动子全长620bp包含4个金属调节元件(metal regulato巧element，MRE) W及APl、Spl等转录因子位点，对MT-1启动子功能进行体外研究 证实:2112+細2\加2\化2+刑2+、化 2+、(：〇2+等均可^诱导该启动子转录下游的增强型绿色巧 光蛋白巧GFP)报告基因，例如1.45mM Zn2+诱导48小时后，EGFP表达水平提高了20倍W上;除 金属离子外，该启动子还可W响应出化的诱导，1〇〇測的此〇2诱导48小时后，EGFP表达水平提 高7.9倍。
[0074] 3.2 "自杀性"DNA疫苗载体的构建
[0075] 将經MT-1启动子、經Caspase-8小亚基（P10)编码序列、經Caspase-8大亚基（P20) 编码序列、經MT-lpolyA信号序列通过重叠 PCR融合为一条1593bp的片段（图3)。测序证实， 该调亡基因通过Afl n位点成功插入祀GFP-N1载体（图4)。图中，引物结合位点用箭头标出， 引物重叠序列用阴影显示。起始密码子(ATG)，终止密码子(TAA)用粗体标出。
[0076] 3.3 "自杀伴' DNA疫苗载体的体外清除
[0077] 。自杀伴'DNA疫苗载体(祀GFP-N1-MTCAS8)转染NGF-2细胞3天后开始观察至化GFP 蛋白表达，经化诱导后，转染细胞进入编程性死亡(调亡）。诱导14天后，诱导组细胞极少观 察到巧光信号，统计诱导组与对照组的绿色巧光细胞数量发现，诱导组细胞调亡率（（1-诱 导组绿色巧光细胞数量/对照组绿色巧光细胞数量）X 100% )为78.6%。
[007引3.4 "自杀伴' DNA疫苗载体的体内清除
[00巧]。自杀性"DNA疫苗载体(PEGFP-N1-MTCAS8)免疫锦經后主要分布于肌肉、屯、脏、脾 脏等组织（图6)。免疫1周后，免疫部位(尾柄)肌肉中的载体拷贝数(每106个宿主细胞)在 5.6 X105左右，其他组织器官中的拷贝数则低于5 X103,载体主要分布于免疫部位的肌肉 中，并且主要集中在免疫部位，预实验表明，其他部位肌肉，如背罐前端基部肌肉中的载体 浓度也较低。为确保检测结果的准确性，本发明在采集尾柄肌肉时，选取了臀罐后缘基部与 尾罐基部之间，测线之上的锦經体侧(一侧）的全部肌肉，匀浆后选取1 OOmg提取DNA，Taqman PCR显示，经Zn2+诱导后肌肉中的载体拷贝数显著降低(P<0.05)(图7)。由于legman PCR中扩 增的载体目的片段长度为177bp，载体降解的碎片中也可能扩增到该片段，因此本研究采用 MT-1P巧10F、MT-1R扩增祀GFP-N1-MTCAS8中一段较长的片段（996bp)，该片段是Caspase-8 和MT基因的融合片段，避免了PCR中經基因组DNA上述两个基因的干扰。扩增结果表明，诱导 20天后，载体明显降解(图8)。
[0080] W上所述实施例的各技术特征可W进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实 施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要运些技术特征的组合不存 在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0081] W上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并 不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于本发明的保护 范围。因此，本发明专利的保护范围应W所附权利要求为准。
【主权项】
1. 一种构建的鲤凋亡基因，其特征在于，从5'至3'依次由鲤金属硫蛋白酶基因1启动 子、鲤Caspase-8小亚基编码序列、鲤Caspase-8大亚基编码序列、鲤MT-1 polyA信号序列组 成。2. 根据权利要求1所述鲤凋亡基因，其特征在于，其碱基序列为如SEQ ID No. 19所示， 或其碱基序列为为SEQ ID No. 19的同义突变序列。3. -种鲤DNA疫苗载体，其特征在于，包括真核表达载体及插入在所述真核表达载体中 的权利要求1或2所述的鲤凋亡基因。4. 根据权利要求3所述的鲤DNA疫苗载体，其特征在于，所述真核表达载体为pEGFP-Nl。5. 鲤DNA疫苗载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 以鲤的组织DNA为模板，以SEQ ID N0.1和SEQ ID如.2引物，克隆阶-1全基因，并构 建MT-1质粒； (2) 以鲤的cDNA为模板，以SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4引物，克隆Caspase-8 CDS，并构 建 Caspase-8 质粒； (3) 以MT-1质粒、Caspase-8质粒为模板，分别以SEQ ID NO. 1、和SEQ ID NO.5为引物， 克隆MT-1的启动子序列；以SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7为引物进行扩增，克隆Caspase-8小 亚基编码序列；以SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9为引物进行扩增，克隆Caspase-8大亚基编码 序列；以SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO.2为引物进行扩增，克隆MT polyA信号序列；上述扩增产 物经PCR纯化后，等量加入PCR反应体系中，不加引物进行扩增，得总的扩增产物； (4) 采用SEQ ID NO. 11、SEQ ID NO. 12为引物，步骤(3)中的总的扩增产物为模板，扩增 全长的融合片段； (5) 通过酶切，将纯化的步骤(4)所述的全长的融合片段插入到真核表达载体中，构建 得到鲤DNA疫苗载体。6. 根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述真核表达载体为pEGFP-Nl。7. 权利要求1或2所述的鲤凋亡基因在制备鲤DNA疫苗中的应用。8. 权利要求3或4所述鲤的DNA疫苗载体在制备鲤DNA疫苗中的应用。9. 一种鲤DNA疫苗，其特征在于，其活性成分包括有权利要求1或2所述的鲤凋亡基因， 或其活性成分包括有权利要求3或4所述鲤的DNA疫苗载体。
【文档编号】C12N15/63GK106047911SQ201610370499
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】刘振兴, 柯浩, 郝乐, 马江耀, 马艳平, 梁志凌
【申请人】广东省农业科学院动物卫生研究所